Здесь мы представляем протокол осуществлять монтаж и демонтаж токсинов сибирской язвы, с помощью biolayer интерферометрии (BLI). После сборки/разборки на поверхности биосенсор крупных белковых комплексов освобождаются от поверхности для визуализации и идентификации компонентов комплексов с помощью электронной микроскопии и масс-спектрометрии, соответственно.
В естественных условиях, белки часто являются частью больших макромолекулярных комплексов, где привязка специфичность и динамика в конечном итоге диктовать функциональных мероприятий. В этой работе pre-от англ сибирской язвы токсин является собраны и перешли в от комплекса англ. Во-первых N-концевой домен хвоща мутант смертоносных фактора (NLF) прилагается к biolayer интерферометрии (BLI) биосенсор через дисульфида, муфты в оптимальной ориентации, позволяя защитные антигена (PA) prepore для привязки (Kd 1 Нм). Оптимально ориентированы LFN-PAprepore комплекс затем связывает растворимых капиллярного морфообразующих гена-2 (CMG2) клеток поверхности рецептор (Kd 170 м), что привело в комплексе представитель сибирской pre-от англ, стабильной при pH 7.5. Затем этот собранный комплекс подвергается подкисления (рН 5,0) представитель позднего endosome среды перехода ПАprepore в состояние поры мембраны вставлены. Это ПАпоры состояние приводит к ослабленной привязку между CMG2 рецептор и LFN-PA,поры и существенной диссоциации CMG2 от перехода поры. Тио вложение LFN биосенсор поверхность легко обратить вспять Дитиотреитол. Сокращение на поверхности биосенсор BLI выпускает LFN-PAprepore-CMG2 троичного комплекс или кислоты перешли LFN-PAпоры комплексов в микролитр томов. Выпущенные комплексы затем визуализируется и определены с помощью электронной микроскопии и масс-спектрометрии. Эти эксперименты демонстрируют, как кинетические сборки/разборки конкретных белковых комплексов с помощью метки бесплатно BLI методологий мониторинга и оценки структуры и личность этих BLI собрал комплексов электронной микроскопии и масса спектрометрия, соответственно, с помощью легко реплицировать последовательных процедур.
Выявление и понимание специфики регулирующих белка комплекс Ассамблеи в естественных условиях имеет крайнюю заинтересованность для биохимических исследователей. Большие гетерогенных белков сборки являются скорее нормой, чем исключением. Это понятие поддерживается спектральные наблюдения в vivo Ассамблеи, изолируя комплексов с использованием мягче клеточные нарушения технологии, оценки продуктов из методов на основе сродства очищения и визуализации их с высоким разрешением криогенных электронной микроскопии (крио EM). Чтобы понять управления Ассамблея специфичности в ячейке, исследователи должны регулярно изолировать, идентифицировать и в конечном итоге характеризуют эти динамические структуры, монтаж/демонтаж. Наиболее активно используемых молекулярной инструмент для идентификации компонентов этих собраний часто требует на основе антитело иммунопреципитации, которая опирается на поддержании комплекс стабильности во время разрушения клеток. Различные сочетании аналитических методов недавно были разработаны для захвата комплексы из образцов клеток, используя microfluidic на основе подходов, таких как поверхностного плазмон резонанс (СРП). После удаления с поверхностей СРП эти образцы были проанализированы при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации время полета (MALDI-TOF)1,2. Продвижение этой методологии с использованием легче протоколов позволит исследователям для визуализации и проверки прогнозируемых комплексы, которые происходят в клеточной среде. Так как СРП на основе микрофлюидика системы, от совокупного образования часто возникают проблемы. Обход этой проблемы требует разбавления образца, которая в свою очередь, может уменьшить целостности концентрация ответственности биологических комплексов.
Относительно недавнее продвижение в лейбл свободной технологии является развитие системы интерферометрии (BLI) biolayer3. Эти конкретного отражения на основе света которые системы репликации, или лучший подражать, SPR привязки и кинетические результаты на долю стоимости3,4 особенно если один канал единицы используются. BLI измеряет изменения в структурах отражение световых помех между эталонный слой (контроль) и biolayer поверхности (экспериментальная). Результирующее изменение фазы измеряется в режиме реального времени как кинетическая и количественной индикации5. Биосенсор поверхности, содержащий конкретные иммобилизации химия, физически переносится между решениями, в отличие от изменения буфера microfluidic подходы в СРП, для измерения через волны фазы прогибов. Эффекты массообмена предотвращаются путем агитировать решение. В отличие от СРП эти системы являются весьма полезными в оценке комплексов из сырой биологических образцов. Физический параметр измеряется в ходе экспериментов BLI главным образом зависит от изменения в масса или толщина на поверхности биосенсор, которая является результатом сложных Ассамблеи белка или разборки.
Эти волокна оптические биодатчики, удобный и сравнительно недорогой. Один из новых полезных аспектов BLI является поверхностным удаление вновь собрал белковых комплексов от поверхности. Недавнее применение этого метода позволило нашей лаборатории наблюдать реального времени кинетика больших масштабах рН индуцированной перегруппировки структуры белка компонента защитные антигена (PA) токсинов сибирской язвы, как prepore (preporeПА) перешли к его поры (ПАпоры) формы. Этот переход на кончик биосенсор была проверена с помощью электронной микроскопии (EM)6. Удаление комплексов от биосенсор поверхностей позволяет избежать большего объема разрежения эффекты часто встречающихся при освобождении комплексы от чип поверхностей при использовании микрофлюидика систем.
В текущей работе сибирской язвы токсин комплексы собираются и разобраны на поверхности биосенсор и затем выпустили в микролитр томов. Результате сложных компонентов проверяются ортогонально с помощью EM и масс-спектрометрия (МС).
Эта демонстрация показывает как макромолекулярных комплекс формирования можно легко контролировать с помощью biolayer интерферометрии, визуализируется с помощью EM и проверены с МС, все с микрообъемах в короткий промежуток времени. Структурные Ассамблеи и наблюдаемых комплексы следуют биологически соответствующих прогнозов, дальнейшие проверки этот комбинированный методологии. Как уже упоминалось в разделе результаты, ключевым элементом для успеха Ассамблея требует рационально инженерии хвоща мутагенеза обеспечить должным образом ориентированной от поверхности биосенсор комплекс протеин интерфейсов.
Предыдущие системы использовали BLI и MS методы для оценки связывания белков двух и трех компонентов систем, а также целостности связывания рецептора выраженной белка, но в обоих случаях методы не были разработаны воспользоваться тандем EM/MS подход к8,9. Только другие интерферометрии система, комбинированный анализ MS, чтобы помочь охарактеризовать взаимодействия был двойной поляризации интерферометрии10. К сожалению эта система больше не доступен для общего пользования. Как уже упоминалось во введении, были ряд исследований, где образцы были сформированы на поверхностях биосенсор SPR-как и удалены от MS анализа. Ни один из этих примеров в результате комплексы, визуализируется с помощью EM.
Ограничения этого последовательного метода может быть много, но разрешимы. Для первоначального иммобилизации и, следовательно, Фонд шаг Ассамблеи отсутствие знаний структурного взаимодействия поверхностей безусловно затруднит прогресс, связанные с наблюдением за первоначальной сборки фаз. Отсутствие информации структуры могут быть решены путем разработки инженерных фонд построить где вложение химия (например сульфгидрильных общие для дисульфидных связей / его меткой позиционирования) могут быть перемещены в различных регионах в рамках основной системы сборки. В случае сибирской язвы токсин комплекс отрадно, что структура LFN привязан к ПАprepore является наличие11. Рациональное размещение инженерии цистеина локализована в регионы от лица привязкиprepore ПА. С цистеином связь химия желательно, что без других реактивных которым присутствуют на поверхности белка.
Существуют различные химия вложений, которые могут быть использованы для инженер-сайт конкретных вложений на поверхности белка. Один из самых популярных конкретных вложений включает позиционирование остаток биотина в конкретно определенное место на поверхности белка12. К сожалению, биотин привязки к стрептавидина или авидин покрытием поверхности довольно туго. Реверсирование взаимодействия привязки не прост. Использование инженерных его тега на N – или C-го и последующих легкость привязанность к поверхности Ni-НТА является более универсальное применение сродства иммобилизации. Конечно один из предостережений для инженерных Ассамблеи вложение сайтов с его меткой систем является требование, что N – и C-Термини основного белка Ассамблеи оставаться подвергаются и разделены таким образом, что вложение легко. Как с всех процессов сборки, интерфейс взаимодействия основных Ассамблеи белка должно оставаться доступным как комплекс Ассамблеи прогрессирует.
Возможно наиболее общей задачей с помощью биосенсора поверхности химия является неспецифической привязки. Стрептавидина советы часто являются источником значительного неспецифической привязки эффектов. Дисульфида связаны биотина может использоваться для выпуска весьма специфические комплексы, оставив позади снижение связь S-биотин, тесно связана с иммобилизованными стрептавидина биодатчики13. Есть другие реверсивные химия, становятся доступны такие как iminoboronates и в меньшей степени ketoamide14. Это поле является в настоящее время слабо, но есть большой интерес в дальнейшем развитии реверсивные ковалентных протоколы избежать пробить наркотиков токсичности эффектов, которые обычно сопровождают использование ковалентных целевых наркотиков развития.
Ограничение использования EM для визуализации комплексов является толкование, особенно в тех случаях, где изначально не известны структуры собрал комплексов. Пространственное расположение компонентов в течение неопределенного собрал макромолекулярных комплекс могут быть идентифицированы с помощью моноклональных антител (МАБ) как конкретные кинетические и структурных маркеров. Например после того, как образуется комплекс, моноклональные антитела можно добавить, привязанная к конкретным компонентам. Этот метод часто используется в EM для выявления конкретных компонентов в течение15больших сборок. Другое ограничение связано с размером комплекса, хотя были случаи, где определенные симметричный сборок, как малые, как 70 кДа (гептамер GroES) легко решена с помощью негативные пятно EM. Собрал комплексы, которые анализируются EM, как правило, в диапазоне размеров от ~ 100 Å в диаметре или выше. Недавно однако, белки, как малые, как 20 кДа были решены и низким разрешением структуры были получены при использовании Улучшенный пятнать методологии16.
Для анализа MS повышенная чувствительность нынешнего инструментария MS вплоть до уровня femtomolar (attomoles) может в некоторых случаях увеличить чувствительность обнаружения BLI. Это весьма мыслимо, что белок сигналы, которые показывают минимальный, но повторяемые увеличение амплитуды приведет к идентификации белков в вопросе. Кроме того зондирование белок белковых взаимодействий с одним из партнеров, крепится на биосенсор и другой в клеточного окружения фактически приведет к очищения и впоследствии легче обнаружения новообразованной комплекса. Одно из ограничений, которые могут наблюдаться с текущей высокочувствительный MS систем, что протеина интереса не может быть в базе данных, но это наблюдение редких (например, протеомов от редких видов). Если последовательность протеинов интереса, как известно, эта проблема легко решается путем включая белки аминокислотной последовательности в базе данных белков фон (как описано в этой работе в разделе протокол). Другим потенциальным ограничением методологии результатов от сопротивления белка trypsinolysis. Пищеварение трипсина обычно является методом по умолчанию для снизу вверх идентификации белков. Однако белки могут быть устойчивы к трипсина, если им не хватает Arg и Lys остатков или доступ к эти остатки ограничены складчатые структуры. Соответственно, эти ограничения разрешаются с помощью альтернативных или сочетание протеазы или включая разворачивается реагента (мочевина или гуанидина HCl, как указано в 1.1.14 и 1.2.6) до ферментативного пищеварения.
Возможные расширения этой методологии включают в себя, позволяя пользователям следовать и выявления клеточных Ассамблеи комплексы из сырой сотовой лизатов. Оно turn out тестирования для компонентов сборки в концентрированных клеточных экстрактов легко выполнять с помощью процедуры biolayer интерферометрии. В отличие от более часто используемых microfluidic на основе методологии, которые подвержены засорению и чувствительны к агрегации BLI подход может использоваться погрузиться непосредственно biolayer датчика советы сырой экстракты потенциально собрать конкретные комплексы непосредственно из этих концентрированной нечистый образцов. После сборки, это вполне возможно использовать специфическое антитело зондов в последующей BLI системы для дальнейшего выявления и даже quantitate подозреваемых компоненты в клеточных экстрактов, которые были выявлены с помощью метода microvolume МС. Опять же ключевым здесь является использование определенных, правильно ориентированных основных белков, как конкретные сходства датчиков.
Возможность просмотра prepore до поры переходного процесса кинетически с BLI будет весьма полезной в выявлении потенциальных «анти токсин» малых молекул ингибиторов белка переходов, которые специально функционировать в конце от англ, низкого pH (5.0) условий. Этот рН индуцированных prepore до поры перехода ингибируется наличием складной стабилизатор (osmolytes) как глицерин или сахароза и таким образом оказывает решительную поддержку для разработки конкретных целевых складной стабилизаторы, которые мешают ПАпоры формирования. Этот подход позволяет избежать и заменяет сырой нефти на основе статистических анализов, где рН капель приведет к осадков белок. Этот последний метод, хотя хорошо для основных методов, биографии, часто приводит к ложных положительных результатов где конкретных соединений подавлять агрегации, вместо того, чтобы фактическое молекулярной переходы.
Течению замечания о структуре и идентификации отдельных сборных компонентов в малых microvolume образцы также могут быть полезны при проверке потенциальных соединений свинца. Это может применяться в случаях, когда конкретные Ассамблеи стабилизации или дестабилизации целевой результат. Такой параллельный подход кинетическая/структура/идентификации полезен для непосредственно подтверждающих действительность подозреваемых привести составные эффекторов Ассамблеи и служит разумной вторичного скрининга шаг или средней пропускной способности подход.
Крио-EM является полезным методом для изучения атомной детали макромолекулы комплексов в различных государствах Ассамблеи. До подготовки образцов крио EM, важно, чтобы сначала убедиться, что препарат содержит достаточно чистая однородных комплексы с отрицательным пятно EM. Работы, представленные в настоящем документе демонстрирует Ассамблеи белковых комплексов на BLI биосенсор поверхностях, освобождение этих комплексов для визуализации EM и идентификации этих компонентов с помощью MS. Это конкретной методологии управляемой сборки и выпуска может быть полезным в создании весьма специфические протоколы, которые улучшают однородных последовательных Пробоподготовка для отрицательных пятно EM, необходимый шаг, который должна быть продемонстрирована прежде чем перейти к крио EM. Чтобы получить низким разрешением 3D структура, только в 30-50 частицы комплекса необходимо будет выполнить ряд конических наклона (70 различных 2D изображения просмотров в частицы) условии ориентации разнообразия (несколько различных представлений).
Что касается совершенствования методов MS, достижения в чувствительности и сокращение объема образца продолжать совершенствовать. Nano потоки и жидкостной хроматографии высокого давления наряду с развитием масс-спектрометров с быстрым обязанность цикла, повышенная чувствительность и разрешающая способность. Недавнее введение в Орбитрэп масс-спектрометр, в частности на последней версии (Орбитрэп Fusion Lumos и его ожидаемый преемник Орбитрэп Fusion Lumos 1 М), а также алгоритмы поиска значительно облегчить этот процесс.
Нынешняя методология контролирует кинетическая сборка и разборка сибирской язвы токсин компонентов с помощью метки бесплатно BLI методологий и оценивает структуру и личность этих компонентов с помощью EM и МС, соответственно. Использование простой одного канала BLI системы в сочетании с обычной негативные окрашивания EM анализа и элементарные методы МС более чем достаточно характеризовать процесс сборки.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Мэдисон и Лила Self выпускников стипендий (Предложившем), низ 5T32GM008359 (ПТО), KUMC биомедицинских исследований учебные программы (ПТО), низ R01AI090085 (MTF), ку преодоление фондов и (Грант биомолекулы взаимодействие технологий центр (био) КТ и MTF). Авторы хотели бы поблагодарить Барбара Fegley KUMC электронной микроскопии Core за помощь с приобретением изображений ТЕА.
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) | GE Lifesciences | BR100058 | |
0.5 mL black microtubes | Sigma-Aldrich | Z688304-500EA | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457C-25mg | |
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å | ThermoFisher Scientific | 164561 | |
Acetic acid glacial | Fisher | A38SL-212 | |
Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips | Forte Bio | 18-5092 | |
Ammonium bicarbonate | Fisher | A643-500 | |
Anotop 10 syringe filter, 0.02um | GE Lifesciences | 6809-1002 | |
BLItz System | Pall Forte Bio | 45-5000 | |
Boric acid | Fisher Scientific | 10043-35-3 | |
Capillary Morphogenic Gene-2 | Protein produced and purified in-house | ||
Carbon coated Cu 300 grid | Electron Microscopy Sciences | CF300-CU-50 | |
Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT25 | |
Formic acids | JT Baker | 0129-01 | |
Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505-100G | |
Iodoacetamide | MP-BioMedicals,LLC | 100-351 | |
JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JEOL | ||
L-cystiene hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | C121800-5G | |
Lethal Factor N-terminal domain | Protein produced and purified in-house | ||
MS software version 2.2 | ThermoFisher Scientific | ||
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 090M14531V | |
Orbitrap Fusion Lumos | ThermoFisher | ||
PCR tubes | ThermoFisher Scientific | AB-0620 | |
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system | Ted Pella, Inc | 91000 | |
Protective Antigen prepore | Protein produced and purified in-house | ||
Qualitative filter paper circles | Fisher Scientific | 09-795C 5 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Sequest HT search engine | ThermoFisher Scientific | ||
Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | BP334-500 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
Sodium cholate | Sigma-Aldrich | C1254-100G | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
Uranyl formate (UF) | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
Xcalibur | ThermoFisher Scientific | OPTON-30487 |