Summary
Analisi di isotopi stabili carbonio e ossigeno di carbonato di smalto del dente umano e animale sono stato utilizzato come proxy per dieta individuale e di ricostruzione ambientale. Qui forniamo una descrizione dettagliata e documentazione visiva di massa e sequenziale del dente smalto campionamento, come pure il pretrattamento dei campioni paleontologici e archeologici.
Abstract
Stabile analisi di isotopi di carbonio e ossigeno di carbonato di smalto del dente umano e animale sono stato applicato nella ricerca paleoambientali e paleodietary, paleoecological, periodi storici risale a più di 10 milioni anni fa. Approcci alla rinfusa forniscono un campione rappresentativo per il periodo di mineralizzazione dello smalto, mentre campioni sequenziali all'interno di un dente possono monitorare cambiamenti dietetici e ambientali durante questo periodo. Mentre queste metodologie sono stati ampiamente applicate e descritte in archeologia, ecologia e paleontologia, non ci sono stati nessun linee guida esplicite per aiutare nella scelta delle attrezzature di laboratorio necessarie e per descrivere accuratamente il campionamento laboratorio dettagliate e protocolli. In questo articolo, abbiamo documento testualmente e visivamente, l'intero processo dal campionamento attraverso lo screening di pretrattamento e diagenetiche per rendere la metodologia più ampiamente disponibili ai ricercatori considerare la sua applicazione in una varietà di regolazioni del laboratorio.
Introduction
Analisi stabile degli isotopi di carbonio e ossigeno di carbonato dello smalto del dente è stato utilizzato per studiare passato ingestione dietetica umana, lo svezzamento e mobilità, così come affidarsi faunistica di vegetazione, il movimento di animali e bestiame foddering. Queste applicazioni sono state ampiamente discusse e recensione per una varietà di condizioni ambientali che indica gli effetti dell'aridità locale, temperatura, fonti d'acqua e vegetazione composizioni1,2, 3,4,5,6. La diversità delle potenziali applicazioni in archeologia e paleontologia, così come la buona conservazione del carbonato di smalto del dente, ha reso un materiale molto interessante per isotopo stabile lavoro3. Metodi di campionamento, pretrattamento e diagenesi screening sono brevemente descritti in una serie di precedenti pubblicazioni1,7. Tuttavia, rimangono in gran parte non disponibile, in particolare a persone di fuori di laboratori di scienza archeologica e tra gruppi di laboratorio con risorse limitate, dove sta aumentando l'interesse nell'uso di questa tecnica approfondite dimostrazioni verbali e visive 5.
Lo smalto dei denti è principalmente costituito da idrossiapatite (bioapatite) cristalliti8 più grande di quelli in osso, rendendolo più resistente a sostituzioni ionico diagenetiche post mortem e contaminazione3. Studi moderni hanno dimostrato che carbonio stabile dell'isotopo (δ13C) misure del dente faunistica dello smalto in modo affidabile record animale dieta e comportamento9,10. Il valore di isotopo (δ18O) ossigeno stabile dello smalto dei denti è determinato dalla composizione isotopica dell'ossigeno dell'acqua ingerita, che include l'acqua nella pianta e alimenti di origine animale, acqua potabile, respirazione, nonché vari impatti ambientali sull'acqua che può portare a ulteriore frazionamento isotopico (ad es., aridità, quantità di precipitazioni, temperatura, altitudine, posizione continentale)11. Questo ha reso un metodo popolare per la ricostruzione dietetico ed ambientale nella ricerca archeologica, paleoecological e paleontologica.
Il periodo di formazione dello smalto dentario è relativamente breve (anni) e si differenzia a seconda del dente campionato. Per gli esseri umani, primo molare smalto detossinarsi tra nascita e 3 anni di età, premolari mineralizzano tra 1,5 e 7 anni di età, secondi molari mineralizzano tra 2,5 e 8 anni di età e terzi molari mineralizzano durante l'adolescenza, tra i 7 e i 16 anni12 . Dato che forme di smalto del dente in modo incrementale nel corso del suo periodo di formazione, possono essere campionata in massa lungo l'asse di crescita intero o campionamento in sequenza al fine di studiare i cambiamenti nella dieta e l'ambiente che si sono verificati durante il periodo di formazione13 . Il cambiamento dietetico ordinati cronologicamente all'interno di un determinato dente è osservabile per gli esseri umani e altri animali1,14, fornendo informazioni sulle inter-annuale variazione stagionale e dietetici.
Mentre lo smalto è solitamente resistente alla diagenesi, isotopiche modifiche risultanti dall'ambiente di sepoltura sono possibili e sono state osservate15,16, facendo verifiche sperimentali e pretrattamento scelte utili. Anche se non è l'unico metodo disponibile, spettroscopia a infrarossi trasformata di Fourier (FTIR), specialmente in modalità di trasmissione attenuato, è emerso come un rapido, poco costoso e relativamente accessibile metodo per la valutazione tafonomica alterazione nello smalto dei denti, specialmente in contesti paleontologico17,18,19,20. Tuttavia, dettaglio i protocolli e gli standard di registrazione rimangono relativamente inaccessibili per molte persone fuori i campi della scienza geochimica o materiale.
Tempi di reazione e le sostanze chimiche impiegate dai ricercatori nel pretrattamento dello smalto dei denti anche variano considerevolmente nella letteratura, spesso con limitata considerazione quanto a che cosa può fare questa variabilità per carbonio stabile e i valori dell'isotopo dell'ossigeno del campione21 ,22. Qui, segnaliamo un approccio che usi diluire acido acetico (0.1 M) per il pretrattamento dei campioni di polvere di smalto. Tuttavia, dato che le differenze nelle misurazioni isotopiche derivando dal pretrattamento sono relativamente minori per lo smalto dei denti, è meglio per i ricercatori di seguire i protocolli per i DataSet con cui desiderano confrontare i loro dati a11. Inoltre, dove piccoli campioni sequenziali sono prese, in particolare sui campioni dell'Olocene, nessun pretrattamento può essere scelti (a seguito di test pilota diagenetici) per evitare lo spreco di campione.
Anche se i metodi che segnaliamo qui non sono affatto nuovi, a nostra conoscenza, questa è la prima volta che una documentazione approfondita di scritta e visiva di massa e campionamento sequenza, pretrattamento scelte e metodi di controllo diagenetica (sotto forma di FTIR) per dente smalto sono state apportate ampiamente disponibile un variegato pubblico accademico. Mentre ci auguriamo che i nostri sforzi farà questo approccio più facilmente accessibile a un più ampio numero di individui e laboratori, i ricercatori che vogliono applicare e pubblicare questa tecnica devono essere consapevoli di minimo reporting standard, considerazioni diagenetiche, e requisiti di presentazione monitorata altrove20, come pure la potenziale complessità interpretativa che saranno unici per la loro regione di studio, taxa analizzati e tempo periodo5.
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Protocol
Il seguente protocollo segue le linee guida del laboratorio di spettrometria di massa isotopo luce presso il Max Planck Institute per la scienza della storia umana. Autorizzazioni appropriate etica dai comitati nazionali e internazionali dovrebbero essere cercate per le analisi che coinvolgono in pericolo esemplari faunistici moderni o storici e per l'uso di materiale archeologico e faunistico di interesse agli stakeholder contemporaneo . In questa carta, i campioni utilizzati sono stati esemplari fossili e archeologici. Nessun essere umano vivente sono stato utilizzato in questo studio e autorizzazioni completo etiche, istituzionali e governative sono state acquisite per qualsiasi analisi distruttive.
1. campionamento di massa
Nota: Per gli esseri umani e gli animali, il metodo di base di massa lo smalto dei denti il campionamento è l'applicazione di un trapano al bordo vestibolare del dente.
- Pulire la superficie esterna del dente (~0.1 mm) con un colpo di blaster di alluminio o di abrasione delicata utilizzando il trapano set-up. Utilizzare un trapano a mano con un trapano pulito punta di diamante (Vedi sotto), un po' di forma anche, attaccata tramite un mandrino trapano set-up. Garantire che all'abrasione delicata e perfino viene eseguita come una scanalatura parallela all'asse di crescita intero (Figura 1 e Figura 2).
- Cercare, ove possibile, di applicare il metodo per la stessa porzione di dente per ogni essere umano o animale sottoposto a campionamento.
Nota: Nella ricerca umana paleodietary, terzi molari sono generalmente favoriti come rappresentante del tardo giovanile/adulta dieta mentre primi molari sono evitati a causa di effetti23di svezzamento. Il dente preferito per ogni taxon e il periodo di vita rappresentato, varierà con i campioni disponibili e la domanda in fase di studio. - Trapano in una stanza ben ventilata mentre indossa una mascherina per evitare l'inalazione di polvere di smalto del dente. Indossare occhiali per proteggere gli occhi. Essere consapevoli del fatto che la quantità di polvere di campione forata variano a seconda l'attrezzatura utilizzata per l'analisi, protocollo di pretrattamento e dimensioni del dente. Trapano a bassa velocità per evitare il riscaldamento del campione.
Nota: Approssimativamente, 4-8 mg di polvere di campione è un obiettivo adatto per analisi multiple utilizzando un sistema di preparazione e introduzione di gas online per spettrometria di massa di rapporto isotopico e diagenetici test. Essere consapevoli del fatto che la velocità del trapano selezionate dipenderà la fragilità del campione e richiederà un certo livello di tentativi ed errori. In generale, su un trapano a mano, due delle cinque barre di forza sono sufficienti. Perforare la polvere di dente sopra un pezzo di carta stagnola pulita o carta di pesatura. - Raccogliere la polvere risultante di smalto e trasferirlo in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga che è stata tarata su un bilanciamento accurato in modo appropriato prima della foratura. Etichettare ogni provetta con l'indicazione di esempio (Figura 3). Registrare il peso di numeri e lo smalto di campione in un quaderno di laboratorio, nonché una banca dati elettronica.
- Prima di forare ogni dente nuovo, pulire le punte utilizzate prima usando 0,5 M HCl su un tessuto robusto. Poi lavare la punta del trapano con un solvente organico (ad esempio acetone, metanolo o etanolo) utilizzando un tessuto robusto.
- Dopo una foratura seduto, pulire l'area di lavoro accuratamente utilizzando un apposito aspiratore, o una scopa e paletta. Pulire lo spazio di campionamento con metanolo. Vuoto o leggermente spruzzare il trapano ad aria compressa per rimuovere la polvere polvere e campione tra i campioni.
2. sequenza campionamento
Nota: Campionamento sequenza può essere affrontato in una varietà di forme e dipenderà il taxon campionato, la dimensione del dente, come pure la risoluzione temporale desiderata.
- Pulire la superficie del dente campionata rimuovendo un molto sottile (~0.1 mm) strato di smalto esterno.
- Forare i campioni lungo la superficie buccale perpendicolare all'asse di crescita del dente, che dallo svincolo di radice di smalto alla sommità della corona. Trapano fasce orizzontali perpendicolari all'asse di crescita, con ciascun campione risultante in una scanalatura larga 1-2 mm tra lo strato di smalto (Figura 1 e Figura 4). Prestare attenzione per evitare la perforazione attraverso lo smalto in dentina come esso potrebbe contaminare il campione e la misura risultante.
Nota: Il numero di campioni prelevati varierà a seconda della risoluzione desiderata ma c. 10 rappresenta un obiettivo adatto per studiare i cambiamenti stagionali in δ13C e i valori δ18O per una hypsodont la dimensione di bovini domestici. - Scegliere la punta del trapano appropriato per ciascun campione, come la larghezza della linea di campionamento è determinata dal diametro della fresa.
- Utilizzare un set-up impianto di perforazione per i denti più delicati che richiedono un maggior numero di campioni elementari (Figura 2) (ad es., denti umani), come pure per foratura più stabile. Impostare il supporto di rig che tiene saldamente, il trapano con la punta rivolta verso il basso.
Nota: Mentre quattro campioni possono essere facilmente ottenuti da un molare umano permanente utilizzando un approccio manuale24, più raffinata di campionamento richiede un rig o CO2 laser ablazione approccio che non sarà discusso qui14. Un altro approccio comune è quello di utilizzare un semi-automatico Microcampionamento25. - Tenere il dente o collegare ad un morsetto. Premere lo smalto dei denti contro la punta del trapano e applicare una pressione. I campioni sono forati in modo incrementale lungo la superficie buccale dall'apice (superficie occlusale) alla base della corona nella posizione della giunzione smalto-radice (ERJ). Replicare lo stesso campione di strategia più volte ogni consecutivi linea parallela alla linea precedente campione di perforazione di perforazione. Usare una punta di piccolo diamante cilindrica per denti delicati, come ad esempio molari di pecora, con un diametro di 1 mm (Figura 1).
- Misurare la distanza di ogni linea di campionamento da ERJ utilizzando pinze e registrare questa distanza per il confronto.
- Seguire i passaggi 1.3-1.6 sopra.
Nota: Se piccoli denti delicati vengono analizzati e non vengono applicati metodi di pretrattamento e diagenetici check, campioni piccoli come 1-4 mg produrrà risultati affidabili su un assetto di preparazione e introduzione di gas on-line per l'analisi di carbonato. Sistemi automatizzati-peripheral modificati possono facilitare l'utilizzo di pesi campione ancora più bassi, ma inevitabilmente sono limitate dalla proporzione di carbonato nel studiato smalto (4-5% in peso)26,27. I ricercatori dovrebbero consultarsi con il laboratorio dove campioni stanno per essere misurate per determinare la quantità di campione richiesto.
3. Metodo Fourier Transform Infrared spettrometria/attenuata riflettanza totale
- Per il metodo di riflettanza totale attenuata, stabilire una priorità bassa camera campione, o sotto vuoto o in condizioni atmosferiche normali.
- Posto a circa 1 mg di smalto dei denti sopra il cristallo di diamante nel pozzetto di misurazione utilizzando una spatola. Abbassare e fissare il perno di campione fino a quando c'è un collegamento costante tra il post, il campione e la piastra di diamante. Chiudere la camera del campione, con o senza vuoto viene stabilita, a seconda del set-up o la disponibilità.
- Misurare gli spettri FTIR del campione 64 volte per il numero d'onda comprese tra 400 e 4.000 cm-1. Il numero desiderato di ripetizioni variano in base agli obiettivi dello studio, anche se l'analisi di tre repliche, idealmente con diverse aliquote essere preso e poi siamo tornati al tubo del microcentrifuge alloggiamento il campione, assicura risultati di robuste.
- Pulire la spatola con metanolo tra ciascuna aliquota e tra ogni campione.
- Eseguire una correzione della linea di base utilizzando il software disponibile. Il software sottrae automaticamente lo sfondo di camera campione dal profilo FTIR risultante. Per garantire la migliore riproducibilità, solo smalto spettri con un assorbimento minimo di 0,06 per la band più alta di fosfato in ~1035 cm-1 dovrebbero essere presi in considerazione.
- Monitorare la presenza di calcite carbonato inquinante secondario comune in tutti i campioni di controllo per un picco a 711 cm-1.
- In seguito all'analisi, attentamente tornare i campioni alla loro microcentrifuga utilizzando una spatola o aspirazione periferica e girare in fase di pretrattamento o analisi successiva.
- Esportare i dati grezzi di lunghezza d'onda e intensità come file CSV (o simili) e utilizzare per calcolare gli indici di interesse (indici comunemente utilizzati includono A-sito fosfato indice, B-sito fosfato Index, indice cristallinità di fosfato, acqua-ammide sull'indice di fosfato, e CO3/PO4 indice17,18,19) (tabella 1).
- Confronta il FTIR risultati da campioni di fossili o archeologici a crescente DataSet dello smalto dei denti faunistica moderno ora disponibili nella letteratura19,20 per determinare la natura e l'entità dell'alterazione diagenetica alla smalto a campionamento.
4. semplice acido acetico (0.1 M) pretrattamento
- Pesare la polvere di smalto per ogni campione in una provetta da microcentrifuga utilizzando un equilibrio come appropriato. Etichetta del tubo di conseguenza. Smalto in polvere deve essere macinato nella stessa misura, con particelle di dimensioni simili.
Nota: Molti ricercatori utilizzano un agente ossidante, come candeggina diluita (NaClO) o 30% perossido di idrogeno (H2O2) per rimuovere sostanze organiche da un campione e questo deve essere aggiunto a questo punto. Tuttavia, non solo possono alterano questi reagenti il carbonio stabile e i valori dell'isotopo dell'ossigeno di un campione, ma spettri dei campioni del collagene dell'osso in un sistema di preparazione e introduzione di gas on-line dimostrano che l'acido fosforico di 100% utilizzato in carbonato misura non reagisce con campioni biologici (Figura 5), suggerendo che questo passaggio non è necessario. - Aggiungere 0,1 mL di acido acetico 0,1 M (per 1 mg di smalto) per ogni campione con una pipetta. Evitare di toccare i campioni con la pipetta. Se il campione e la pipetta di entrare in contatto, è possibile utilizzare una pipetta per il campione successivo per evitare la contaminazione incrociata.
- Agitare, mediante agitazione o un agitatore elettronico (Figura 3) e poi lasciare i campioni a sedere per 10 min. polvere di smalto non deve essere lasciato in acido acetico per un periodo di tempo prolungato (> 4 h).
- Posizionare i campioni in una microcentrifuga per 2 min a 13.700 x g.
Nota: Un'alternativa di basso costo è l'uso di una mini-centrifuga per 4 min a 3.500 x g, che detiene meno campioni, ma è molto meno tempo quando si tratta di insiemi di grandi campioni. - Quando si interrompe il programma microcentrifuga, sostituire l'acido acetico con 2 mL di acqua ultrapura usando una pipetta pulita, quindi microcentrifuga i campioni per 2 min a 13.700 x g.
- Cambiare l'acqua ultrapura altre due volte, come prima e test per la neutralità. Rimuovere il liquido rimanente utilizzando una pipetta (senza disturbare il surnatante).
Nota: Un totale di tre lavaggi con acqua ultrapura è la procedura standard per raggiungere la neutralità. Il campione deve essere lavato fino al raggiungimento della neutralità. - Tagliare i fogli di Parafilm (1 × 1 cm) e mettere sopra ogni tubo del microcentrifuge. Fare un piccolo foro al centro con un oggetto appuntito, in modo che il campione si asciuga in modo appropriato.
- Disporre le provette in un congelamento essiccatore per rimuovere il liquido residuo.
Nota: Se un congelamento essiccatore non è disponibile, dolce forno asciugatura (40 ° C) è anche una possibilità e non dovrebbe avere effetti negativi sul carbonio stabile e dati dell'isotopo dell'ossigeno. - Una volta asciutto, rimuovere il Parafilm e chiudere i coperchi microcentrifuga. Assicurarsi che il tubo di etichettatura sia corretto e ri-scrivere se necessario.
Nota: Questa è la fase finale prima del deposito per la pesatura di fuori, che nei laboratori con fondi limitati può essere la fase finale prima della distribuzione dei campioni per analisi altrove.
5. pesatura e la misurazione di campioni e Standards
- Con una spatola, pesare circa 2 mg di polvere di smalto su un disco stagno su un equilibrio sensibile a 0,001 mg (Figura 6). Quindi trasferire con cautela il campione in una fiala di vetro borosilicato resistente all'acido fosforico. Questa quantità di smalto è necessario per produrre risultati affidabili a causa della percentuale relativamente modesta di carbonato nello smalto dei denti.
- Pulire la spatola tra campioni usando il metanolo e utilizzare un disco fresco, pulito o pesata nave per ciascun campione.
- Pesare 0,2 mg di livello internazionale quali AIEA NBS18, AIEA 603, AIEA CO8 o Merck CaCO3. Un House standard effettuato in smalto omogeneizzato di un grande dente può essere utilizzato come pozzo20. Per un'esecuzione completa di 76 campioni e, standard uso 61 campioni e 15, che deve essere ripartito uniformemente su tutta la corsa. Parecchi studi hanno riferito il numero appropriato di norme e dettagli nella ricerca archeologica20,28.
Nota: Il pretrattamento ripetuto e analisi di uno smalto in standard della casa, attraverso un numero di esecuzioni di campioni archeologici, è anche probabile che forniscono una misura appropriata di precisione per i campioni in fase di Studio20. - Serrare i coperchi appositamente progettato, accessibili per l'ago fino a quando il setto è stretto ma non risucchiato nel flaconcino. Non stringere eccessivamente il coperchio come la pressione sul setto otterrà troppo forte e in ultima analisi, può provocare un ago rotto durante l'analisi. Posizionare le fiale in un ordine elencato all'interno di un blocco di riscaldamento a 70 ° C. L'ordine e i pesi dei campioni devono essere registrati in modo affidabile per l'ingresso nel software del computer.
- Misurare i campioni seguendo tre passi: 1) a filo riempire i campioni con elio puro, 2) aggiungere acido fosforico, 3) misurare il campione.
- Lavare i campioni con elio puro (grado 5.0) con un flusso di 100 mL/min per 5 min scovare aria ambiente.
- Aggiungere 4-5 gocce di acido fosforico (99%, densità 1,85 g/mL) al campione contenenti carbonato. Reazione tra il campione e la H3PO4 comincia. Durante la reazione di CO2 è uscito che trasporta il valore isotopico dello ione carbonato CO32 - del campione.
- Attendere 1 h per campione per l'equilibratura di CO2 è raggiunto. Dopo 1 h, i campioni dovrebbero essere misurati per ottenere risultati affidabili. Durante l'acquisizione, una miscela di gas campione e passare al dispositivo. Una fase di asciugatura rimuove l'acqua da una miscela di gas campione.
- Misurare l'esempio iniziando con tre picchi di gas di riferimento di CO2 con una composizione isotopica conosciuta. Intensità di picco dovrebbe essere 4000 mV per abbinare l'intensità dei picchi del campione (tra 4000 e 8000 mV). Le tre cime di gas di riferimento dovrebbero essere 20 s lunga e 30 s apart. Seguire con definisce l'intervallo di misurazione del campione. Misurare il campione 10 volte per 5 s ciascuno e 55 s apart. Garantire che altezza picco diminuisce con il tempo che indica il corretto trasporto della miscela campione/Elio (Figura 5).
Nota: Durante la misurazione, il software calcola la composizione isotopica del campione confrontando il valore noto isotopica, l'altezza del picco e area del picco del gas riferimento con l'altezza di picco e area dei picchi dei campioni. Il crudo 13C /12C e 18O /16O composizione del campione è calcolata.
- Normalizzare i campioni dopo la misurazione.
Nota: Questo è importante perché il gas di riferimento non subisce lo stesso percorso di chimico e fisico come il campione di gas quando introdotto nello spettrometro di massa. Pertanto, è essenziale che i campioni sono inoltre calibrati per gli standard internazionali (punto 5.3) che subiscono lo stesso trattamento fisico e chimico all'interno di una corsa come il campione stesso20. Questi standard internazionali carbonato attivare la calibrazione a due punti di campioni su una scala di misurazione internazionale delta e la valutazione della precisione e ripetibilità nell'intero tratto specificato.
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Representative Results
Utilizzando la procedura di campionamento presentata sopra, smalto incrementale bioapatite campioni sono stati preparati. L'analisi di bioapatite in smalto dipende dall'accuratezza del campionamento, alla rinfusa o incrementale. In questo caso, abbiamo scelto di presentare i risultati dei campioni archeologici (due pecore) da diverse zone climatiche. Campioni elementari sono stati analizzati da secondi molari pecore ed etichettati a partire da ERJ (Figura 4). Posizioni di campione elementare erano numerati e ogni posizione è stata misurata come la distanza in mm da ERJ (Figura 7).
Vario carbonio e ossigeno isotopo stabile risultati dalle due pecore confermano che vivevano in ambienti diversi, in questo caso una prateria tropicale (A) e una prateria a secco-steppa temperata (B), rispettivamente. 18O valori δ incrementale per pecore uno spettacolo una gamma ristretta tra 3.3 a 5.1‰, suggerendo l'ingestione di fonti d'acqua con valori simili isotopici e la mancanza di forti cambiamenti stagionali delle precipitazioni (Figura 8). Al contrario, i valori δ18O per pecore B hanno un'elevata ampiezza di variazione, che vanno da ─5.2 a ─13.1‰, che indica la forte variazione stagionale delle precipitazioni. Valori degli isotopi stabili di carbonio suggeriscono forti differenze di vegetazione ingerita tra i campioni, con pecore un avendo una dieta composta principalmente di C4 piante, mentre pecore B hanno ingerito principalmente C3 vegetazione. Queste pecore sono stati scelti specificamente per dimostrare la variazione ambientale evidente in ossigeno incrementale e risultati di isotopo stabile del carbonio.
Denti umani allo stesso modo vengono campionati dall'ERJ alla corona lungo l'asse di crescita. Incrementale δ18O e i valori δ13C per un dente umano da un ambiente di foresta pluviale sono altamente vincolati, all'interno di una gamma di 2‰. Ciò suggerisce una mancanza di variazione nelle strategie di foraggiamento durante il periodo di mineralizzazione dello smalto (Figura 9).
Figura 1: un dente di perforazione. (A) la foto di un dente che è perforata in un rig impostato. (B) foto di polvere di smalto essere raccolti in carta stagnola e inseriti in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga (con etichetta appropriata). (C) foto di diverse punte disponibili per campionamento incrementale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: impostare Rig up. Foto di rig istituito con il trapano nel posto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: preparazione dei campioni. Esempio di essere inseriti in una provetta da centrifuga micro e agitato su un vortice dopo che sono stati aggiunti prodotti chimici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: campionate in modo incrementale i denti pecore. Denti delle pecore (A e B) che sono stati provati in modo incrementale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: cromatogramma di eseguire gasbench. Foto di un cromatogramma del una campione visualizzazione intensità di riferimento gas cime e picchi di campione nel corso del tempo. Le masse rilevate sono 44, 45 e 46. Le prime tre cime sono CO2 riferimento gas picchi con una composizione isotopica conosciuta. Dieci cime che seguono sono picchi di esempio diminuendo di intensità. Picchi sempre devono essere separati da diversi secondi per garantire una rigorosa discriminazione tra le vette e quindi un'integrazione di picco pulito. Numeri in cima a ogni stato di picco il tempo (s) di rilevamento di picco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: pesatura carbonato campione. Foto del campione è attribuita la ponderazione in fiale di vetro con una spatola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: campioni elementari su un dente di pecore. Campioni elementari lungo l'asse di crescita del dente dall'ERJ nella parte superiore della corona complottato insieme a carbonio e ossigeno isotopo stabile valori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: smalto pecore carbonato degli isotopi. Valori di isotopo di ossigeno e carbonio per i denti due pecore in modo incrementale campionata stabili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: smalto umano degli isotopi del carbonato. Valori stabili di isotopo ossigeno e carbonio per un dente umano in modo incrementale campionato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| PCI (indice di cristallinità del fosfato) |  |
Sponheimer e Lee-Thorp, 1999b |
| altri nomi: | ||
| CIIR (cristallinità indice infrarosso) | Shemesh, 1990 | |
| IRSF (infrarossi spaccare fattore) | Weiner e Bar-Yosef, 1990 | |
| BPI (B-carbonato sull'indice di fosfato) |  |
LeGeros, 1991 |
| API (A-carbonato sull'indice di fosfato) |  |
Sponheimer e Lee-Thorp, 1999b |
| BAI (quantità relativa di carbonato di B-A-sito) |  |
Sponheimer, 1999; Sponheimer e Lee-Thorp, 1999b |
| WAMPI (acqua-ammide sull'indice di fosfato) |  |
Roche et al., 2010 |
Tabella 1: indici empirici che caratterizzano le proprietà chimico-cristallo di smalto bioapatite. Si consiglia di utilizzare gli indici empirici da Sponheimer (1999), Sponheimer e Lee-Thorp (1999) e Roche et al. (2010) per caratterizzare le proprietà chimico-cristallo di smalto bioapatite.
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Discussion
Le sfide del successo di campionamento (massa e incrementali) della dentatura si basa sull'accesso a conoscenza per quanto riguarda tecniche di perforazione e preparazione, a fianco l'investimento in attrezzature relativamente poco costosa del campione. Queste sfide sono facilmente superabile quando chiare istruzioni sono disponibili riguardanti i metodi di campionamento e di pretrattamento. In questo articolo, speriamo di avere questi in modo chiaro e conciso diffusa per i ricercatori di nuovi a questi metodi. Gli studiosi l'applicazione di questi metodi per la prima volta dovrebbero praticare sulla fauna moderna accessibile prima dell'analisi e di preziosi campioni archeologici e paleontologici.
Il campionamento del carbonato dello smalto del dente umano e animale per analisi degli isotopi stabili è una procedura semplice che è stata intrapresa a laboratori multipli. Tuttavia, c'è una tendenza per tecniche e tecnologie connessi con la perforazione della dentatura variano da laboratorio a essere incluso in un gruppo più ampio di conoscenza tecnica che non è condiviso apertamente. Campionamento incrementale ha importanti vantaggi, permettendo l'identificazione dettagliata variabilità intra-individuale nell'ingestione dietetica e l'ingestione di acqua. Questo è illustrato da costringere le differenze tra individui provenienti da diverse regioni come dietetico ed informazione ambientale sono conservati in bioapatite lo smalto del dente. In nostri dati rappresentativi, variazione significativa isotopica è evidente tra le pecore dalle praterie tropicali rispetto alle pecore da praterie temperate a secco-steppa (Figura 8).
Fasi critiche all'interno del protocollo sono correlati alla precisione nella foratura, conservazione di smalto dei denti e tecniche di pretrattamento. Piccole imprecisioni nella foratura, ad esempio, attraverso lo smalto in dentina del dente, potrebbero causare in isotopo estremamente variabili misure29. La conservazione dello smalto dei denti può essere controllata attraverso una varietà di metodi, tra cui la percentuale di carbonato di stima di un dato campione misurato, come pure il set-up FTIR discusso qui. I ricercatori dovrebbero inoltre informare i laboratori dell'ambiente sepolcrale, in particolare se acqua-registrato o in terreni acidi, che possono influenzare la conservazione strutturale dello smalto dei denti fossili. La durezza dello smalto dei denti dovrebbe essere considerata come un indicatore iniziale di conservazione, che solo può diventare evidente durante la perforazione. Smalto che è morbido e facilmente forato suggerisce che la grata di cristallo di bioapatite può hanno degradato e deve essere verificata con FTIR o altri mezzi segnalati nella letteratura30. La variazione di pretrattamento del campione sembra provocare la variazione limitata isotopica dello smalto del dente21,22. Di conseguenza, suggeriamo l'uso di semplici protocolli (ad es., acido acetico 0,1 M per meno di 4 h seguito da lavaggio con acqua distillata).
Ci sono diverse limitazioni alla tecnica, connessa con il disegno di campionamento e interpretazione. Campioni sequenziali di perforazione è un'abilità che richiede del tempo per master. Una chiara comprensione dei taxa e dente da analizzare è essenziale nella formulazione di un disegno di campionamento2,25. Ulteriormente, foratura dei campioni può richiedere una notevole quantità di tempo per completare. Tuttavia, il risultante carbonio e ossigeno isotopo stabile valori per dentatura campionata in sequenza permettono ai ricercatori di monitorare cambiamenti dietetici e ambientali. Come questi cambiamenti sono legati alle naturali variazioni stagionali, spesso nei periodi antichi, premurosi interpretazioni che sono contestualizzati all'interno di una comprensione della variazione in insiemi di riferimento isotopico sono parte integrante di questa ricerca6.
Nell'articolo, ci hanno dimostrato campionamento incrementale e campionamento di dentatura sia umani e pecore di massa. Ulteriormente, abbiamo incaricare i ricercatori sui metodi di pretrattamento per entrambi i gruppi campione. Metodo di campionamento incrementale può applicarsi con successo alla fauna antica e moderna con simili smalto crescita e mineralizzazione (ad es., bovini e cavalli). Pretrattamento di smalto bioapatite come illustrato nell'articolo può essere utilizzato su campioni provenienti da una sezione trasversale di resti antichi. La lezione più importante da nostra procedura di campionamento è alla rinfusa e campionamento incrementale della dentatura, che non è facilmente spiegabile in un documento. Ulteriori dimostrazioni potrebbero democratizzare l'altro isotopo archeologico campionamento e approcci di pre-trattamento (ad es., osso estrazioni di collagene o il campionamento della ceramica archeologica per le misure dell'isotopo stabile degli acidi grassi) migliorando la diffusione della conoscenza e della tecnologia in questo campo. Tale democratizzazione non dovrebbe, tuttavia, essere visto come un sostituto completo per la consultazione con gli esperti, o la letteratura disponibile, per stabilire gli standard di misurazione e di interpretazione in un dato contesto20,28.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la società Max Planck per finanziare questa ricerca così come l'impostazione di recente di un laboratorio di isotopo stabile presso il dipartimento di archeologia, Max Planck Institute per la scienza della storia umana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dremel Micro | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro | |
| Diamond-tipped drill bit | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | Sigma Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de®ion=DE&gclid=EAIaIQ obChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1 wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE |
|
| Methanol | Linear Formula: CH3OH | ||
| Acetic Acid | Linear Formula: CH3CO2H | ||
| Dremel rig set-up (workstation) | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401 | |
| Mini-centrifuge | Sprout | http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4 | |
| Freeze drier | Zirbus Technology | http://www.zirbus.com |
References
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