Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.
In vivo eiwitten zijn vaak onderdeel van grote macromoleculaire complexen waar bindende specificiteit en dynamiek uiteindelijk functionele uitgangen dicteren. In dit werk, is de pre-endosomal bloedzweer toxine geassembleerd en overgestapt naar de complexe endosomal. Ten eerste is het domein van de N-terminal van een mutant letale factor van cysteïne (LFN) gekoppeld aan een biosensor interferometrie (BLI) biolayer via bisulfide-koppeling in een optimale oriëntatie, zodat beschermende antigeen (PA) prepore te binden (Kd 1 nM). De optimaal georiënteerde LFN-PAprepore complex dan bindt aan oplosbare capillaire morfogenisch gen-2 (CMG2) cel oppervlakte receptor (Kd 170 pM), resulterend in een representatieve miltvuur pre-endosomal complex, stabiel bij pH 7.5. Geassembleerde appartementencomplex is vervolgens onderworpen aan de vertegenwoordiger van de verzuring (pH 5.0) van de late endosome milieu om de overgang van de PA-prepore in de staat van de porie membraan ingevoegd. Deze PAporie staat resulteert in een verzwakte binding tussen de CMG2 receptor en de LFN-PAporiën en een aanzienlijke dissociatie van CMG2 uit de porie van overgang. De thio-bijlage van LFN aan de biosensor oppervlakte is gemakkelijk ongedaan gemaakt door de dithiothreitol. Korting op het oppervlak van de biosensor BLI releases de LFN-PAprepore-CMG2 ternaire complex of het zuur overgestapt LFN-PAporie complexen in microliter volumes. Vrijgegeven complexen zijn dan gevisualiseerd en geïdentificeerd met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie. Deze experimenten laten zien hoe om te controleren de kinetische montage/demontage van specifieke eiwitcomplexen met behulp van label-vrije BLI methodologieën en evalueren van de structuur en de identiteit van deze BLI complexen geassembleerd door elektronenmicroscopie en massa Spectrometrie van, respectievelijk, met behulp van gemakkelijk-te-repliceren sequentiële procedures.
Identificeren en inzicht in de specificiteit bestuur eiwit complex vergadering in vivo is van extreem belang voor biochemische onderzoekers. Grote heterogene eiwit assemblages zijn de norm in plaats van de uitzondering. Dit begrip wordt ondersteund door spectroscopische monitoring van in vivo assemblage, complexen met behulp van zachter cel verstoring technieken, producten van zuivering affiniteit gebaseerde methoden evalueren en visualiseren ze isoleren met behulp van hoge resolutie Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM). Om de controle op de specificiteit van de vergadering binnen de cel te begrijpen, moeten onderzoekers routinematig isoleren, identificeren en uiteindelijk het karakteriseren van deze dynamische montage/demontage structuren. De meest intensief gebruikte moleculaire hulpmiddel om identificatie van de bestanddelen van deze vergaderingen vaak vereist antilichaam gebaseerde immunoprecipitation, die gebaseerd is op het behoud van de complexe stabiliteit tijdens de verstoring van de cel. Verschillende gekoppelde analytische technieken werden onlangs ontwikkeld om het vangen van complexen van celsteekproeven met behulp van de microfluidic gebaseerde benaderingen, zoals oppervlakte plasmon resonantie (SPR). Na verwijdering van de SPR oppervlakken, deze monsters werden geanalyseerd door laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie tijd voor vlucht (MALDI-TOF)1,2. Bevordering van deze methode met behulp van eenvoudiger protocollen kunnen onderzoekers te visualiseren en te valideren voorspelde complexen die zich in de cellulaire milieu voordoen. Aangezien SPR een microfluidics-gebaseerd systeem is, problemen vaak uit statistische formatie. Omzeilen van dit probleem vereist monsterverdunning, die op zijn beurt, de integriteit van concentratie aansprakelijk biologische complexen kan afnemen.
Een relatief recente vooruitgang in label-vrije technologieën is de ontwikkeling van de biolayer interferometrie (BLI) systeem3. Deze bijzondere licht-gebaseerde reflectiecoëfficiënt systemen repliceren, of beste emuleren, SPR bindende en kinetische uitslagen op een fractie van de kosten3,4 vooral als enkellijns eenheden worden gebruikt. BLI meet veranderingen in de gereflecteerde licht interferentie tussen een referentielaag (controle) en het biolayer oppervlak (experimenteel). De resulterende wijzigingen in fase wordt gemeten in real-time als een kinetische en kwantitatieve uitlezing5. De biosensor oppervlak, met specifieke immobilisatie chemicaliën, wordt fysiek tussen oplossingen, in tegenstelling tot de buffer wijzigingen door microfluidic benaderingen in SPR, voor meting via golflengte fase verlegging overgebracht. Massaoverdracht effecten worden voorkomen door schudden van de oplossing. In tegenstelling tot SPR zijn deze systemen zeer nuttig bij de beoordeling van de complexen van ruwe biologische monsters. De fysieke parameter gemeten tijdens BLI experimenten voornamelijk is afhankelijk van een verandering in de massa of de dikte aan de biosensor oppervlakte die uit eiwit complex montage of demontage voortvloeit.
Deze fiber optic biosensoren zijn makkelijk te gebruiken en relatief goedkoop. Een van de opkomende nuttige aspecten van BLI is de facile verwijdering van nieuw gemonteerde eiwitcomplexen van het oppervlak. Een recente toepassing van deze methode toegestaan ons laboratorium te observeren de real-time kinetiek van grootschalige pH geïnduceerde proteïne-omlegging van de structuur van de bloedzweer toxine beschermende antigeen (PA) component zoals de prepore (PAprepore) naar overgestapt haar porie (PAporie) vorm. Deze overgang op de biosensor tip was geverifieerd met behulp van elektronenmicroscopie (EM)6. Verwijdering van complexen van biosensor oppervlakken vermijdt groter volume verdunning effecten vaak opgetreden wanneer het vrijgeven van complexen van chip oppervlakken bij het gebruik van microfluidics systemen.
In het huidige werk, zijn miltvuur toxine complexen gemonteerd en gedemonteerd aan de biosensor oppervlakte en vervolgens vrijgelaten in microliter volumes. De resulterende complexe componenten zijn gevalideerd orthogonaal met behulp van EM en massaspectrometrie (MS).
Deze demonstratie ziet u hoe macromoleculaire complexvorming kan gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van biolayer interferometrie, gevisualiseerd met behulp van EM, en gecontroleerd met MS, allemaal met microvolumes in een korte tijdsspanne. Structurele montage en waargenomen complexen volgen de biologisch relevante voorspellingen, deze gecombineerde methodologie verder te valideren. Zoals vermeld in het gedeelte ‘ resultaten ‘, vereist het belangrijkste element voor het succes van de vergadering rationeel gemanipuleerde cysteïne mutagenese om ervoor te zorgen dat de complexe eiwit-eiwitinteractie interfaces goed georiënteerde uit de buurt van het oppervlak van de biosensor.
Eerdere systemen hebben BLI en MS-technieken gebruikt voor het evalueren van de binding aan eiwitten van twee en drie componentsystemen en integriteit van receptor binden van uitgedrukt eiwit, maar in beide gevallen, de methoden werden niet ontwikkeld om te profiteren van de tandem EM/MS 8,9te benaderen. Het alleen andere interferometrie systeem dat MS analyse om te helpen met het karakteriseren van interacties gecombineerd was een dual-polarisatie interferometrie10. Helaas, dit systeem is niet langer beschikbaar voor algemeen gebruik. Zoals vermeld in de inleiding, zijn er een aantal studies voltooid waar monsters werd opgericht op SPR-achtige biosensor oppervlakken en verwijderd uit MS analyse. Geen van deze voorbeelden resulteerde in complexen gevisualiseerd met behulp van EM.
De beperkingen van deze opeenvolgende methode kunnen talrijke maar oplosbaar zijn. Voor de eerste immobilisatie en daarom Stichting stap van de vergadering, zou een gebrek aan kennis van de structurele interactie oppervlakken zeker vooruitgang die is gekoppeld aan het toezicht van eerste montage fasen belemmeren. Het gebrek aan informatie van de structuur kan worden aangepakt door het ontwerpen van een gemanipuleerde Stichting bouwen waar bijlage chemicaliën (bijvoorbeeld sulfaatzuurstof groep voor bisulfide verbanden / zijn-gelabeld positionering) kunnen worden verplaatst naar de verschillende regio’s binnen de kern montage systeem. In het geval van de bloedzweer toxine complexe had het geluk dat de structuur van LFN gebonden aan PAprepore beschikbaar11 is. Rationele plaatsing van de gemanipuleerde cysteïne was gelokaliseerd aan regio’s van de PAprepore bindende gezicht af. Met cysteïne koppeling Doorgaan is het beter dat geen andere reactieve cysteines op het oppervlak van het eiwit aanwezig zijn.
Er zijn verschillende bijlage chemicaliën die kunnen worden gebruikt om specifieke site op de oppervlakken van een eiwit. Een van de populairste specifieke bijlagen gaat positionering van een groep van biotine op een specifiek gedefinieerde locatie op de oppervlakte van eiwit12. Helaas, Biotine binding aan een streptavidine of avidin gecoate oppervlakken is vrij krap. Omkering van de bindende interactie is niet eenvoudig. Het gebruik van een gemanipuleerde zijn-tag op de N – of C-terminus en het verdere gebruiksgemak gehechtheid aan Ni-NTA oppervlakken is een meer universele toepassing van affiniteit immobilisatie. Natuurlijk, is een van de waarschuwingen voor engineering vergadering bijlage sites met zijne-gelabeld systemen de eis dat de N – en C-termini van het core vergadering eiwit blijven blootgesteld en gescheiden zodat de bijlage eenvoudig is. Als met alle assemblage processen, moet de interface van de interactie van de kern vergadering eiwit beschikbaar blijven als het complexe vergadering vordert.
Misschien is de meest voorkomende zorg van het gebruik van biosensor oppervlakte chemicaliën aspecifieke bindend. Daar tips zijn vaak een bron van aanzienlijke niet-specifieke bindende gevolgen. Bisulfide gekoppeld Biotine kan worden gebruikt om zeer specifieke complexen weggaand achter de verminderde S-Biotine koppeling strak gebonden aan geïmmobiliseerdet daar biosensoren13vrij te geven. Er zijn andere omkeerbare oplossingen steeds beschikbaar zoals iminoboronates en aan een mindere mate ketoamide14. Dit veld is momenteel onderontwikkeld, maar er is van groot belang voor de verdere ontwikkeling van omkeerbare covalente protocollen om te voorkomen dat af-target drug toxiciteitseffecten die vaak gepaard gaan met het gebruik van covalente gerichte Geneesmiddelenontwikkeling.
Een beperking van het gebruik van EM te visualiseren complexen is interpretatie, vooral in gevallen waar de structuren van de geassembleerde complexen zijn niet in eerste instantie bekend. De ruimtelijke locatie van componenten binnen een ongedefinieerde geassembleerde macromoleculaire complex kan worden geïdentificeerd met behulp van monoklonale antilichamen (mAb) als specifieke kinetische en structurele markers. Bijvoorbeeld, zodra een complex wordt gevormd, kunnen monoklonale antilichamen worden toegevoegd die aan specifieke componenten binden. Deze methode wordt het vaak gebruikt in EM om specifieke onderdelen binnen grote verzamelingen15te identificeren. Een andere beperking is gerelateerd aan de grootte van het complex, al zijn er gevallen waar gedefinieerde symmetrische vergaderingen zo klein als 70 kDa (GroES heptamer) zijn gemakkelijk met behulp van opgelost negatieve vlek EM. Geassembleerde complexen die zijn geanalyseerd door EM zijn meestal in de groottewaaier van ~ 100 Å diameter of hoger. Onlangs echter eiwitten zo klein als 20 kDa zijn opgelost en lage resolutie structuren zijn verkregen bij het gebruik van superieure methodologieën16kleuring.
Voor MS-analyse, kan de verhoogde gevoeligheid van huidige MS instrumentatie tot op het niveau van de femtomolar (attomoles) in sommige gevallen de gevoeligheid van BLI detectie verhogen. Het is zeer denkbaar dat eiwit signalen die aantonen dat een minimale maar herhaalbare stijging van de amplitudes leiden identificatie van het eiwit in kwestie tot zal. Bovendien, indringende eiwit-eiwitinteractie met één van de partners die zijn gekoppeld aan de biosensor en de andere in een cellulaire milieu zal in feite leiden tot een zuivering en vervolgens eenvoudiger detectie van het nieuw gevormde complex. Een beperking die kan worden waargenomen met de huidige systemen voor hooggevoelige MS is dat de proteïne van belang kan niet in de database, maar deze constatering zeldzaam is (bv . de proteomes van zeldzame soorten). Als de proteïnes van belang bekend zijn, wordt dit probleem gemakkelijk opgelost door de expressie gebrachte eiwitten aminozuur volgorde in een achtergrond eiwit database (zoals beschreven in dit werk in de sectie protocol). Een andere mogelijke beperking van de resultaten van de methodologie van de weerstand van een eiwit aan trypsinolysis. Spijsvertering van de trypsine is meestal de standaardmethode voor bottom-up eiwit identificatie. Eiwitten kunnen echter resistent tegen trypsine als ze Arg en Leie residuen missen of toegang tot deze residuen worden beperkt door de gevouwen structuur. Deze beperkingen zijn opgelost, respectievelijk door het gebruik van alternatief of een combinatie van proteasen of met inbegrip van een zich ontwikkelende reagens gebruikt wordt (ureum of guanidine HCl, zoals aangegeven in 1.1.14 en 1.2.6) voor enzymatische spijsvertering.
Mogelijke uitbreidingen van deze methodologie opnemen waarmee de gebruiker te volgen en identificeren van cellulaire vergadering complexen van ruwe cellulaire lysates. Het blijkt dat de testen voor montage onderdelen in geconcentreerde extracten van de cellulaire is gemakkelijk uit te voeren met behulp van de biolayer interferometrie procedures. In tegenstelling tot de meer algemeen gebruikte microfluidic gebaseerd methodologieën die naar voren gebogen tot verstopping en gevoelig voor aggregatie, kan de BLI benadering worden gebruikt om te dompelen direct biolayer sensor tips in grove extracten potentieel direct monteren specifieke complexen uit deze geconcentreerde onzuiver monsters. Eenmaal gemonteerd, is het volledig haalbaar met specifiek antilichaam sondes als follow-up van het BLI systeem nader te identificeren en kwantificeren zelfs verdachte componenten in cellulaire extracten die werden geïdentificeerd met behulp van de methode microvolume MS. Nogmaals, de sleutel is hier is het gebruik van gedefinieerde, goed georiënteerde kern eiwitten zoals specifieke affiniteit sondes.
Mogelijkheden voor het weergeven van de prepore om het overgangsproces kinetisch met BLI porie zullen zeer nuttig in het identificeren van potentiële “anti-toxine” klein molecuul remmers van de eiwit-overgangen die specifiek onder laat endosomal, lage pH (5.0 werken) voorwaarden. Deze pH geïnduceerde prepore aan de porie van overgang in het bijzijn van de stabilisator (osmolytes) vouwen zoals glycerol of sacharose wordt geremd, en dus leent krachtige steun voor de ontwikkeling van de specifieke gerichte opvouwbare stabilisatoren die voorkomen PA datporie vorming. Deze specifieke aanpak voorkomt en vervangt ruwe aggregatie gebaseerde testen waar pH druppels leiden tot eiwit neerslag. Deze laatste methode, leidt hoewel goed voor primaire prescreening methoden, vaak tot vals-positieve resultaten waar specifieke verbindingen remmen de samenvoeging in plaats van de werkelijke moleculaire overgangen.
De downstream opmerkingen van de structuur en identificatie van de individuele geassembleerde componenten binnen kleine microvolume monsters kunnen ook nuttig zijn bij het valideren van potentiële loodverbindingen. Dit kan worden toegepast in gevallen waarin specifieke vergadering stabilisatie of destabilisatie het resultaat van de doelgroep is. Deze parallelle aanpak van kinetische/structuur/identificatie is handig voor het direct bevestigen van de geldigheid van de samengestelde effectoren vermoedelijke voorsprong van vergadering en dient als een redelijke secundaire screening stap of middellange doorvoer aanpak.
Cryo-EM is een nuttige techniek aan de studie van de atomaire details van macromolecule complexen in verschillende staten van vergadering. Voorafgaand aan de voorbereiding van cryo-EM monsters, is het belangrijk eerst controleren of dat een preparaat bevat redelijk zuivere homogene complexen met negatieve vlek EM. De hier vermelde werk toont vergadering van eiwitcomplexen op BLI biosensor oppervlakken, vrijlating van deze complexen voor EM visualisatie, en de identificatie van deze onderdelen met behulp van MS. Deze bijzondere methode van gecontroleerde vergadering en release kunnen nuttig zijn bij het genereren van zeer specifieke protocollen die homogene sequentiële monstervoorbereiding voor negatieve vlek EM, een noodzakelijke stap die moet worden aangetoond voordat bevorderen om te verbeteren Cryo-EM. Met het oog op een lage resolutie 3D-structuur, zou slechts 30-50 deeltjes van complex nodig zijn voor het uitvoeren van een reeks van conische tilt (70 verschillende 2D-afbeelding meningen per deeltje) mits er verscheidenheid van oriëntatie (meerdere verschillende meningen is).
Met betrekking tot het verbeteren van de MS-methoden, blijven voorschotten in gevoeligheid en vermindering van monstervolume verbeteren. Nano stromen en ultra hogedruk-vloeistofchromatografie samen met de ontwikkeling van massaspectrometers met een snel recht fiets, verhoogde gevoeligheid en oplossen van macht. Recente introductie van de orbitrap massa spectrometer, met name de nieuwste versie (orbitrap Fusion Lumos, en de verwachte opvolger van de Orbitrap Fusion Lumos 1M), evenals de zoektocht algoritmen sterk vergemakkelijken dit proces.
De huidige methode controleert de kinetische montage en demontage van miltvuur toxine componenten met behulp van label-vrije BLI methodologieën en resulteert in de structuur en de identiteit van deze componenten met behulp van EM en MS, respectievelijk. Het gebruik van een eenvoudige enkellijns BLI systeem in combinatie met routine negatieve kleuring EM analyse en elementaire MS technieken zijn meer dan voldoende te karakteriseren van een assemblage proces.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Madison en Lila zelf Graduate Fellowship (AJM), NIH 5T32GM008359 (PTO), KUMC biomedisch onderzoek opleiding programma (PTO), NIH R01AI090085 (MTF), KU overbruggen van fondsen en de Biomolecuul interactie technologieën Center (BITC) Grant ( CT en MTF). De auteurs bedank Barbara Fegley KUMC elektronenmicroscopie kern voor hulp bij TEM Beeldacquisitie.
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)) (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
(2-(2-pyridinyldithio)ethanamine) (PDEA) | GE Lifesciences | BR100058 | |
0.5 mL black microtubes | Sigma-Aldrich | Z688304-500EA | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457C-25mg | |
Acclaim PepMap 50 μm x 150mm, C18, 2 μm, 100 Å | ThermoFisher Scientific | 164561 | |
Acetic acid glacial | Fisher | A38SL-212 | |
Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
Amine reactive 2nd generation (AR2G) tips | Forte Bio | 18-5092 | |
Ammonium bicarbonate | Fisher | A643-500 | |
Anotop 10 syringe filter, 0.02um | GE Lifesciences | 6809-1002 | |
BLItz System | Pall Forte Bio | 45-5000 | |
Boric acid | Fisher Scientific | 10043-35-3 | |
Capillary Morphogenic Gene-2 | Protein produced and purified in-house | ||
Carbon coated Cu 300 grid | Electron Microscopy Sciences | CF300-CU-50 | |
Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT25 | |
Formic acids | JT Baker | 0129-01 | |
Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505-100G | |
Iodoacetamide | MP-BioMedicals,LLC | 100-351 | |
JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JEOL | ||
L-cystiene hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | C121800-5G | |
Lethal Factor N-terminal domain | Protein produced and purified in-house | ||
MS software version 2.2 | ThermoFisher Scientific | ||
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 090M14531V | |
Orbitrap Fusion Lumos | ThermoFisher | ||
PCR tubes | ThermoFisher Scientific | AB-0620 | |
Pelco easiGlow glow discharge cleaning system | Ted Pella, Inc | 91000 | |
Protective Antigen prepore | Protein produced and purified in-house | ||
Qualitative filter paper circles | Fisher Scientific | 09-795C 5 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Sequest HT search engine | ThermoFisher Scientific | ||
Sodium acetate trihydrate | Fisher Scientific | BP334-500 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
Sodium cholate | Sigma-Aldrich | C1254-100G | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-10 | |
Uranyl formate (UF) | Electron Microscopy Sciences | 22450 | |
Xcalibur | ThermoFisher Scientific | OPTON-30487 |