Fotodynamische therapie (PDT) is een medische procedure waarbij de broedtijd van een exogenously toegepaste fotosensitizer (PS) gevolgd door zichtbaar licht photoactivation te induceren van apoptose. We presenteren een in vitro PDT protocol ontworpen om te simuleren van PDT die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de verschillen in PS incubatie en licht behandeling parameters.
Fotodynamische therapie (PDT) is een medische procedure waarbij de broedtijd van een exogenously toegepaste fotosensitizer (PS) gevolgd door zichtbare lichte photoactivation voor het opwekken van cel apoptosis. De Federal Drug Administration heeft goedgekeurd voor de behandeling van actinische keratose PDT en klinische richtlijnen raden PDT als behandeling voor bepaalde niet-melanoom huidkanker en acne vulgaris. PDT is een voordelige therapeutische modaliteit als low-cost, niet-invasieve, en geassocieerd met minimale bijwerkingen en schrikken. In de eerste stap van PDT is een PS toegepast en toegestaan te accumuleren intracellulair. Latere lichte bestraling induceert de vorming van reactieve zuurstof soorten, die uiteindelijk tot cel apoptosis, verstoring van de membraan, mitochondriale schade, immuun modulatie, Keratinocyt proliferatie en collageen omzet leiden kan. Hierin presenteren wij een methode in vitro studie PDT in een aanhangend cellijn. Deze behandeling-protocol is ontworpen om te simuleren van PDT en kan worden aangepast aan het bestuderen van het gebruik van PDT met verschillende cellijnen, photosensitizers, incubatie temperaturen of photoactivation golflengten. Plaveiselcelcarcinoom cellen werden geïncubeerd met 0, 0.5, 1.0, en 2 mM 5-aminolevulinic acid (5-ALA) voor 30 min en photoactivated met 417 nm blauw licht voor 1.000 s. De maatregel van de primaire uitkomst was apoptosis en de necrose, zoals gemeten door de Annexine-V en 7-aminoactinomycin D stroom cytometry. Er was een verhoging van de dosis-afhankelijke in cel apoptosis na dertig minuten incubatie van 5-ALA. Om te bereiken hoge validiteit van Inter test, is het belangrijk om consistent incubatie en lichte parameters bij het uitvoeren van in vitro PDT experimenten. PDT is dat een nuttig klinische procedure en in vitro onderzoek kan toestaan voor de ontwikkeling van nieuwe PSs, optimalisatie van protocollen en nieuwe indicaties voor PDT.
Fotodynamische therapie (PDT) is een medische procedure waarbij de broedtijd van een exogenously toegepaste fotosensitizer (PS) gevolgd door zichtbare lichte photoactivation voor het opwekken van cel apoptosis. De Federal Drug Administration (FDA) heeft goedgekeurd voor de behandeling van actinische keratose (AK) PDT en klinische richtlijnen raden PDT als behandeling voor bepaalde niet-melanoom huidkanker en acne vulgaris1,2. Opkomende niet-dermatologische toepassingen voor PDT zijn behandeling van gastro-intestinale, prostaat en gynaecologische kankers3. PDT is een voordelige therapeutische modaliteit als low-cost, niet-invasieve en geassocieerd met minimale bijwerkingen en littekens2.
In de eerste stap van PDT is een PS toegepast en toegestaan te accumuleren intracellulair2. In de Verenigde Staten, wordt actueel 5-aminolevulinic acid (5-ALA) vaak gebruikt voor de behandeling van AKs. Fase 5-ALA wordt tijdens de incubatie omgezet in protoporfyrine IX (PP-IX) via de Heem biosynthese pathway in opgenomen cellen3. Kanker en pre kanker cellen afgenomen ferrochelatase activiteit, die protoporfyrine IX (PP-IX), in het eindproduct zet, Heem. Dientengevolge, accumuleren kanker cellen PP-IX in vergelijking met normale cellen4,5. Deze opeenstapeling van PP-IX in kanker en pre-kankercellen ten opzichte van het omliggende weefsel zorgt voor PDT een gerichte aanpak met minimale bijwerkingen. Lichte bestraling leidt tot reactieve zuurstof soorten (ROS) generatie wanneer zuurstof opgewonden elektronen uit PP-IX accepteert. PP-IX heeft de absorptie van een piek in het ultraviolette spectrum met kleinere pieken in het zichtbare licht spectrum, met inbegrip van blauw en rood licht2. ROS vorming kan uiteindelijk leiden tot cel apoptosis, verstoring van de membraan, mitochondriale schade, immuun modulatie, Keratinocyt proliferatie en collageen omzet6,7,8,9 , 10.
PDT werd ontwikkeld in de jaren 1970 en is een evoluerend therapeutische modaliteit3. Het FDA-goedgekeurde protocol voor de behandeling van AKs beveelt 5-ALA huid incubatie gedurende 14 – 18 h, maar 1 tot 2 h incubations worden vaak gebruikt in de klinische praktijk2. In vitro, hebben wij aangetoond dat kortere 15 min 5-ALA incubations fibroblast cel apoptosis in vergelijking met onbehandelde fibroblasten11,12kunnen verhogen. Bovendien, worden roman chlorin, Ftalocyanine en nanoparticle gebaseerde PSs bestudeerd om PDT werkzaamheid3. Hierin presenteren wij een methode in vitro studie PDT in een aanhangend plaveiselcelcarcinoom cellen. In dit protocol, SCC-13 cellen worden geïncubeerd met 0, 0.5, 1.0, en 2 mM 5-ALA voor 30 min en photoactivated met 417 nm blauw licht voor 1.000 s. De primaire uitkomst maatregel is apoptosis en de necrose, zoals gemeten door de Annexine-V en 7-aminoactinomycin D (7-AAD) stroom cytometry. Deze behandeling-protocol is ontworpen om te simuleren van PDT en kan worden aangepast aan het bestuderen van het gebruik van PDT met andere cellijnen, photosensitizers, incubatie temperaturen of photoactivation golflengten. Voorbereiding van extra controlegroepen wellicht nodig, met inbegrip van onbevlekt, één fluorophore gekleurd, negatieve en positieve controles voor stroom cytometry. Een uitgebreid overzicht van theorie, protocollen, proefopzet en gating voor apoptosis/necrose stroom cytometry kan worden gevonden elders13.
Er was een aanzienlijke toename van de SCC-13 apoptosis na 30 min incubations van 0,5, 1 en 2 mM 5-ALA gevolgd door 1.000 s van blauw licht. Deze resultaten zijn in overeenstemming met onze eerder gepubliceerde onderzoek waaruit blijkt dat 5-ALA incubations van 30 min, gevolgd door blauw licht activering leidt tot een verhoging van de dosis-afhankelijke in het percentage van de cellen van de fibroblast ondergaan apoptosis12, 14.
Deze experimentele aanpak te bestuderen PDT heeft voordelen en beperkingen. De beschreven methoden voldoen aan klinische praktijk als een commercieel beschikbare PS en lichtbron werden gebruikt. Onderzoekers kunnen de methoden met verschillende soorten cellen, PSs, lichtbronnen en bestraling parameters aanpassen. Er zijn echter beperkingen aan deze benadering als dit protocol is ontworpen voor Adherente cellen gekweekt in een enkelgelaagde. In de klinische praktijk, verschillen in weefsel architectuur of ziekte pathologie (dat wil zeggen, hyperkeratosis of fibrose) PS absorptie kunnen afnemen of lichte penetratie15. Dientengevolge, kunnen de behandeling doses en experimentele bevindingen niet rechtstreeks overeen met klinische praktijk. Sferoïde tumor modellen en microfluidic chip zijn bestudeerd als een methode om te repliceren nauwer tumor microenvironments16,17,18. Spheroïden hebben innerlijke en uiterlijke cellulaire niches die differentieel kunnen nemen van de photosensitizers en vertegenwoordigen heterogene tumor het platform. Andere onderzoekers hebben microfluidic chips met scherm behandeling voorwaarden en vasculaire verstrekking van photosensitizers gebruikt. Microfluidic chips kunnen echter duur te ontwikkelen of moeilijk uit te voeren voor onderzoekers niet vertrouwd zijn met de techniek. Bovendien kunnen spheroïden en microfluidic-chips niet overeen met de klinische behandeling van huidkanker waarin photosensitizers direct op het oppervlak van de tumor zonder vasculaire verspreiding toegepast worden. Onderzoekers wellicht te evalueren van de voors en tegens van enkelgelaagde cultuur, sferoïde tumor modellen, en microfluidic-chips voor studeren PDT in andere ziekte systemen. Als er nog geen immune cellen of de extracellulaire matrix, is het niet mogelijk om te bepalen hoe PDT beïnvloedt complexe cel interacties. Onderzoekers wellicht in vitro experimentele resultaten met behulp van diermodellen en klinisch onderzoek te bevestigen. Om te bereiken hoge validiteit van Inter test, is het belangrijk om consistent incubatie en lichte parameters bij het uitvoeren van in vitro PDT experimenten.
Temperatuur is bekend dat de effectiviteit van PDT19wijzigen. Één studie aangetoond dat celdood, 5-ALA opname, PP-IX vorming en cytokine release kunnen worden verbeterd door het broeden van cellen met 5-ALA bij temperaturen van tot en met 44 ° C19. Incubatie temperaturen boven de 44 ° C kunnen leiden tot thermische veroorzaakte celdood en incubatie temperaturen lager dan 20 ° C mag niet leiden tot significante 5-ALA opname- en accumulatie19. Het is raadzaam dat onderzoekers PS incubations op een blok van de temperatuur-regelbare verwarming bij een constante temperatuur te controleren uitvoeren voor het potentieel verstorende thermische effecten. Daarnaast is het belangrijk om de fotosensitizer Incubeer gedurende een voldoende hoeveelheid tijd te maken voor de omzetting van 5-ALA in PP-IX. In dit protocol, werden SCC-13 cellen geïncubeerd met 5-ALA gedurende 30 minuten, die met succes cel apoptosis geïnduceerde. Wij hebben eerder aangetoond dat een 10 min incubatie van 5-ALA apoptosis in fibroblast in vergelijking met onbehandelde fibroblasten11,14niet aanzienlijk te verhogen. PP-IX begint zich ophopen in de huid van de muis na 5-ALA is incubatie gedurende zes minuten bij 37 ° C. Dus na tien minuten 5-ALA incubatietijd, er mogelijk niet voldoende accumulatie van PP-IX voor het opwekken van cel apoptosis20. Wij raden een minimale incubatietijd van 20 tot 30 min voor 5-ALA op basis van onze vorige studies11,14. Onderzoekers wellicht optimaliseren incubatieperiode op basis van het laboratorium instellen, fotosensitizer van belang, celtype en klinische indicatie. Antilichaam titratie en optimalisatie experimenten kunnen worden uitgevoerd voor de beste resultaten met behulp van richtlijnen van de fabrikanten. Andere testen van belang kunnen worden uitgevoerd na blauw licht photoactivation inclusief dihydroethidium stroom cytometrische kwantificering van ROS. 14
Variatie in de hoeveelheid licht geleverd per eenheid van oppervlakte (dat wil zeggen, bestralingssterkte) en totale bestraling dosis (dat wil zeggen, fluentie) tijdens de photoactivation fase ROS vorming en cel apoptosis21kan beïnvloeden. De relatie tussen fluentie, bestralingssterkte en tijd kan worden beschreven door de volgende vergelijking:
Fluentie (J/cm2) = bestralingssterkte (W/cm2) x tijd (s)
Zoals fluentie afhankelijk van de tijd is, kan verlenging of verkorting van de photoactivation-fasen behandeling werkzaamheid veranderen. De bestralingssterkte is evenredig aan de afstand tussen de lichtbron en het doelweefsel kwadraat. Dientengevolge, als het licht is te ver weg, er mogelijk niet voldoende licht energie geleverd aan het gerichte weefsel te prikkelen de PS. als alternatief, de bestralingssterkte kan worden verhoogd door licht weerkaatst op de omringende oppervlakken. Daarom raden we uitvoeren van lichte bestralingen met de cel cultuur platen geplaatst op een zwarte ondergrond om te voorkomen dat licht reflectie. Onderzoekers kunnen verwerven commercieel beschikbaar of FDA-goedgekeurde blauwe lichtgevende dioden en fluorescerende apparaten gebruiken in PDT experimenten, maar deze apparaten kunnen hebben verschillende vermogens en lichte veld uniformiteit. Een specifieke golflengte fotometer moet worden gebruikt voor het meten van de bestralingssterkte bij het celoppervlak en uniformiteit van de lichte veld voor elk experiment voor consistente resultaten. Een commercieel beschikbare diffuser kan worden gebruikt om te verbeteren veld uniformiteit, indien nodig.
Kortom, hebben wij beschreven een aanpak in vitro onderzoek naar PDT door detaillering theorie, experimentele methoden, beperkingen, potentiële valkuilen en aanbevelingen voor optimalisatie. PDT is dat een nuttig klinische procedure en in vitro onderzoek kan toestaan voor de ontwikkeling van nieuwe PSs, optimalisatie van protocollen en nieuwe indicaties voor PDT.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Keratinocyte serum free medium | Thermofisher | 17005042 | Culture medium for SSC-13 cells |
DMEM low glucose glutamax | Thermofisher | 10567022 | Possible culture medium for other cell types |
6-well culture plates | Thermofisher | 720083 | |
PBS | Thermofisher | 14190250 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25200056 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | For cell counting and plating |
BLU-U light | DUSA | Request from manufacturer | Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used |
5-ALA | DUSA | Request from manufacturer | |
FBS | Atlanta Biologicals | C17032 | |
FlowCellect Annexin Red Kit | Millipore Sigma | FCCH100108 | Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer |
FACSCanto II | BD | Request from manufacturer | Any flow cytometer may be used |
Counting Chamber | Hausser | 3120 | For cell counting and plating |
FlowJo | FlowJo | Request from manufacturer | Flow cytometry analysis software |