Mitokondrierna har specialiserade ribosomer som avvek från bakteriell och cytoplasmiska motsvarigheterna. Här visar vi hur mitoribosomes kan erhållas från deras infödda fack i HEK celler. Metoden innebär isolering av mitokondrier från suspension celler och påföljande rening av mitoribosomes.
Mänskliga mitokondrierna besitter en särskild uppsättning ribosomer (mitoribosomes) som översätter 13 väsentliga proteinkomponenter av oxidativ fosforylering komplex kodas av mitokondriella genomet. Eftersom alla proteiner syntetiseras av mänskliga mitoribosomes är integrerad membranproteiner, är mänskliga mitoribosomes bundna till det mitokondriella inre membranet under översättning. Mitoribosome jämfört cytosoliska Ribosomen och har en sedimentation koefficient 55S, halv rRNA innehållet, ingen 5S rRNA och 36 ytterligare proteiner. Därför gör högre protein-till-RNA förhållande och en atypisk struktur den mänskliga mitoribosome väsentligen skiljer sig från dess cytosoliska motsvarighet.
Trots den centrala betydelsen av mitoribosome till liv fanns inga protokoll att rena det intakt komplexet från mänskliga cellinjer. Traditionellt mitoribosomes isolerades från mitokondrier-rika djurvävnader som krävs kg av utgångsmaterial. Vi resonerade att mitokondrier i dela HEK293-härledda mänskliga celler odlas i näringsrika uttryck medium skulle ha en aktiv mitokondriell översättning, och, därför kunde vara en lämplig källa till material för de strukturella och biokemiska studierna av mitoribosome. För att undersöka dess struktur, utvecklade vi ett protokoll för storskalig rening av intakt mitoribosomes från HEK celler. Häri, introducerar vi kväve kavitation metod som ett snabbare, mindre arbetsintensiva och effektivare alternativ till traditionella mekaniska skjuvning-baserade metoder för cellys. Detta resulterade i förberedelserna av de mitoribosome som möjliggjorde dess strukturella beslutsamhet att hög upplösning, avslöjar den intakt mänskliga mitoribosome och dess montering intermediärer sammansättning. Här, vi följa upp detta arbete och presentera en optimerad och mer kostnadseffektiv metod som kräver endast ~ 1010 odlade HEK celler. Metoden kan användas för att rena mänskliga mitoribosomal översätta komplex, mutanter, kvalitetskontroll sammansättningar och mitoribosomal subenheter intermediärer. Rening kan vara linjärt skalas upp tio gånger om det behövs, och också tillämpas på andra typer av celler.
Processen för fungerande mitokondriell proteintillverkning bygger på 13 väsentliga mt-mRNA som översätts av en specialiserad membran-anslutna mitoribosome bildar katalytiska kärnan i luftvägarna kedjan. De förändrade mitokondriella genomet och behovet av proteinerna att infoga co-translationally i membranet har väsentligen formade arkitekturen av den mitokondriella ribosomer1. Senaste högupplösta strukturer av de däggdjur mitoribosome visade en påfallande olika övergripande utseende till bakteriell motsvarighet2,3. Särskilt, läggs minst 36 mitokondrierna-specifika proteiner, bidrar ~ 1 MDa extra molekylärt samlas, medan mt-rRNA är minskat med dubbla och mycket avvek. De strukturella rearrangements ändra nästan alla kritiska funktioner som var tidigare allmänt accepterat att vara universellt bevarad4.
Nya huvudsakliga element har förvärvats av var och en av mitoribosomal subunitsna, exempelvis den små subuniten har införlivat en inneboende GTPase protein mS29 i dess ‘huvud’ region. GTPase verksamhet har inte hittats i andra översättningssystem och struktur indikerar att GTPase kan ha en roll i subenhet montering2. Den 5S-rRNA som ansågs vara en landmark av alla kända ribosomal stora subenheter, som utgör kärnan av centrala förhöjning, saknas i de däggdjur mitoribosome och har antagit mt-tRNA-Val som en viktig byggsten i stället2. Förbud och kollegor visade att de svin mitoribosome har mt-tRNA-Phe och inte – Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk och kollegor följde upp dessa data och hittade att mitoribosomes från patienter med nedsatt mt-tRNA-Val stabilitet i princip rymmer mt-tRNA-Phe6,7. Varför mitoribosomes har införlivat dessa specifika element och vilka vägar och trans-faktorer krävs för dessa unika sammansättningar förbli okänd.
Sammantaget innebär höga komplexiteten i den mänskliga mitoribosome, nya proteinkomponenter och unika föreningen av den mt-tRNAen som ett strukturelement medverkan av som-ännu-unknown mitokondrierna-specifik trans –faktorer. Men eftersom många av funktionerna i detta system är unikt för mitokondrierna, som traditionellt har varit svårt att undersöka8, är lite känt om mekanismen för molekylär och kvalitetskontroll. Med utvecklingen av högupplösta enda Partikelanalys av electron cryo-mikroskopi (cryo-EM)20uppstår möjligheter nu utförligt studera de molekylära mekanismer bakom församlingen, action och kvalitetskontroll av människan mitoribosome. Vår rapport om den mänskliga mitoribosome församlingen mellanliggande första struktur ger ett erkännande att det är möjligt att visualisera hur den mänskliga mitoribosome bildas och visar att cryo-EM är avgörande för identifiering av nya trans– tillförordnad församlingen faktorer9.
För att expandera på detta inledande arbete, beskriver vi en snabb protokoll för mänskliga mitoribosome rening i detalj. I den första delen av protokollet beskrivs en storskalig isolering av högt rent intakt mitokondrier från suspension celler. Detta förfarande kan kräver 9 h och ändras enkelt och anpassat till olika celltyper och skalor. Ett viktigt steg i detta protokoll är användningen av kväve kavitation att bryta öppna cellerna. Den andra delen av protokollet utvecklades för att rena mitoribosomes. Detta förfarande kräver 7 h och ger en tillräcklig mängd mitoribosomes för biokemiska och strukturella studier. Användning av ren mitokondrier som utgångsmaterial erbjuder högkvalitativa sista förberedelserna och kan extrapoleras till andra mitokondriella makromolekyler.
När det gäller källan till utgångsmaterial, även om relativt lätt tillgängligheten av djurvävnader som är kända för att vara en rik källa av mitokondrier, gör det ett populärt val för mitoribosomes3,5,12, 13, de kan inte vara genetiskt modifierade och reproduceras i labbet enkelt. Därför finns det ett klart praktiskt behov för att utveckla protokoll som omfattar homogeneously odlade mänskliga cellinjer. Den stora skillnaden mellan protokoll som behandlar vävnader och odlade celler är funktionsläget av Lys och homogenisering. För odlade celler odlas som en enskiktslager, är en typisk metod Teflon/glas dounce homogenisering14. De ursprungliga beredning protokoll medan effektiv utvecklades för små fjäll15. En direkt skala upp anställa en Homogenisatorer med 500 mL kapacitet är möjligt11, men det kräver ~ 2 h av manuellt arbete att uppnå 80% lysis. Detta introducerade minst tre frågor: aggregering av organeller på grund av långa väntetider, inhomogen Lys på grund av tunga materialet sjunka till botten av ett stort fartyg, uppvärmning av provet på grund av nödvändigheten av flera penndrag. Därför utnyttjar en föredra metoden med Lys kväve kavitation, vilket är baserat på dekompression från en trycksatt fartyget16,17. Den här metoden är celler först svällde i kylrummet för att mjuka upp cellerna och göra dem mer mottagliga för Lys. Som de är placerade i enhetens kväve kavitation läggs en buffert som innehåller sackaros och mannitol för att bibehålla en osmotiska trycket som kommer att hålla mitokondrier intakt. Kväve kavitation enheten trycksätts sedan med en stor volym av syrefri kväve, som upplöses i cellerna. Eftersom trycket är släppta kväve bubblorna ur lösning vilket resulterar i spricker av cellmembranen. Denna metod erbjuder flera fördelar jämfört med mekaniska homogeniserande metoder som involverar skjuvspänningar och friktion enligt följande: 1) externa fysiska stress på cellerna undviks. (2) en adiabatisk expansion som kyler provet, garanterar inga värmeskador organeller; (3) cell komponenter skyddas från oxidation av inert kväve gas; (4) ingen pH förändring av uppskjutande medium; (5) processen är enhetliga och reproducerbara eftersom samma störande krafter används inom varje cell och hela provet; (6) processen är snabb och kan slutföras inom 20-30 min.
Isolering av mitokondrier från odlade celler och vävnader har beskrivits i litteraturen omfattande, och den är baserad på en mild cell störningar följt av en serie av differential centrifugations. De flesta av protokoll som används för närvarande följer de ursprungliga förfaranden som utvecklats i mitten av förra seklet18. Medan de grundläggande biokemiska metoderna är rätt, finns det flera missuppfattningar som är belyst i litteraturen och förblev oupptäckt. För att optimera protokollet för mitoribosomes, vi systematiskt undersökt rapporterade allmänna principer och dra slutsatsen att: 1) införandet av Mg2 + och K+ i bufferten är inte avgörande. Det har hävdats att den KCl bidrar till att förhindra cytoplasmatiska proteiner bildas en gel19, dock ges en tillräcklig utspädning som beskrivs i våra protokoll, detta fenomen uppstår inte. Dessutom är uteslutande av Mg2 + användbart för att minska föroreningar av cytoplasmisk ribosomer20; (2) det finns ingen anledning att hålla maximal möjlig volymförhållandet av celler till medium för att skydda de släppta organeller från hypo-osmotiska miljön. Osmotisk stöd i vårt protokoll tillhandahålls tillräckligt av sackaros som innehåller buffertar och utspädning av celler med mitokondrier isolering buffert (steg 2.II.5) är avgörande för effektiv separation av organeller i en storskalig beredning.
Mitokondrier isolering buffert pH ligger nära fysiologiska värden, dvs 7.5, som är också den optimala pH för följande mitoribosome beredning. Bindemedel EDTA och EGTA läggs till isolering media till kelat kontaminerande joner, och de kelat gratis magnesium och kalcium, respektive. Det har diskuterats att införandet av EDTA kan leda till skador på de inre mitokondriella membran14, därför koncentrationen är begränsad till 1 mM som en försiktighetsåtgärd. Vi har inte observerat någon skillnad när du använder 5 mM EDTA i steget slutliga rening av sackaros täthetlutning.
Protokollet beskrivs använder häri HEK293S-härledda mänskliga celler för rening av mitoribosome. Kvaliteten på förberedelserna tillåter det erhållna provet undersökas biokemiskt och strukturellt till atomär upplösning. Detta gör att man kan använda metoden på mänskliga mitoribosomal översätta komplex, kvalitetskontroll sammanställningar och mitoribosomal subenheter intermediärer. Dessutom, eftersom cancerceller har förstärkt OXPHOS kapacitet och förhöjda mitokondriell protein översättning jämfört med intilliggande stromal vävnad21, mitoribosomes är etablerade målmolekyler för cancer22. Använder det här protokollet för specifika rening av mitoribosomes i närvaro av hämmare har därför medicinska tillämpningar. Mitoribosomal mutationer har också kopplats till ärftliga mitokondriella sjukdomar23. Eftersom dessa mutationer har direkta effekter på strukturen, kommer att den strategi som presenteras här vara användbart för deras strukturella karakterisering. Protokollet kan experimentellt utvidgas och användas till en mängd vetenskapliga frågor att ta itu med den grundläggande förståelsen av översättning i mänskliga mitokondrier och dess medicinska betydelse.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick stöd av Stiftelsen för strategisk forskning (framtiden ledare Grant FFL15:0325), Ragnar Söderbergs stiftelse (Fellowship i medicin M44/16), Vetenskapsrådet (Starting Grant NT × 2015-04107), FEBS långsiktiga Fellowship (SA) , H2020-behöriga myndigheters-ITN-2016 projektet 721757 (VS).
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) high glucose, GLUTAMAX supplement, pyruvate | Thermo Scientific | 31966-021 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 16000-044 | |
Blasticidin S HCl | Thermo Scientific | R210-01 | |
Zeocin selection reagent | Thermo Scientific | R25001 | 100 mg/ml |
Freestyle 293 Expression medium | Thermo Scientific | 12338026 | |
T175 tissue culture flask with vented cap | Sarstedt | 83.3912.002 | |
Shaker flasks with vented cap | Thermo Scientific | 4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800 | |
250 ml conical bottle tubes, sterile | Corning | 430776 | |
Eve automated cell counter | NanoEnTek | E1000 | |
Nitrogen cavitation cell disruption vessel | Parr Instruments | 4635, 4639 | safety volume: 40ml, 600ml respectively |
Dnase (RNA-free) | HT Biotechnology | N401a | |
Teflon/glass dounce homogenizers | Cambridge Glassblowing Limited | Size designed upon request | |
SW40 tubes for mitochondria gradient | Beckman | 344060 | Polypropylene, thin wall |
Transfer pipettes | Sarstedt | 86.1171 | |
TLA 120.2 tubes for cushion | Beckman | 343778 | Polycarbonate, thick wall |
TLS-55 tubes for gradient | Beckman | 347356 | Ultra-clear |
Gradient Station IP | BioComp | 153-002 |