Mitokondrier har spesialisert ribosomer som skilt fra sine bakteriell og cytoplasmatiske kolleger. Her viser vi hvordan mitoribosomes kan fås fra deres eget rom i HEK celler. Metoden innebærer isolering av mitokondrier fra suspensjon celler og påfølgende rensing av mitoribosomes.
Menneskelige mitokondrier har et eget sett med ribosomer (mitoribosomes) som oversetter 13 viktige protein komponenter av oxidative fosforylering komplekser kodet av mitokondrie genomet. Siden alle proteiner syntetisert av menneskelig mitoribosomes er integrert membran proteiner, er menneskelige mitoribosomes bundet til mitokondrie interne membran under oversetting. Sammenlignet med det cytosolic ribosomet har mitoribosome en sedimentering koeffisient 55S, halv rRNA innholdet, ingen 5S rRNA og 36 ekstra proteiner. Derfor gjør høyere protein til RNA innsats og en atypisk struktur den menneskelige mitoribosome vesentlig forskjellig fra motparten cytosolic.
Til tross for den sentrale betydningen av mitoribosome liv var ingen protokoller tilgjengelig til å rense intakt komplekset fra humane cellelinjer. Tradisjonelt mitoribosomes ble isolert fra mitokondrier-rik dyr vev som krevde kilo starter materiale. Vi tenkte at mitokondrier i dele HEK293-avledet menneskelige celler dyrket i næringsrike uttrykk medium ville ha en aktiv mitokondrie oversettelse, og derfor kan være en passende kilde av materiale for strukturelle og biokjemiske studiene i mitoribosome. For å undersøke strukturen, utviklet vi en protokoll for store rensing av intakt mitoribosomes fra HEK celler. Her introduserer vi nitrogen kavitasjon metoden idet en raskere, mindre arbeidskrevende og mer effektiv alternativ å tradisjonell mekanisk skjær-baserte metoder for cellen lysis. Dette resulterte i forberedelsene til mitoribosome som er tillatt for dens strukturelle beslutning om å høy oppløsning, avslørende sammensetningen av den intakt menneskelig mitoribosome og dens montering mellomprodukter. Her vi følge opp dette arbeidet og presentere en optimalisert og kostnadseffektiv metode krever bare ~ 1010 kultivert HEK celler. Metoden kan brukes til å rense menneskelige mitoribosomal oversette komplekser, mutanter, kvalitetskontroll samlinger og mitoribosomal underenheter intermediater. Rensingen kan lineært besteget tidoblet hvis nødvendig, og brukes også til andre typer celler.
Prosessen med mitokondrie proteinsyntese er basert på 13 viktige mt-mRNAs som er oversatt av en spesialisert membran-vedlagt mitoribosome til katalytisk kjernen av respiratoriske kjeden. Endret mitokondrie genomer og behovet for proteiner sette inn co-translationally i membranen har vesentlig formet arkitekturen av mitokondrie ribosomer1. Siste høyoppløselig strukturer av pattedyr mitoribosome viste en påfallende annerledes helhetsinntrykket bakteriell motpart2,3. Spesielt legges minst 36 mitokondrier-spesifikke proteiner, bidrar ~ 1 MDa ekstra molekylær masse, mens mt-rRNA er redusert med todelt og svært skilt. De strukturelle rearrangements endre nesten alle viktige funksjonelle egenskaper som tidligere var generelt akseptert å være universelt bevart4.
Nye hovedelementene har blitt kjøpt av hver enkelt av mitoribosomal underenheter, for eksempel små delenhet har innlemmet en iboende GTPase protein mS29 i “hodet” regionen. GTPase aktivitet har ikke blitt funnet i andre oversettelse systemer, og strukturen indikerer at GTPase kan ha en rolle i delenhet samlingen2. Den 5S rRNA som ble antatt å være et landemerke for alle kjente ribosomal store underenheter, danner kjernen i det sentrale protuberance, mangler i pattedyr mitoribosome og har vedtatt mt-tRNA-Val som en integrert byggekloss i stedet2. Forbud og kolleger viste at svin mitoribosome har mt-tRNA-Phe og ikke-Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk og kolleger fulgte om disse dataene og fant at mitoribosomes fra pasienter med nedsatt mt-tRNA-Val stabilitet i prinsippet rommer mt-tRNA-Phe6,7. Hvorfor mitoribosomes har tatt disse bestemte elementer og hva veier og trans-faktorer er nødvendig for disse unike samlinger er fortsatt ukjent.
Samlet innebærer høy kompleksiteten i den menneskelige mitoribosome, nye protein komponenter og unike foreningen av mt-tRNA som en strukturell element involvering av som-men-ukjent mitokondrier-spesifikke trans –faktorer. Men fordi mange av funksjonene i dette systemet er unikt for mitochondria, som tradisjonelt har vært vanskelig å8, er lite kjent om den molekylære og kvalitetskontroll mekanismen. Med utviklingen av høyoppløselige enkelt partikkel analyse av elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM)20oppstår muligheter nå å omfattende studere molekylære mekanismer underliggende montering, handlingen og kvalitetskontroll av menneskelige mitoribosome. Vår rapport av første menneskelige mitoribosome samlingen mellomliggende gir anerkjennelse at det er mulig å visualisere hvordan den menneskelige mitoribosome er dannet og viser at cryo-EM er medvirkende i identifisering av nye trans– fungerende montering faktorer9.
For å utvide denne innledende innsats, beskriver vi en rask protokoll for menneskelig mitoribosome rensing i detalj. En storskala isolering av svært ren intakt mitokondrier fra suspensjon celler er beskrevet i den første delen av protokollen. Denne fremgangsmåten kan krever 9 h og lett endres og tilpasses ulike celletyper og vekter. Et viktig skritt i denne protokollen er bruken av nitrogen kavitasjon bryte åpne cellene. Den andre delen av protokollen ble utviklet for å rense mitoribosomes. Denne fremgangsmåten krever 7T og gir en tilstrekkelig mengde mitoribosomes for biokjemisk og strukturelle studier. Bruk av ren mitokondrier som en utgangsmaterialet tilbyr høy kvalitet endelig preparater og kan ekstrapolert andre mitokondrie makromolekyler.
Om kilden til starter materiale, selv om relativt lett tilgjengelig dyr vev som er kjent for å være en rik kilde til mitokondriene, gjør det et populært valg for mitoribosomes3,5,12, 13, de kan ikke genetisk endret og gjengitt i laboratoriet lett. Derfor er det klart praktiske behov for å utvikle protokoller som involverer homogent kulturperler humane cellelinjer. Hovedforskjellen mellom protokollene håndtere vev og kultivert celler er lyse og homogenisering. Kultivert celler dyrket som en monolayer, er en typisk metoden Teflon/glass dounce homogenisering14. Opprinnelige forberedelse protokollene mens effektiv ble utviklet for små skjell15. En direkte skalere opp ansette en homogenizer med kapasitet på 500 mL er mulig11, men det krever ~ 2 timer med manuell arbeidskraft å oppnå 80% lysis. Dette introdusert minst tre spørsmål: samling av organeller på grunn av lang ventetid, ikke-homogene lysis på grunn av tung materialet synker til bunnen av en stor fartøy, oppvarming av prøven på grunn av nødvendigheten av flere strøk. Derfor benytter en foretrukne lysis nitrogen kavitasjon, som er basert på dekompresjon fra en trykksatt fartøyet16,17. I denne metoden er celler først svulmet på kalde rommet for å bløtgjøre cellene og gjøre dem mer utsatt for lysis. Som de er plassert i nitrogen kavitasjon enheten en buffer som inneholder sukrose og mannitol legges for å opprettholde en osmotisk trykk som vil bidra til å holde mitokondrier intakt. Nitrogen kavitasjon enheten er så trykk med store mengder oksygenfri nitrogen, som oppløses i cellene. Som trykket er utgitt nitrogen bobler av løsningen som resulterer i rupturing cellemembraner. Denne metoden gir flere fordeler over mekanisk homogenisere metoder som involverer skjær stress og friksjon som følger: 1) noen eksterne fysisk stress på cellene unngås; 2) en Adiabatisk utvidelse som kjøler prøven, sikrer ingen varmeskade organeller; 3) cellen komponenter er beskyttet mot oksidering av inert nitrogen gassen; 4) ingen pH endring av suspending medium; 5) prosessen er jevn og reproduserbar fordi de samme forstyrrende styrkene brukes i hver celle og hele prøven; 6) prosessen er rask og kan fullføres innen 20-30 min.
Isolering av mitokondrier fra kulturperler celler og vev har blitt beskrevet i litteraturen omfattende, og det er basert på en mild celle avbrudd en rekke differensial centrifugations. De fleste protokollene som brukes for øyeblikket følger de opprinnelige prosedyrene utarbeidet i midten av forrige århundre18. Selv de grunnleggende biokjemiske tilnærmingene er riktige, finnes det flere misforståelser som er merket i litteratur og Döberitz. For å optimalisere protokollen for mitoribosomes, vi systematisk undersøkt rapporterte de generelle prinsippene og konkludere med at: 1) inkludering av Mg2 + og K+ i bufferen er ikke avgjørende. Det har blitt argumentert at KCl bidrar til å hindre cytoplasmatiske proteiner dannes en gel19, men gitt en tilstrekkelig fortynning som beskrevet i våre protokollen, dette fenomenet oppstår ikke. Videre er er utelukkelsen av Mg2 + nyttig for å redusere forurensing av cytoplasmatiske ribosomer20; 2) det er ikke nødvendig å holde maksimal mulig volumkontrollen celleområde til middels å beskytte utgitt organeller fra hypo-osmotisk miljøet. Osmotisk støtte i våre protokollen er tilstrekkelig levert av sukrose inneholder buffere og fortynning av celler med mitokondrier isolasjon buffer (trinn 2.II.5) er avgjørende for effektiv separasjon av organeller i en storstilt forberedelse.
PH i mitokondrier isolasjon bufferen er nær fysiologiske verdier, dvs 7.5, som er også optimal pH for følgende mitoribosome utarbeidelse. Bindende agenter EDTA og EGTA legges til isolasjon media til chelate forurensende ioner, og de chelate gratis magnesium og kalsium, henholdsvis. Det har vært diskutert at inkludering av EDTA kan føre til skade av det indre mitokondrie membran14, derfor konsentrasjonen er begrenset til 1 mM som en forholdsregel. Vi har ikke observert noen forskjell når du bruker 5 mM EDTA i siste rensing trinn sukrose tetthet graderingen.
Protokollen beskrevet bruker her HEK293S-avledet menneskelige celler for rensing av mitoribosome. Kvaliteten av preparatet kan fått prøven undersøkes biokjemisk og strukturelt å Atom løsning. Dette gjør det mulig å bruke metoden menneskelige mitoribosomal oversette komplekser, kvalitetskontroll samlinger og mitoribosomal underenheter intermediater. Videre siden kreftceller har forsterket OXPHOS kapasitet og forhøyet mitokondrie protein oversettelsen sammenlignet med tilstøtende stromal vev21, er mitoribosomes etablert narkotika mål for kreft22. Derfor vil bruker denne protokollen for spesifikke rensing av mitoribosomes i nærvær av hemmere ha medisinske anvendelser. Også har mitoribosomal mutasjoner vært knyttet til arvelige mitokondrie sykdommer23. Siden disse mutasjonene har direkte virkninger på strukturen, vil tilnærming presenteres her være nyttig for deres strukturelle karakterisering. Protokollen kan eksperimentelt utvidet og brukes til en rekke vitenskapelige spørsmål takle den grunnleggende forståelsen av oversettelse i menneskelig mitokondrier og dens medisinsk betydning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av den svenske stiftelsen for strategisk forskning (fremtidige ledere Grant FFL15:0325), Ragnar Söderberg Foundation (Fellowship i medisin M44/16), svensk Research Council (starter Grant NT × 2015-04107), FEBS langsiktig fellesskap (SA) , H2020-MSCA-ITN-2016 prosjektet 721757 (VS).
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |