نقدم هنا بروتوكولا لرصد الجمعية والتفكيك من توكسين الأنثراكس باستخدام قياس التداخل بيولايير (BLI). بعد التجميع/التفكيك على سطح بيوسينسور، تصدر مجمعات البروتين الكبيرة من على سطح الأرض للتصور وتحديد مكونات المجمعات باستخدام المجهر الإلكتروني والطيف الكتلي، على التوالي.
البروتينات المجراة، غالباً ما تكون جزءا من المجمعات الجزيئات الكبيرة حيث خصوصية ملزم وديناميات تفرض في نهاية المطاف النواتج الفنية. في هذا العمل، هو توكسين الأنثراكس اندوسومال قبل تجميعها وانتقلت إلى اندوسومال المعقدة. أولاً، المجال الطرفي ن معامل الفتاكة متحولة سيستين (LFN) مرفق بيوسينسور قياس التداخل (BLI) بيولايير عن طريق ثنائي كبريتيد اقتران في توجه أمثل، مما يتيح بربري مستضد واقية (السلطة الفلسطينية) لربط (كد 1 نانومتر). ثم يربط التوجه على النحو الأمثل LFN-PAبريبوري المعقدة القابلة للذوبان الشعرية morphogenic جين-2 (CMG2) الخلية السطحية مستقبلات (170 كد م)، مما أسفر عن مجمع اندوسومال قبل الجمرة الخبيثة ممثل، مستقر في درجة الحموضة 7.5. هذا المجمع تجميعها ثم يتعرض لممثل الحموضة (pH 5.0) البيئة دخلول الراحل إلى انتقال السلطة الفلسطينيةبربري إلى الدولة مسام الغشاء إدراجها. وينتج هذه الدولةالمسام السلطة الفلسطينية ضعف ربط بين مستقبلات CMG2 و LFN-السلطة الفلسطينية فيالمسام وتفكك كبير من CMG2 من المسام الانتقال. يتم عكس الايثير-إلحاق LFن على سطح بيوسينسور بسهولة من ديثيوثريتول. الحد على سطح biosensor BLI النشرات LFN-PAبربري-مجمع الثلاثي CMG2 أو الحمض انتقلت مجمعاتالمسام LFN-السلطة الفلسطينية إلى وحدات تخزين ميكروليتير. ثم تصور مجمعات المفرج عنهم والتعرف باستخدام المجهر الإلكتروني والطيف الكتلي. هذه التجارب لشرح كيفية رصد حركية التجميع/التفكيك مجمعات البروتين محددة باستخدام منهجيات BLI خالية من التسمية وتقييم الهيكل وتجميعها هوية BLI هذه المجمعات بالميكروسكوب الإلكتروني والإعلام قياس الطيف الكتلي، على التوالي، باستخدام إجراءات سهلة لتكرار متسلسلة.
تحديد وفهم خصوصية الإدارة البروتين الجمعية المعقدة في فيفو الاهتمام الشديد للباحثين البيوكيميائية. التجميعات البروتين غير متجانسة كبيرة هي القاعدة وليس الاستثناء. هذا المفهوم معتمد بواسطة الرصد الطيفي للجمعية في فيفو ، عزل مجمعات استخدام تقنيات تعطيل الخلية الطف وتقييم المنتجات من أساليب تنقية المستندة إلى تقارب، وتصور لهم استخدام دقة عالية المجهر الإلكتروني المبردة (cryo-م). فهم التحكم في خصوصية الجمعية داخل الخلية، يجب أن الباحثين بشكل روتيني عزل وتحديد وتميز هذه الهياكل من تجميع أو تفكيك دينامية في نهاية المطاف. الأداة الجزيئية الأكثر استخداماً لتحديد العناصر المكونة لهذه الجمعيات وكثيراً ما يتطلب المستندة إلى جسم إيمونوبريسيبيتيشن، الذي يعتمد على الحفاظ على استقرار معقدة أثناء تعطيل الخلية. ووضعت مختلف التقنيات التحليلية إلى جانب مؤخرا لالتقاط المجمعات من عينات الخلايا باستخدام موائع جزيئية على أساس النهج، مثل الرنين السطحية مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة). بعد إزالة من الأسطح موارد البرنامج الخاصة، تم تحليل هذه العينات بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين وقت الرحلة (استخدام-TOF)1،2. النهوض بهذه المنهجية باستخدام بروتوكولات أسهل سيتيح الباحثين إلى تصور والتحقق من مجمعات المتوقعة التي تحدث في الوسط الخلوي. نظراً لموارد البرنامج الخاصة نظام قائم على ميكروفلويديكس، وكثيراً ما تنشأ المشاكل عن تشكيل التجميعية. التحايل على هذه المشكلة يتطلب تخفيف العينة، التي يمكن أن تقلل بدورها سلامة مجمعات التركيز البيولوجي مسؤولاً.
النهوض حديثة نسبيا في تكنولوجيات خالية من التسمية هو تطوير نظام قياس التداخل (BLI) بيولايير3. هذه خاصة الانعكاس الضوء على محاكاة النظم نسخ متماثل، أو أفضل، وربط موارد البرنامج الخاصة ونتائج الحركية في جزء صغير من3،تكلفة4 خاصة إذا استخدمت وحدات قناة واحدة. BLI يقيس التغيرات في أنماط التدخل الضوء المنعكس بين طبقة مرجع (المراقبة) والسطح بيولايير (تجريبية). يتم قياس التغير الناتج في المرحلة في الوقت الحقيقي ك قراءات الحركية والكمية5. السطح بيوسينسور، الذي يحتوي على التثبيت محددة كيمياء، منقولا ماديا بين الحلول، بدلاً من المخزن المؤقت تغييرات النهج موائع جزيئية في موارد البرنامج الخاصة، للقياس عن طريق الطول الموجي أو المرحلة. آثار نقل أسلحة ممنوعة بالتحريض الحل. وخلافا لموارد البرنامج الخاصة، هذه النظم مفيدة للغاية في تقييم المجمعات من العينات البيولوجية الخام. المعلمة الفعلي يقاس أثناء تجارب BLI أساسا يعتمد على إجراء تغيير في كتلة أو سمك على السطح بيوسينسور الذي ينتج من البروتين مجمع التجميع أو التفكيك.
هذه الألياف البصرية أجهزة استشعار العوامل البيولوجية سهلة الاستخدام وغير مكلفة نسبيا. أحد جوانب مفيدة الناشئة من BLI هو إزالة السطحية من مجمعات البروتين المجمعة حديثا من على سطح الأرض. تطبيق هذا الأسلوب يسمح مختبرنا الأخيرة التقيد الوقت الحقيقي حركية كبيرة مقياس الأس الهيدروجيني الناجم عن إعادة ترتيب هيكل البروتين المكون مستضد واقية (السلطة الفلسطينية) والتكسينية الجمرة الخبيثة كما بربري (السلطة الفلسطينيةبربري) انتقلت إلى ما نموذج المسامية (السلطة الفلسطينيةالمسام). تم التحقق من هذا التحول على الحافة بيوسينسور باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني (م)6. ويتجنب إزالة المجمعات من السطوح بيوسينسور أكبر حجم تخفيف آثار كثيرا ما تصادف عند الإفراج عن مجمعات من سطوح شرائح عند استخدام النظم ميكروفلويديكس.
في العمل الحالي، الجمرة الخبيثة السمية مجمعات تجميعها وتفكيكها على سطح بيوسينسور وثم أفرج عنه في مجلدات ميكروليتير. يتم التحقق من صحة المكونات المعقدة الناتجة عن استخدام أورثوجونالي م والطيف الكتلي (مللي ثانية).
يوضح هذا العرض التوضيحي كيف يمكن رصد تشكيل الجزيئات المعقدة بسهولة باستخدام قياس التداخل بيولايير، تصور استخدام EM، والتحقق منها مع مرض التصلب العصبي المتعدد، مع كل من ميكروفولوميس في فترة زمنية قصيرة. هيكلية الجمعية ومجمعات لوحظ متابعة التوقعات ذات الصلة بيولوجيا، كذلك التحقق من صحة هذه المنهجية المشتركة. كما هو مذكور في المقطع النتائج، يتطلب العنصر الرئيسي لنجاح الجمعية الطفرات سيستين هندسيا عقلانية لضمان أن الواجهات المعقدة بالبروتين البروتين تتجه بشكل صحيح بعيداً عن السطح بيوسينسور.
النظم السابقة استخدمت تقنيات BLI ومرض التصلب العصبي المتعدد لتقييم البروتين ملزمة لأنظمة المكونات اثنين وثلاثة وكذلك سلامة ملزم مستقبلات البروتين المعرب عنها، ولكن، في كلتا الحالتين، لم تتطور الأساليب الاستفادة من جنبا إلى جنب م/MS نهج8،9. وكان فقط قياس التداخل بواسطة نظام آخر يجمع بين تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد للمساعدة في وصف التفاعلات التداخلي الاستقطاب المزدوج10. ولسوء الحظ، لم يعد هذا النظام متاح للاستخدام العام. وكما ذكر في المقدمة، كانت هناك عدد من الدراسات التي أنجزت فيها تشكلت على السطوح بيوسينسور موارد البرنامج الخاصة مثل عينات وإزالتها من تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. أيا من تلك الأمثلة أدت إلى المجمعات تصور استخدام EM.
القيود المفروضة على هذا الأسلوب متتابعة يمكن أن تكون عديدة ولكن قابلة للحل. للتثبيت الأولى وذلك خطوة مؤسسة للجمعية، سيعوق الافتقار إلى المعرفة بأسطح التفاعل الهيكلية التأكيد التقدم المرتبطة برصد المراحل الأولى من الجمعية العامة. الافتقار إلى هيكل المعلومات يمكن معالجتها من خلال تصميم تصميم بناء مؤسسة حيث كيمياء مرفق (مثل سلفهيدريل moiety للروابط ثنائي كبريتيد/صاحب معلم الموضع) يمكن نقلها إلى مناطق مختلفة داخل نواة نظام الجمعية. في حالة توكسين الأنثراكس المعقدة، كان محظوظاً بأن هيكل LFن ملزمة للسلطة الفلسطينيةبريبوري هو متاح11. وكان المترجمة الرشيد موضع سيستين هندسيا إلى المناطق البعيدة عن وجه السلطة الفلسطينية ملزمةبربري . مع كيمياء سيستين الربط، فمن الأفضل أن لا سيستينيس رد الفعل أخرى موجودة على سطح البروتين.
وهناك كيمياء مرفق المختلفة التي يمكن استخدامها لمهندس موقع مرفق محدد على الأسطح للبروتين. أحد المرفقات المحددة الأكثر شعبية ينطوي على تحديد المواقع مجموعة بيوتين في مكان محدد على سطح البروتين12. ولسوء الحظ، ملزمة البيوتين إلى ستريبتافيدين أو عبدين مغلفة الأسطح ضيق للغاية. انعكاس للتفاعل الملزمة ليست بسيطة. استخدام هندسيا له-علامة في المحطة N أو ج وسهولة اللاحقة من المرفق إلى الأسطح ني-الإدارة الوطنية للسياحة تطبيق عالمي أكثر من تجميد التقارب. وبطبيعة الحال، واحدة من المحاذير للجمعية مرفق المواقع الهندسية مع نظم صاحب معلم هو اشتراط أن ن-وج-تيرميني للبروتين الجمعية الأساسية تظل مكشوف وفصل حيث أن المرفق سهل. مع جميع عمليات الجمعية، واجهة التفاعل من البروتين الجمعية الأساسية يجب أن تظل متاحة كما تقدم الجمعية المعقدة.
ربما القلق الأكثر شيوعاً لاستخدام كيمياء السطح biosensor ملزمة غير محددة. نصائح ستريبتافيدين غالباً ما تكون مصدرا لآثار كبيرة غير محددة ملزمة. ثنائي كبريتيد المرتبطة البيوتين يمكن استخدامها للإفراج عن مجمعات محددة جداً تاركين وراءهم الربط S-البيوتين تخفيض أحكام ملزمة ل أجهزة استشعار العوامل البيولوجية streptavidin المعطل تداولها13. وهناك أخرى كيمياء عكسها تصبح متاحة مثل إيمينوبوروناتيس، وإلى حد أقل كيتواميدي14. هذا الحقل حاليا المتخلفة، ولكن هناك ارتفاع الفوائد في مواصلة تطوير البروتوكولات التساهمية عكسها لتجنب آثار سمية المخدرات خارج الهدف التي تصاحب عادة استخدام المخدرات تستهدف التساهمية التنمية.
حد من استخدام EM لتصور المجمعات هو التفسير، لا سيما في الحالات حيث هياكل المجمعات المجتمعين ليست معروفة في البداية. يمكن تحديد الموقع المكاني للمكونات داخل مجمع الجزيئات مجمعة غير معرف باستخدام الأجسام المضادة (ماب) كعلامات حركية وهيكلية محددة. على سبيل المثال، حالما يتم تشكيل مجموعة معقدة، الأجسام المضادة يمكن إضافة أن ربط مكونات محددة. كثيرا ما يستخدم هذا الأسلوب في م لتحديد مكونات محددة داخل التجمعات الكبيرة15. قيد آخر مرتبط بحجم المجمع، رغم أنه كانت هناك حالات حيث حل الجمعيات متماثل تعريف صغيرة كما كاتشين 70 (جروس هيبتامير) يتم بسهولة باستخدام سلبية وصمة عار م. عادة ما تكون مجمعات المجمعة التي يتم تحليلها بواسطة EM في نطاق الحجم ~ 100 Å في القطر أو أعلاه. مؤخرا ولكن البروتينات صغيرة كاتشين 20 قد تم حلها وتم الحصول على هياكل منخفضة الدقة عند استخدام متفوقة تلطيخ منهجيات16.
لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد، ويمكن زيادة حساسية الأجهزة MS الحالية وصولاً إلى مستوى فيمتومولار (أتوموليس) في بعض الحالات زيادة حساسية الكشف BLI. وتصور الغاية أن إشارات البروتين التي تظهر ارتفاع الحد الأدنى ولكن قابل للتكرار في الاتساع سيؤدي إلى تحديد البروتين في السؤال. وباﻹضافة إلى ذلك، سبر تفاعلات البروتين البروتين مع أحد الشركاء يعلق بيوسينسور والآخر في بيئة خلوية سيؤدي إلى سارية المفعول في تنقية والكشف بعد الأسهل مجمع المنشأة حديثا. حد واحد التي قد تلاحظ مع النظم الراهنة لمرض التصلب العصبي المتعدد حساسة للغاية هي أن بروتين الفائدة قد لا تكون في قاعدة البيانات، ولكن هذه الملاحظة نادرة (مثلاً، بروتيوميس من الأنواع النادرة). وإذا كانت معروفة في تسلسل البروتينات ذات الاهتمام، هو حل هذه المشكلة بسهولة بما في ذلك تسلسل الأحماض الأمينية protein(s) في قاعدة بيانات بروتين خلفية (كما هو موضح في هذا العمل في قسم البروتوكول). قيد محتمل آخر النتائج المنهجية من المقاومة للبروتين تريبسينوليسيس. التربسين الهضم هو عادة الأسلوب الافتراضي لتحديد البروتين من الأسفل. بيد أن البروتينات قد تكون مقاومة التربسين إذا أنها تفتقر إلى الأرجنتين و Lys مخلفات أو يتم تقييد الوصول إلى هذه المخلفات بهيكل مطوية. يتم حل هذه القيود، على التوالي، باستخدام مزيج من البروتياز أو بديل أو بما في ذلك كاشف تتكشف (اليوريا أو غوانيدين HCl، كما هو مبين في 1.1.14 و 1.2.6) قبل الهضم الأنزيمي.
وتشمل التوسعات الممكنة لهذه المنهجية مما يسمح للمستخدم بتتبع وتحديد المجمعات الجمعية الخلوية من النفط الخام ليساتيس الخلوية. وتبين التجارب لمكونات الجمعية تتركز مقتطفات الخلوية من السهل القيام باستخدام إجراءات قياس التداخل بيولايير. خلافا موائع جزيئية أكثر استخداماً على أساس المنهجيات التي عرضه لانسداد وحساسية للتجميع، يمكن استخدام نهج BLI تزج بيولايير استشعار نصائح مباشرة في مقتطفات النفط الخام احتمال تجميع مجمعات محددة مباشرة من هذه العينات النجسة مركزة. بمجرد تجميعها، من الممكن تماما لاستخدام المسابير جسم معين كمتابعة النظام BLI لمواصلة تحديد وحتى قوانتيتاتي يشتبه في أنهم عناصر في مقتطفات الخلوية التي تم تحديدها باستخدام أسلوب ميكروفولومي مرض التصلب العصبي المتعدد. مرة أخرى، أن المفتاح هنا استخدام البروتينات أساسية محددة وموجهة بشكل صحيح كما يسبر تقارب محددة.
القدرة على عرض بربري المسام عملية الانتقال مع BLI كينيتيكالي سوف تكون مفيدة للغاية في تحديد “المضادة السم” المحتملة جزيء صغير مثبطات البروتين التحولات التي تعمل على وجه التحديد ضمن أواخر اندوسومال، انخفاض الأس الهيدروجيني (5.0) شروط. هذا بربري درجة الحموضة التي يسببها للمسام الانتقال تحول دون حضور قابلة للطي مثبت (أوسموليتيس) مثل الجلسرين أو السكروز، ومما يضفي الدعم القوى لتطوير مثبتات قابلة للطي مستهدفة محددة تمنع السلطة الفلسطينية تشكيلالمسام . يتجنب هذا النهج المحدد ويستبدل فحوصات النفط الخام على أساس التجميع حيث تنخفض درجة الحموضة تؤدي إلى ترسيب البروتين. هذا الأسلوب الأخير، على الرغم من أن جيدة لأساليب الغربلة الأولية، غالباً ما يؤدي إلى نتائج إيجابية زائفة فيها مركبات محددة تمنع التجميع بدلاً من الانتقالات الجزيئية الفعلية.
الملاحظات النهائية لهيكل وتحديد المكونات الفردية المجمعة داخل عينات صغيرة ميكروفولومي أيضا يمكن أن تكون مفيدة في التحقق من مركبات الرصاص المحتملة. وهذا يمكن تطبيقها في الحالات التي يكون فيها استقرار الجمعية محددة أو زعزعة استقرار النتائج المستهدفة. هذا النهج الموازي الحركية/هيكل/تحديد مفيد لتأكيد صحة المستجيبة مركب الرصاص المشتبه فيها للجمعية مباشرة بمثابة خطوة معقولة الفرز الثانوي أو نهج الإنتاجية المتوسطة.
Cryo-م تقنية مفيدة لدراسة تفاصيل الذري مجمعات جزيء ضخم في الدول المختلفة للجمعية. قبل إعداد عينات م البرد، من المهم أولاً التحقق من إعداد يحتوي على مجمعات متجانسة نقية معقول مع وصمة سلبية م. الأعمال المعروضة هنا يوضح الجمعية من البروتين المجمعات على الأسطح biosensor BLI، الإفراج عن هذه المجمعات للتصور م، وتحديد هذه المكونات باستخدام MS. هذه منهجية خاصة للجمعية العامة التي تسيطر عليها، وإطلاق سراح يمكن أن يكون مفيداً في توليد البروتوكولات المحددة جداً التي تعزز إعداد عينة متسلسلة متجانسة لوصمة سلبية م، خطوة ضرورية ويجب أن تظهر قبل المضي قدما إلى م البرد. للحصول على بنية ثلاثية الأبعاد ذات الدقة المنخفضة، يلزم فقط 30-50 جزيئات معقدة لتنفيذ سلسلة إمالة مخروطية (70 صورة 2D مختلف وجهات النظر كل الجسيمات) شريطة أن يكون هناك اتجاه التنوع (وجهات نظر مختلفة متعددة).
فيما يتعلق بتعزيز أساليب مرض التصلب العصبي المتعدد، تواصل التقدم في الحساسية، وتخفيض حجم العينة تحسين. تدفقات نانو والضغط الفائقة اللوني السائل جنبا إلى جنب مع تنمية مطيافات الشامل مع واجب سريع دورة، وزيادة الحساسية وحل السلطة. الأخيرة مقدمة من مطياف كتلة أوربيتراب، لا سيما الإصدار الأحدث (أوربيتراب “لموس الانصهار”، وخلفه المتوقع “لموس الانصهار أوربيتراب” م 1) فضلا عن خوارزميات البحث إلى حد كبير تسهيل هذه العملية.
وترصد الجمعية الحركية والتفكيك من المكونات السمية الجمرة الخبيثة باستخدام منهجيات BLI خالية من التسمية المنهجية الحالية وتقييم الهيكل والهوية لهذه المكونات باستخدام EM ومرض التصلب العصبي المتعدد، على التوالي. استخدام قناة واحدة بسيطة نظام BLI مقترنة بالروتين السلبي تلطيخ تحليل م والابتدائية مرض التصلب العصبي المتعدد التقنيات أكثر من كافية لوصف عملية الجمعية العامة.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان يدعمه ماديسون وليلى الذاتي خريج زمالة (AJM)، 5T32GM008359 المعاهد الوطنية للصحة (PTO)، كومك الطبية الأحيائية بحوث التدريب برنامج (PTO)، R01AI090085 المعاهد الوطنية للصحة (MTF)، و “الأموال سد كو” و (منحة مركز التكنولوجيات التفاعل بيوموليكولي (ترسم) الأشعة المقطعية و MTF). الكتاب يود أن يشكر باربرا فيجليي في “كومك الميكروسكوب الإلكتروني الأساسية” للمساعدة في الحصول على الصور ال.
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) | GE Lifesciences | BR100058 | |
0.5 mL black microtubes | Sigma-Aldrich | Z688304-500EA | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457C-25mg | |
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å | ThermoFisher Scientific | 164561 | |
Acetic acid glacial | Fisher | A38SL-212 | |
Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips | Forte Bio | 18-5092 | |
Ammonium bicarbonate | Fisher | A643-500 | |
Anotop 10 syringe filter, 0.02um | GE Lifesciences | 6809-1002 | |
BLItz System | Pall Forte Bio | 45-5000 | |
Boric acid | Fisher Scientific | 10043-35-3 | |
Capillary Morphogenic Gene-2 | Protein produced and purified in-house | ||
Carbon coated Cu 300 grid | Electron Microscopy Sciences | CF300-CU-50 | |
Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT25 | |
Formic acids | JT Baker | 0129-01 | |
Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505-100G | |
Iodoacetamide | MP-BioMedicals,LLC | 100-351 | |
JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JEOL | ||
L-cystiene hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | C121800-5G | |
Lethal Factor N-terminal domain | Protein produced and purified in-house | ||
MS software version 2.2 | ThermoFisher Scientific | ||
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 090M14531V | |
Orbitrap Fusion Lumos | ThermoFisher | ||
PCR tubes | ThermoFisher Scientific | AB-0620 | |
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system | Ted Pella, Inc | 91000 | |
Protective Antigen prepore | Protein produced and purified in-house | ||
Qualitative filter paper circles | Fisher Scientific | 09-795C 5 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Sequest HT search engine | ThermoFisher Scientific | ||
Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | BP334-500 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
Sodium cholate | Sigma-Aldrich | C1254-100G | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
Uranyl formate (UF) | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
Xcalibur | ThermoFisher Scientific | OPTON-30487 |