미토 콘 드리 아 리보솜 그들의 세균 및 세포질에서 갈라 전문 있다. 여기 우리가 어떻게 mitoribosomes HEK 세포에서 그들의 기본 구획에서 얻어질 수 있다 보여줍니다. 방법은 정지 세포에서 미토 콘 드리 아의 절연 및 mitoribosomes의 결과 정화를 포함 한다.
인간의 미토 콘 드리 아 리보솜 (mitoribosomes)는 미토 콘 드리 아 게놈에 의해 산화 인 산화 복합물의 13 필수 단백질 구성 요소를 변환 하는 전용된 세트를 소유한 다. 모든 단백질 합성 인간 mitoribosomes에 의해 완전 한 막 단백질 이기 때문에, 인간 mitoribosomes 번역 중 미토 콘 드리 아 내 막에 닿는. Cytosolic 리보솜에 비해는 mitoribosome 55S, 절반 rRNA 콘텐츠, 아니 5S rRNA 및 36 추가 단백질의 침전 계수가 있다. 따라서, 더 높은 단백질 대 RNA 비율이 비정형 구조 확인 인간의 mitoribosome 그것의 cytosolic 대응에서 실질적으로 별개.
생활에 mitoribosome의 중앙 중요성에도 불구 하 고 아무 프로토콜 인간 세포에서 그대로 복잡 한 정화를 사용할 수 없었습니다. 전통적으로, mitoribosomes 킬로그램을 요구 하는 미토 콘 드리 아-풍부한 동물의 조직에서 고립 되었다 시작 물자의. 우리는 나누어 HEK293 파생 된 인간 세포 영양이 풍부한 식 중간에 성장에서 미토 콘 드리 아 활성 미토 콘 드 리아 번역 했 고, 따라서, 재료의 구조 및 생 화 확 적인 연구의 적당 한 원천이 될 수 있는 권유 mitoribosome입니다. 그것의 구조를 조사, 우리는 HEK 세포에서 그대로 mitoribosomes의 대규모 정화에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 여기, 우리는 빠른 노동 집약 하 고 보다 효율적인 방법 대안을 전통적인 기계적 전단 기반 세포 세포의 용 해에 대 한 더 적은 질소 현상 방법 소개. 이 그대로 인간 mitoribosome 및 그것의 어셈블리 중간체의 구성을 드러내는 높은 해상도 구조 결정에 대 한 허용 하는 mitoribosome의 준비에서 결과. 여기, 우리가이 작품에 따라 제시 된 최적화 된 고만 ~ 1010 필요로 더 많은 비용 효율적인 방법을 HEK 세포 배양. 인간 mitoribosomal 번역 단지, 돌연변이, 품질 관리 어셈블리 및 mitoribosomal 소 단위 중간체를 정화 하는 메서드를 사용할 수 있습니다. 정화 확장할 수 있습니다 선형 10 배로 필요, 그리고 또한 다른 종류의 세포에 적용 하는 경우.
미토 콘 드리 아 단백질 합성 과정 13 필수 mt-mRNAs 호흡 사슬의 촉매 코어를 전문된 막 연결 된 mitoribosome에 의해 번역을 기반으로 합니다. 변경 된 미토 콘 드리 아 유전자와 단백질 co-translationally 막으로 삽입을 위한 필요는 실질적으로 미토 콘 드리 아 리보솜1의 건축을 형성 했습니다. 최근 고해상도 구조 포유류 mitoribosome의 세균 대응2,3기 막히게 다른 전반적인 모습을 보였다. 특히, 적어도 36 특정 미토 콘 드리 아 단백질 추가 됩니다, ~ 1 MDa 여분의 분자 질량, mt rRNA 두 가지에 의해 감소 하 고 갈라 지는 것이 매우 기여. 구조상 재배열 일반적으로 보편적으로 되도록 보존4허용 이전 했다 거의 모든 중요 한 함수형 기능을 변경 합니다.
새로운 주 요소 mitoribosomal subunits의 각 하나에 의해 획득, 예를 들어 작은 소 단위는 ‘머리’ 지역에는 본질적인 GTPase 단백질 mS29를 통합 했다. 다른 번역 시스템에서 발견 되지 않은 GTPase 활동 그리고 구조는 GTPase 소 단위 어셈블리2에 역할을 할 수도 있습니다을 나타냅니다. 중앙 융기의 핵심을 형성 5S rRNA는 모든 알려진된 ribosomal 큰 소 단위의 획기적인 것으로 포유류 mitoribosome에서 누락 이며 채택 했다 mt tRNA 발 필수 빌딩 블록으로 대신2. 금지와 동료 것으로 나타났다 돼지 mitoribosome mt-tRNA-페 발5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk, 및 동료 이러한 데이터에 철저히 구명 하 고는 손상 된 mt tRNA 발 안정성을 가진 환자에서 mitoribosomes 수용할 수 있는 원리에서 mt-tRNA-페6,7발견. 이러한 특정 요소와 어떤 경로 트랜스는 mitoribosomes 통합 하는 이유-이 독특한 어셈블리 남아 알 수 없는 요소는 필요.
전반적으로, 인간 mitoribosome, 새로운 단백질 구성 요소 및 구조 요소로 mt-tRNA의 독특한 협회의 높은 복합성으로-아직-알 수 없는 미토 콘 드리 아 전용 트랜스-요인의 개입을 의미. 그러나,이 시스템의 특징의 대부분은 전통적으로8조사 곤란 했던, 미토 콘 드리 아에 고유한 때문에 작은 분자 및 품질 관리 메커니즘에 대 한 알려져 있다. 전자 cryo-현미경 (cryo-EM)20고해상도 단일 입자 분석 개발 기회 지금 발생 종합적으로 기본 어셈블리, 행동 및 품질 관리는 인간의 분자 메커니즘 연구 mitoribosome입니다. 중간 인간 mitoribosome 어셈블리의 첫 번째 구조의 우리의 보고서 인식을 인간의 mitoribosome를 형성 하는 방법을 시각화 하 고 그 곳을 알아내는-그들은 새로운 trans-의 식별에 표시를 제공 합니다. 임시 어셈블리9요인.
이 초기 노력을 확장 하려면 자세히 인간 mitoribosome 정화에 대 한 빠른 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 첫 번째 부분에서 현 탁 액 셀에서 높은 순수 그대로 미토 콘 드리 아의 대규모 격리를 설명 합니다. 이 절차 9 h를 요구 하 고 쉽게 수정 고 다른 세포 유형 및 비늘에 적응. 이 프로토콜에서 중요 한 단계는 셀 깨를 질소 현상의 사용 이다. 프로토콜의 두 번째 부분 정화 mitoribosomes 개발 되었다. 이 절차 7 h 필요 하 고 충분 한 양의 생화학 및 구조 연구에 대 한 mitoribosomes 생성 합니다. 사용 하 여 순수한 미토 콘 드리 아의 시작 물자 높은-품질 최종 준비를 제공 하 고 다른 미토 콘 드 리아 고분자에 추정 될 수 있다.
하지만 미토 콘 드리 아의 풍부한 원천이 될 것으로 알려진 동물의 조직의 비교적 쉬운 가용성은 그것에 게 mitoribosomes3,5,12,에 대 한 인기 있는 선택 시작 물자의 소스에 대해서 13, 유전자 수정 및 여 실험실에서 쉽게 복제 수 없습니다. 따라서, 균질로 경작 된 인간 세포 라인을 포함 하는 프로토콜 개발에 대 한 명확한 실용적인 필요가 하다. 주요 차이점 프로토콜 간의 조직 및 배양된 세포 세포의 용 해 및 균질의 모드입니다. 배양된 세포를 단층으로 성장에 대 한 일반적인 메서드는 테 플 론/유리 dounce 균질14입니다. 원래 준비 프로토콜 동안 효율적인 작은 비늘15개발 되었다. 그러나 500 mL의 수 용량을 가진 균질 화기를 채용을 직접 확장 가능한11,, 그것은 ~ 2 h 80% 세포를 달성 하기 위해 육체 노동의 필요 합니다. 이 3 개 이상 문제 도입: 긴 대기 시간으로 인해 세포, 큰 그릇의 바닥에 침 몰 하는 무거운 소재 인 비 균질 세포의 여러 획의 필요성 때문에 샘플의 난방. 따라서, 세포의 바람직 방법에서 가압된 용기16,17감압에 따라 질소 현상을 활용 합니다. 이 방법에서는, 세포는 세포를 부드럽게 하 고 그들을 세포에 더 취약 하 게 추운 방에 먼저 부 어. 그들은 질소 현상 장치에 배치 됩니다 자당과 마 니 톨을 포함 하는 버퍼 미토 콘 드리 아를 그대로 유지 하는 데 도움이 됩니다 삼투성 압력을 유지 하기 위해 추가 됩니다. 질소 공동 현상은 장치 다음 셀에 녹이 고는 산소가 없는 질소의 큰 볼륨으로 압력. 압력은 세포 막의 파열 결과로 솔루션에서 나온된 질소 거품. 이 방법은 다음과 같이 전단 응력과 마찰과 관련 된 기계적 균질 화 방법에 비해 몇 가지 장점이: 1) 셀에 외부 물리적 스트레스를 피할 수 있다; 2) 단 열 확장 하는 샘플을 냉각, 열 손상 세포; 3) 셀 구성 요소; 불활성 질소 가스에 의해 산화에서 보호 된다 4) pH 변경 중단 매체; 5) 과정은 균일 하 고 재현성 같은 파괴적인 세력 각 셀 내 고 샘플;에 걸쳐 적용 되기 때문에 6) 과정 빨리이 고 20-30 분 이내 완료 될 수 있다.
경작된 한 세포와 조직에서 미토 콘 드리 아의 절연 문학에서 광대 하 게, 설명 하고있다 그리고 그것은 부드러운 세포 파쇄 차동 centrifugations의 시리즈 뒤에 기반. 현재 사용된 중인 프로토콜의 대부분18세기 한가운데에 개발 된 원래 절차를 따릅니다. 기본적인 생 화 확 적인 접근은 정확한, 문학에서 강조 하 고 들 키 지 않고 남아 있는 몇 가지 오해가 있습니다. Mitoribosomes에 대 한 프로토콜을 최적화 하려면 우리가 체계적으로 조사 보고 된 일반 원칙 및 결론: 1)의 Mg2 + 포함 및 K+ 버퍼에 중요 하지 않습니다. 그러나 그것은 세포질 단백질 젤19,, 형성에서 방지 하기 위해 KCl 도움이 우리의 프로토콜에 설명 된 대로 충분 한 희석이이 현상이 발생 하지 않습니다 제공 주장 하고있다. 배제 Mg2 + 세포질 리보솜20; 오염 감소에 유용 또한, 2) 포 삼 투 환경에서 나온된 세포를 보호 하기 위해 중간 셀의 최대 가능한 볼륨 비율을 유지 필요가 없습니다입니다. 우리의 프로토콜에 삼 투 지원 충분히 자당 포함 된 버퍼와 미토 콘 드리 아 절연 버퍼에 포함 된 셀의 희석에 의해 제공 됩니다 (단계 2.II.5)은 대규모 준비에 세포의 효율적인 분리에 대 한 중요.
미토 콘 드리 아 절연 버퍼의 pH는 생리 적 가치, 즉 7.5, 가까이 또한 다음 mitoribosome 준비에 대 한 최적의 pH. 바인딩 에이전트 EDTA 및 EGTA 오염 이온을 킬레이트를 격리 미디어에 추가 되 고 그들은 킬레이트 무료 마그네슘과 칼슘, 각각. 그것은 EDTA의 포함14안 미토 콘 드리 아 막 손상으로 이어질 수 있습니다, 따라서 농도 조치로 1 mM로 제한 됩니다 논의 되었습니다. 우리 하지 자당 농도 기온 변화도의 마지막 정화 단계에서 5 mM EDTA를 사용 하 여 때 어떤 차이 관찰 했습니다.
설명 하는 프로토콜은 여기는 mitoribosome의 정화에 대 한 HEK293S 파생 된 인간 세포를 사용 합니다. 준비의 품질 원자 해상도 화학적 및 구조적 조사를 얻은 샘플 수 있습니다. 한 인간 mitoribosomal 번역 단지, 품질 관리 어셈블리 및 mitoribosomal 소 단위 중간체 메서드를 적용할 수 있습니다. 또한, 암 세포는 OXPHOS 용량 및 인접 한 실질 조직21에 비해 상승 된 미토 콘 드리 아 단백질 번역 증폭가지고, 이후 mitoribosomes 암22설립된 약 대상입니다. 따라서, mitoribosomes의 특정 정화에 대 한 억제제의 존재에이 프로토콜을 사용 하 여 의료 응용 프로그램을 해야 합니다. 또한, mitoribosomal 돌연변이 미토 콘 드리 아 질병 유전23에 연결 되었습니다. 이 돌연변이 구조에 직접적인 영향 때문에, 여기에 제시 된 접근 그들의 구조적 특성에 대 한 유용할 것 이다. 프로토콜을 실험적으로 확장 하 고 다양 한 인간의 미토 콘 드리 아에서 번역의 근본적인 이해와 의료 중요성을 태 클 하는 과학적 질문에 적용 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 전략 연구 (미래 지도자 그랜트 FFL15:0325), 라 그 나 Söderberg 재단 (친목 의학 M44/16), 스웨덴 연구 위원회 (시작 그랜트 NT × 2015 04107), FEBS 장기 친교 (SA)에 대 한 스웨덴 재단에 의해 지원 H2020-MSCA-ITN-2016 프로젝트 721757 (대).
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |