यहां हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान एंथ्रेक्स विष के विधानसभा और विधानसभा की निगरानी के लिए एक परत interferometry (BLI) का उपयोग कर । निंनलिखित विधानसभा/बायोमास सेंसर सतह पर, बड़े प्रोटीन परिसरों के दृश्य और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर परिसर के घटकों की पहचान के लिए सतह से जारी कर रहे हैं, क्रमशः ।
vivo में, प्रोटीन अक्सर बड़े macromolecular कॉम्प्लेक्स का हिस्सा होते हैं, जहां बाइंडिंग विशिष्टता और गतिशीलता अंततः कार्यात्मक outputs हुक्म देती है । इस काम में प्री-endosomal एंथ्रेक्स विष इकट्ठा हो जाता है और endosomal परिसर में संक्रमण हो जाता है. सबसे पहले, एन एक cysteine उत्परिवर्ती घातक कारक के टर्मिनल डोमेन (वामोएन) एक इष्टतम अभिविंयास में डाइसल्फ़ाइड युग्मन के माध्यम से एक interferometry परत (BLI) से जुड़ा हुआ है, सुरक्षात्मक प्रतिजन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के लिए बाइंड करने की अनुमति (Kd 1 एनएम) । इष्टतम उंमुख वामोN-PAताकना जटिल तो घुलनशील केशिका morphogenic जीन-2 (CMG2) सेल सतह रिसेप्टर (कश्मीरडी १७० बजे), एक प्रतिनिधि एंथ्रेक्स पूर्व endosomal परिसर, पीएच ७.५ पर स्थिर में जिसके परिणामस्वरूप के लिए बांधता है । इस इकट्ठे परिसर तो अंलीकरण के अधीन है (पीएच ५.०) देर endosome पर्यावरण के प्रतिनिधि संक्रमण करने के लिए झिल्ली में पीएताकना डाला राज्य में ताकना । CMG2 रिसेप्टर और वामोN-paताकना और संक्रमण ताकना से CMG2 की एक पर्याप्त पृथक्करण के बीच एक कमजोर बंधन में यह पीएताकना राज्य परिणाम । इस thio-से वामो केएन की आसक्ति को dithiothreitol से आसानी से उलटा कर दिया जाता है. BLI पर कम सेंसर सतह विज्ञप्ति वामोn-paताकना-CMG2 त्रिगुट परिसर या एसिड microliter मात्रा में वामोn-paताकना परिसर में संक्रमण । जारी परिसरों तो visualized रहे है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर की पहचान की । ये प्रयोग प्रदर्शित करता है कि कैसे की निगरानी के लिए काइनेटिक विधानसभा/लेबल मुक्त BLI के तरीके का उपयोग कर विशिष्ट प्रोटीन परिसरों के विधानसभा/और संरचना और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और जनसंचार द्वारा इन BLI इकट्ठे परिसरों की पहचान का मूल्यांकन स्पेक्ट्रोमेट्री, क्रमशः, आसानी से दोहराने अनुक्रमिक प्रक्रियाओं का उपयोग कर ।
की पहचान करने और vivo में प्रोटीन कॉंप्लेक्स विधानसभा शासी जैव रासायनिक शोधकर्ताओं के लिए अत्यधिक ब्याज की है समझ । बड़े विषम प्रोटीन सभाओं के आदर्श के बजाय अपवाद हैं । इस धारणा vivo विधानसभा में स्पेक्ट्रोस्कोपी निगरानी द्वारा समर्थित है, gentler सेल व्यवधान तकनीकों का उपयोग कर परिसरों को अलग, समानता से उत्पादों का मूल्यांकन-शुद्धि तरीकों आधारित है, और उंहें उच्च संकल्प का उपयोग visualizing क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) । सेल के भीतर विधानसभा विशिष्टता के नियंत्रण को समझने के लिए, शोधकर्ताओं को नियमित रूप से अलग करना चाहिए, की पहचान, और अंततः इन गतिशील कोडांतरण/ सबसे भारी इस्तेमाल किया आणविक उपकरण इन सभाओं के घटकों की पहचान करने के लिए अक्सर एंटीबॉडी आधारित immunoprecipitation, जो सेल व्यवधान के दौरान जटिल स्थिरता बनाए रखने पर निर्भर करता है की आवश्यकता है । विभिन्न युग्मित विश्लेषणात्मक तकनीक हाल ही में microfluidic आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर सेल नमूनों से परिसरों पर कब्जा करने के लिए विकसित किए गए थे, जैसे सतह plasmon अनुनाद (SPR). SPR सतहों से हटाने के बाद, इन नमूनों मैट्रिक्स द्वारा विश्लेषण किया गया था असिस्टेड लेजर desorption/ionization उड़ान के समय (मालदी-तोफ)1,2. आसान प्रोटोकॉल का उपयोग कर इस पद्धति को आगे बढ़ाने के शोधकर्ताओं कल्पना करने के लिए और सत्यापित परिसरों कि सेलुलर वातावरण में होने की भविष्यवाणी की अनुमति देगा । चूंकि SPR एक microfluidics आधारित प्रणाली है, समस्याओं को अक्सर कुल गठन से उठता है । इस समस्या को दरकिनार नमूना कमजोर पड़ने की आवश्यकता है, जो बारी में, एकाग्रता उत्तरदायी जैविक परिसरों की अखंडता को कम कर सकते हैं.
लेबल मुक्त प्रौद्योगिकियों में एक अपेक्षाकृत हाल ही में प्रगति के विकास के लिए है interferometry (BLI) प्रणाली3। इन विशेष प्रकाश आधारित चिंतनशील प्रणाली दोहराने, या सबसे अच्छा अनुकरण, SPR बाध्यकारी और काइनेटिक परिणाम3लागत,4 के एक अंश पर विशेष रूप से अगर एक चैनल इकाइयों का उपयोग किया जाता है । BLI एक संदर्भ परत (नियंत्रण) और (प्रयोगात्मक) सतह के बीच प्रतिबिंबित प्रकाश हस्तक्षेप पैटर्न में परिवर्तन के उपाय । चरण में परिणामस्वरूप परिवर्तन एक काइनेटिक और मात्रात्मक readout5के रूप में वास्तविक समय में मापा जाता है । , विशिष्ट स्थिरीकरण chemistries युक्त, शारीरिक रूप से समाधान के बीच स्थानांतरित कर रहा है, के रूप में SPR में microfluidic दृष्टिकोण से बफर परिवर्तन का विरोध किया है, तरंग दैर्ध्य चरण विक्षेप के माध्यम से माप के लिए । जन स्थानांतरण प्रभाव आंदोलन को हल करने से रोका जाता है । SPR के विपरीत, इन प्रणालियों क्रूड जैविक नमूनों से परिसरों का मूल्यांकन करने में काफी उपयोगी होते हैं । शारीरिक BLI प्रयोगों के दौरान मापा पैरामीटर मुख्य रूप से बायोमास या मोटाई में एक परिवर्तन पर निर्भर करता है जो प्रोटीन जटिल विधानसभा या विधानसभा से परिणाम ।
इन फाइबर ऑप्टिक के लिए उपयोग करने के लिए आसान है और अपेक्षाकृत सस्ती सेंसर । एक BLI के उभरते उपयोगी पहलुओं की सतह से नए इकट्ठे प्रोटीन परिसरों के सतही हटाने है । इस पद्धति का एक हाल ही में आवेदन हमारी प्रयोगशाला के लिए बड़े पैमाने पर कैनेटीक्स के वास्तविक समय का निरीक्षण करने की अनुमति दी पीएच एंथ्रेक्स विष सुरक्षात्मक प्रतिजन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के घटक के रूप में संक्रमण कीसंरचना पुनर्व्यवस्था पोरे (पीएपोरे) रूप. इस पर संक्रमण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM)6का उपयोग कर सत्यापित किया गया था । microfluidics प्रणालियों का उपयोग करते समय चिप सतहों से परिसरों को रिहा जब बड़ी मात्रा कमजोर पड़ने प्रभाव अक्सर का सामना करना पड़ा जब से जटिल सेंसर सतहों से बचा जाता है ।
मौजूदा काम में एंथ्रेक्स विष परिसरों को इकट्ठा और विभक्त कर रहे हैं और फिर से microliter मात्रा में जारी है । जिसके परिणामस्वरूप जटिल घटकों का उपयोग कर मान्य हैं orthogonally EM और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS).
इस प्रदर्शन को दिखाता है कैसे macromolecular जटिल गठन आसानी से कर सकते है पर नजर रखी है, interferometry का उपयोग कर visualized, और एमएस के साथ सत्यापित, एक कम समय अवधि में microvolumes के साथ सभी । संरचनात्मक विधानसभा और मनाया परिसरों जैविक रूप से प्रासंगिक भविष्यवाणियों का पालन करें, आगे इस संयुक्त पद्धति मांय । के रूप में परिणाम अनुभाग में कहा गया है, विधानसभा की सफलता के लिए महत्वपूर्ण तत्व तर्कसंगत इंजीनियर cysteine mutagenesis की आवश्यकता को सुनिश्चित करना है कि जटिल प्रोटीन प्रोटीन इंटरफेस ठीक से दूर उंमुख है सेंसर सतह से ।
पिछले सिस्टम BLI और एमएस तकनीक का इस्तेमाल किया है दो और तीन घटक प्रणालियों के बंधन प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से व्यक्त की प्रोटीन की रिसेप्टर बाइंडिंग की अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए, लेकिन, दोनों उदाहरणों में, तरीकों को विकसित करने के लिए उंहें का लाभ लेने के लिए नहीं थे/ दृष्टिकोण8,9. केवल अंय interferometry प्रणाली है कि संयुक्त एमएस विश्लेषण मदद करने के लिए बातचीत की विशेषता एक दोहरे ध्रुवीकरण interferometry10था । दुर्भाग्यवश, यह सिस्टम अब सामांय उपयोग के लिए उपलब्ध नहीं है । के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, वहां पूरा अध्ययन के एक नंबर रहे हैं, जहां नमूनों SPR पर गठन किया गया-जैसे सेंसर सतहों और एमएस विश्लेषण से हटा दिया । उन उदाहरणों में से कोई भी उंहें का उपयोग कर visualized के परिणामस्वरूप ।
इस क्रमिक विधि की सीमाएं अनेक हो सकती है लेकिन गलाऊ हैं । प्रारंभिक स्थिरीकरण और इसलिए विधानसभा की नींव कदम के लिए, संरचनात्मक संपर्क के ज्ञान की कमी सतहों निश्चित रूप से प्रारंभिक विधानसभा चरणों की निगरानी के साथ जुड़े प्रगति में बाधा होगी । संरचना की जानकारी का अभाव एक इंजीनियर नींव के निर्माण के द्वारा संबोधित किया जा सकता है जहां लगाव chemistries (उदाहरण के लिए sulfhydryl moiety डाइसल्फ़ाइड लिंकेज के लिए/उसकी टैग स्थिति) कोर के भीतर विभिंन क्षेत्रों में ले जाया जा सकता है असेंबली सिस्टम । एंथ्रेक्स विष परिसर के मामले में, यह सौभाग्य था कि फिलीस्तीनी अथॉरिटी की सुविधा के लिए बाध्य वामोएन की संरचना11उपलब्ध है । इंजीनियर cysteine के तर्कसंगत नियुक्ति क्षेत्रों के लिए दूर पीएताकना बाध्यकारी चेहरे से स्थानीयकृत था । cysteine लिंकेज chemistries के साथ, यह बेहतर है कि कोई अंय प्रतिक्रियाशील cysteines प्रोटीन की सतह पर मौजूद हैं ।
वहां विभिंन लगाव chemistries जो एक प्रोटीन सतहों पर विशिष्ट लगाव साइट इंजीनियर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक सबसे लोकप्रिय विशिष्ट संलग्नक के प्रोटीन की सतह12पर एक विशेष रूप से परिभाषित स्थान पर एक बायोटिन moiety स्थिति शामिल है । दुर्भाग्य से, बायोटिन एक streptavidin या avidin लेपित सतहों के लिए बाध्यकारी काफी तंग है । बाध्यकारी बातचीत के उलटा सरल नहीं है । एक इंजीनियर के उपयोग के अपने-N पर टैग या सी-टर्मिनस और एनआई के लिए लगाव के बाद आसानी-ंत् सतहों समानता स्थिरीकरण के एक अधिक सार्वभौमिक आवेदन है । बेशक, अपने-सिस्टम टैग के साथ इंजीनियरिंग विधानसभा लगाव साइटों के लिए चेतावनी के एक आवश्यकता है कि एन और सी कोर असेंबली प्रोटीन के टर्मिनी उजागर और इतना है कि लगाव आसान है अलग रहते हैं । सभी विधानसभा प्रक्रियाओं के साथ के रूप में, कोर असेंबली प्रोटीन के संपर्क इंटरफ़ेस जटिल विधानसभा की प्रगति के रूप में उपलब्ध रहना चाहिए ।
शायद chemistries की सतह का उपयोग करने का सबसे आम चिंता गैर विशिष्ट बाध्यकारी है । Streptavidin युक्तियां अक्सर महत्वपूर्ण गैर विशिष्ट बाध्यकारी प्रभाव का एक स्रोत हैं । डाइसल्फ़ाइड लिंक्ड बायोटिन को कम एस-बायोटिन लिंकेज के पीछे छोड़ने के लिए बहुत विशिष्ट परिसरों को जारी रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कसकर स्थिर मैटीरियल streptavidin13। वहां अंय प्रतिवर्ती chemistries जैसे iminoboronates के रूप में उपलब्ध हो रही है और एक कम हद तक14ketoamide । इस क्षेत्र में वर्तमान में अविकसित है, लेकिन आगे प्रतिवर्ती आबंध प्रोटोकॉल के विकास में उच्च ब्याज से बचने के लिए लक्ष्य दवा विषाक्तता प्रभाव है कि सामांयतः आबंध लक्षित दवा विकास के उपयोग के साथ ।
उंहें जटिल कल्पना का उपयोग करने की एक सीमा व्याख्या है, विशेष रूप से उदाहरणों में, जहां इकट्ठे परिसरों की संरचनाओं शुरू में जाना नहीं है । एक अपरिभाषित इकट्ठे macromolecular परिसर में घटकों के स्थानिक स्थान विशिष्ट काइनेटिक और संरचनात्मक मार्करों के रूप में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) का उपयोग कर पहचाना जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक बार एक जटिल बना है, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जोड़ा जा सकता है कि विशेष घटकों के लिए बाध्य । इस विधि अक्सर EM में बड़ी असेंबली15के भीतर विशिष्ट घटकों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है । एक और सीमा जटिल के आकार से संबंधित है, हालांकि वहां गया है उदाहरण जहां छोटे रूप में ७० केडीए (GroES heptamer) के रूप में परिभाषित सममित विधानसभाओं आसानी से नकारात्मक दाग उंहें का उपयोग कर हल कर रहे हैं । जटिल है कि उंहें द्वारा विश्लेषण कर रहे है इकट्ठे के आकार रेंज में है आमतौर पर व्यास में ~ १०० Å या इसके बाद के संस्करण । हाल ही में हालांकि, प्रोटीन के रूप में छोटे रूप में 20 केडीए हल किया गया है और कम संकल्प संरचनाओं प्राप्त किया गया है जब बेहतर दाग के तरीके16का उपयोग कर.
एमएस विश्लेषण के लिए, वर्तमान एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन की वृद्धि हुई संवेदनशीलता नीचे femtomolar (attomoles) स्तर के लिए कुछ मामलों में BLI का पता लगाने की संवेदनशीलता में वृद्धि कर सकते हैं. यह अत्यधिक कल्पना है कि प्रोटीन संकेत है कि आयाम में एक ंयूनतम लेकिन दोहराने वृद्धि दिखाने के प्रश्न में प्रोटीन की पहचान में परिणाम होगा । इसके अलावा, जांच प्रोटीन प्रोटीन-एक और एक सेलुलर वातावरण में प्रभाव परिणाम में एक शुद्धि और बाद में नए परिसर का गठन आसान का पता लगाने में होगा पर संलग्न भागीदारों में से एक के साथ संपर्क । एक सीमा है कि वर्तमान अति संवेदनशील एमएस सिस्टम के साथ मनाया जा सकता है कि ब्याज की प्रोटीन डेटाबेस में नहीं हो सकता है, लेकिन इस अवलोकन दुर्लभ है (जैसे, दुर्लभ प्रजातियों से proteomes) । यदि ब्याज के प्रोटीन के अनुक्रम जाना जाता है, यह समस्या आसानी से एक पृष्ठभूमि प्रोटीन डेटाबेस में प्रोटीन (एस) एमिनो एसिड अनुक्रम सहित द्वारा हल कर रहे है (के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में इस काम में वर्णित) । एक प्रोटीन के प्रतिरोध से कार्यप्रणाली परिणाम की एक और संभावित सीमा trypsinolysis । Trypsin पाचन आमतौर पर प्रोटीन पहचान ऊपर नीचे के लिए डिफ़ॉल्ट विधि है । हालांकि, प्रोटीन trypsin के लिए प्रतिरोधी हो सकता है अगर वे Arg और Lys अवशेषों या इन अवशेषों तक पहुंच की कमी जोड़ संरचना द्वारा प्रतिबंधित कर रहे हैं । इन सीमाओं को हल कर रहे हैं, क्रमशः, विकल्प का उपयोग करके या एक संयोजन या एक खुलासा (यूरिया या guanidine एचसीएल सहित, 1.1.14 और 1.2.6 में संकेत के रूप में) पाचन एंजाइमी से पहले ।
इस पद्धति के संभावित विस्तार के लिए उपयोगकर्ता का पालन करें और क्रूड सेलुलर lysates से सेलुलर विधानसभा परिसरों की पहचान की अनुमति शामिल है । यह बाहर केंद्रित सेलुलर निष्कर्षों में विधानसभा घटकों के लिए परीक्षण बदल जाता है के लिए उपयोग करने के लिए आसान है interferometry प्रक्रिया । अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया microfluidic आधारित के तरीके जो कॉलेस्ट्रॉल और एकत्रीकरण के प्रति संवेदनशील के लिए प्रवण हैं, BLI दृष्टिकोण के लिए सीधे कच्चे तेल के अर्क में परत संवेदक युक्तियां विसर्जित करने के लिए संभावित विशिष्ट परिसरों सीधे इकट्ठा किया जा सकता है इन केंद्रित अशुद्ध नमूनों से । एक बार इकट्ठे, यह पूरी तरह से एक BLI प्रणाली को आगे की पहचान करने और यहां तक कि सेलुलर निष्कर्षों कि microvolume एमएस विधि का उपयोग कर पहचान की गई में संदिग्ध घटकों quantitate के रूप में विशिष्ट एंटीबॉडी जांच का उपयोग करने के लिए व्यवहार्य है । फिर, यहां कुंजी को परिभाषित उपयोग करते हैं, ठीक से विशिष्ट संबध जांच के रूप में कोर प्रोटीन उंमुख है ।
BLI के साथ संक्रमण प्रक्रिया को ताकना करने के लिए को ध्यान में रखते हुए क्षमता को देखने के लिए उच्च क्षमता की पहचान करने में उपयोगी हो जाएगा “विरोधी विष” प्रोटीन संक्रमण के छोटे अणु अवरोधों कि विशेष रूप से देर endosomal के तहत कार्य, कम पीएच ५.० () शर्तों. इस pH प्रेरित ताकना संक्रमण को ताकना करने के लिए इस तरह के ग्लिसरॉल या सुक्रोज के रूप में स्थिरता (osmolytes) तह की उपस्थिति में बाधा है, और इस तरह विशिष्ट लक्षित तह स्थिरता कि फिलीस्तीनी अथॉरिटीताकना गठन को रोकने के विकास के लिए मजबूत समर्थन बख्शी । इस विशिष्ट दृष्टिकोण से बचा जाता है और कच्चे तेल एकत्रीकरण आधारित परख की जगह जहां पीएच बूंदें प्रोटीन वर्षण के लिए सीसा । यह बाद की विधि, हालांकि प्राथमिक के लिए अच्छे तरीके के लिए अच्छा है, अक्सर झूठी सकारात्मक परिणाम जहां विशिष्ट यौगिकों के बजाय वास्तविक आणविक संक्रमण एकत्रीकरण को बाधित करने की ओर जाता है ।
संरचना और छोटे microvolume नमूनों के भीतर व्यक्तिगत इकट्ठे घटकों की पहचान के बहाव प्रेक्षण भी संभावित नेतृत्व यौगिकों मान्य करने में उपयोगी हो सकता है. इस उदाहरण में लागू किया जा सकता है जहां या तो विशिष्ट विधानसभा स्थिरीकरण या स्थिरीकरण लक्ष्य परिणाम है । यह काइनेटिक/संरचना/समानांतर दृष्टिकोण विधानसभा के संदिग्ध नेतृत्व यौगिक प्रभाव की वैधता की पुष्टि करने के लिए उपयोगी है और एक उचित माध्यमिक स्क्रीनिंग कदम या मध्यम प्रवाह दृष्टिकोण के रूप में कार्य करता है ।
क्रायो-EM विधानसभा के विभिन्न राज्यों में macromolecule परिसरों के परमाणु विवरण का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है । पहले क्रायो-em नमूनों की तैयारी करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए पहली बार एक तैयारी सत्यापित नकारात्मक दाग के साथ यथोचित शुद्ध समरूप परिसरों शामिल हैं. इस के साथ साथ प्रस्तुत काम BLI पर प्रोटीन परिसरों के विधानसभा प्रदर्शित करता है-संवेदक सतहों, EM दृश्य के लिए इन परिसरों की रिहाई, और एमएस का उपयोग कर इन घटकों की पहचान. नियंत्रित विधानसभा और रिहाई के इस विशेष पद्धति बहुत विशिष्ट प्रोटोकॉल है कि नकारात्मक दाग उंहें, एक आवश्यक कदम है कि आगे बढ़ाने से पहले प्रदर्शन किया जाना चाहिए के लिए समरूप अनुक्रमिक नमूना तैयारी बढ़ाने में उपयोगी हो सकता है क्रायो-EM । कम संकल्प 3 डी संरचना प्राप्त करने के लिए, जटिल के केवल 30-50 कणों एक शंकु झुकाव श्रृंखला प्रदर्शन करने की जरूरत होगी (७० अलग कण प्रति 2d छवि विचारों) प्रदान की वहां अभिविंयास विविधता है (एकाधिक अलग विचार) ।
एमएस तरीकों को बढ़ाने के संबंध में, संवेदनशीलता में अग्रिम और नमूना मात्रा में कमी को बेहतर बनाने के लिए जारी है । नैनो प्रवाह और अल्ट्रा उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी एक तेजी से कर्तव्य चक्र के साथ जन स्पेक्ट्रोमीटर के विकास के साथ, संवेदनशीलता में वृद्धि हुई है और शक्ति को हल । orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर का हाल ही में परिचय, विशेष रूप से नवीनतम संस्करण (orbitrap संलयन Lumos, और इसकी उंमीद उत्तराधिकारी orbitrap संलयन 1m Lumos) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खोज एल्गोरिदम बहुत इस प्रक्रिया की सुविधा ।
वर्तमान पद्धति पर नज़र रखता है काइनेटिक विधानसभा और एंथ्रेक्स विष घटकों के विधानसभा लेबल का उपयोग मुक्त BLI के तरीके और संरचना और इन घटकों का उपयोग कर उंहें और एमएस, क्रमशः की पहचान का मूल्यांकन करता है । एक सरल एकल चैनल BLI दिनचर्या नकारात्मक धुंधला EM विश्लेषण और प्राथमिक एमएस तकनीक के साथ युग्मित प्रणाली के उपयोग के लिए एक विधानसभा की प्रक्रिया को चिह्नित करने के लिए पर्याप्त से अधिक कर रहे हैं ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम मैडिसन और लीला सेल्फ ग्रेजुएट फेलोशिप (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC बायोमेडिकल रिसर्च ट्रेनिंग प्रोग्राम (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), केयू ब्रिजिंग फंड और जैव अणु इंटरेक्शन टेक्नोलॉजीज सेंटर (BITC) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ( सीटी और MTF) । लेखक के लिए KUMC इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कोर पर बारबरा Fegley उनि छवि अधिग्रहण के साथ सहायता के लिए धंयवाद देना चाहूंगा ।
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) | GE Lifesciences | BR100058 | |
0.5 mL black microtubes | Sigma-Aldrich | Z688304-500EA | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457C-25mg | |
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å | ThermoFisher Scientific | 164561 | |
Acetic acid glacial | Fisher | A38SL-212 | |
Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips | Forte Bio | 18-5092 | |
Ammonium bicarbonate | Fisher | A643-500 | |
Anotop 10 syringe filter, 0.02um | GE Lifesciences | 6809-1002 | |
BLItz System | Pall Forte Bio | 45-5000 | |
Boric acid | Fisher Scientific | 10043-35-3 | |
Capillary Morphogenic Gene-2 | Protein produced and purified in-house | ||
Carbon coated Cu 300 grid | Electron Microscopy Sciences | CF300-CU-50 | |
Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT25 | |
Formic acids | JT Baker | 0129-01 | |
Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505-100G | |
Iodoacetamide | MP-BioMedicals,LLC | 100-351 | |
JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JEOL | ||
L-cystiene hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | C121800-5G | |
Lethal Factor N-terminal domain | Protein produced and purified in-house | ||
MS software version 2.2 | ThermoFisher Scientific | ||
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 090M14531V | |
Orbitrap Fusion Lumos | ThermoFisher | ||
PCR tubes | ThermoFisher Scientific | AB-0620 | |
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system | Ted Pella, Inc | 91000 | |
Protective Antigen prepore | Protein produced and purified in-house | ||
Qualitative filter paper circles | Fisher Scientific | 09-795C 5 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Sequest HT search engine | ThermoFisher Scientific | ||
Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | BP334-500 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
Sodium cholate | Sigma-Aldrich | C1254-100G | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
Uranyl formate (UF) | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
Xcalibur | ThermoFisher Scientific | OPTON-30487 |