A terapia fotodinâmica (PDT) é um procedimento médico que envolve a incubação de uma forma exógena aplicada fotossensibilizador (PS) seguido de fotoativação de luz visível para induzir apoptose. Apresentamos um protocolo em vitro PDT projetado para simular o PDT que pode ser usado para estudar as diferenças em incubação de PS e parâmetros de tratamento com luz.
A terapia fotodinâmica (PDT) é um procedimento médico que envolve a incubação de um fotossensibilizador exogenamente aplicada (PS), seguida de fotoativação de luz visível para induzir apoptose celular. O Federal Drug Administration aprovou o PDT para o tratamento de ceratose actínica e diretrizes clínicas recomendam o PDT como um tratamento para certos tipos de câncer de pele não-melanoma e acne vulgar. PDT é uma modalidade terapêutica vantajosa como é de baixo custo, não invasivo e associado com efeitos adversos mínimos e assustando. Na primeira etapa do PDT, um PS é aplicado e permitido acumular intracelular. Irradiação de luz subsequente induz a formação de espécies reativas de oxigênio, que em última análise, pode levar à apoptose celular, ruptura de membrana, dano mitocondrial, imunomodulação, proliferação de queratinócitos e volume de negócios de colágeno. Neste documento, apresentamos um método em vitro para estudo PDT em uma linhagem de células aderentes. Este protocolo de tratamento é projetado para simular o PDT e pode ser ajustado para estudar o uso do PDT com várias linhas celulares, fotossensibilizadores, temperaturas de incubação ou photoactivation comprimentos de onda. Células de carcinoma de células escamosas foram incubadas com 0, 0,5, 1,0 e 2 mM de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) por 30 min e fotoativados com 417 luz azul nm para 1.000 s. A medida de desfecho primário foi apoptose e necrose, como medido por citometria de fluxo D-anexina V e 7-aminoactinomycin. Houve um aumento dose-dependente na apoptose celular, após trinta minutos incubação de 5-ala Para alcançar alta validade inter teste, é importante manter a incubação consistente e luz parâmetros ao realizar experimentos em vitro PDT. PDT é que uma investigação clínica útil em procedimento e in vitro pode permitir o desenvolvimento do romance PSs, otimização de protocolos e novas indicações para o PDT.
A terapia fotodinâmica (PDT) é um procedimento médico que envolve a incubação de um fotossensibilizador exogenamente aplicada (PS), seguida de fotoativação de luz visível para induzir apoptose celular. O Federal Drug Administration (FDA) aprovou o PDT para o tratamento de ceratose actínica (AK) e diretrizes clínicas recomendam o PDT como um tratamento para certos tipos de câncer de pele não-melanoma e acne vulgaris1,2. Usos não-dermatológico emergentes para PDT incluem o tratamento de cânceres ginecológicos, gastrointestinais e próstata3. PDT é uma modalidade terapêutica vantajosa como é associado com efeitos adversos mínimos e cicatrizes2, baixo custo e não-invasiva.
Na primeira etapa do PDT, um PS é aplicado e permitido acumular intracelular2. Nos Estados Unidos, ácido 5-aminolevulínico tópica (5-ALA) é comumente usado para tratar a AKs. Durante a incubação, fase, 5-ALA é convertido em protoporfirina IX (PP-IX), através da via de biossíntese do hemo em células incorporado3. Células de câncer e pré-câncer diminuíram a atividade ferroquelatase, que converte a protoporfirina IX (PP-IX), o produto final, hemo. Como resultado, as células do câncer se acumulam PP-IX em comparação com células normais4,5. Esta acumulação de PP-IX em câncer e pré-câncer células em relação ao tecido circundante permite PDT ser uma abordagem orientada com mínimos efeitos adversos. Irradiação de luz leva à geração de (ROS) de espécies reativas de oxigênio quando o oxigênio aceita elétrons excitados do PP-IX. PP-IX tem uma absorção de pico no espectro ultravioleta com picos menores em todo o espectro visível da luz, incluindo luz azul e vermelha2. Formação de ROS em última análise, pode levar a apoptose celular, ruptura de membrana, dano mitocondrial, imunomodulação, proliferação de queratinócitos e colágeno volume6,7,8,9 , 10.
PDT foi desenvolvido na década de 1970 e é uma evolução da modalidade terapêutica3. O protocolo aprovado pelo FDA para o tratamento de AKs recomenda incubação de 5-ALA pele de 14 – 18 h, mas incubação do 1 a 2 h é comumente usadas na prática clínica2. In vitro e mostramos que mais curta incubação do 5-ALA de 15 min pode aumentar apoptose celular de fibroblasto comparado com fibroblastos não tratados11,12. Além disso, romance chlorin, ftalocianina e PSs baseados em nanopartículas estão sendo estudados para melhorar a eficácia de PDT3. Neste documento, apresentamos um método em vitro para estudo PDT em um carcinoma de células escamosas aderente as células. Neste protocolo, SCC-13 células são incubadas com 0, 0,5, 1,0 e 2 mM 5-ALA por 30 min e fotoativados com 417 luz azul nm para 1.000 s. A medida de resultado primário é a apoptose e necrose, como medido por citometria de fluxo-anexina V e 7-aminoactinomycin D (7-AAD). Este protocolo de tratamento é projetado para simular o PDT e pode ser ajustado para estudar o uso do PDT com outras linhas celulares, fotossensibilizadores, temperaturas de incubação ou photoactivation comprimentos de onda. Preparação de grupos de controle adicionais pode ser necessária, incluindo o fluoróforo imaculado, único manchado, controles negativos e positivos por citometria de fluxo. Uma revisão abrangente da teoria, protocolos, delineamento experimental e gating para apoptose/necrose citometria de fluxo pode ser encontrada em outro lugar13.
Houve um aumento significativo na apoptose SCC-13 após incubação do 30 min de 0,5, 1 e 2 mM 5-ALA seguido por 1.000 s da luz azul. Estes resultados são consistentes com nossa pesquisa publicada anteriormente, demonstrando que a incubação do 5-ALA de 30 min, seguido por ativação de luz azul leva a um aumento da percentagem de células de fibroblastos submetidos à apoptose12, dose-dependente 14.
Esta abordagem experimental para estudar PDT tem vantagens e limitações. Os métodos descritos em conformidade com a prática clínica como um PS comercialmente disponível e fonte de luz foram usados. Pesquisadores podem personalizar os métodos com diferentes tipos de células, PSs, fontes de luz e parâmetros de irradiação. No entanto, existem limitações dessa abordagem como este protocolo é projetado para células aderentes cultivadas em uma monocamada. Na prática clínica, as diferenças na patologia tecido arquitetura ou doença (ou seja, hiperqueratose ou fibrose) podem diminuir a absorção de PS ou penetração15de luz. Como resultado, as doses de tratamento e conclusões experimentais podem não corresponder diretamente à prática clínica. Modelos de tumor esferoide e microfluidic chip têm sido estudados como métodos para replicar mais estreitamente tumor microambiente16,17,18. Esferoides têm nichos celulares internos e externas que podem incorporar os fotossensibilizadores diferencialmente e representam a arquitetura do tumor heterogêneo. Outros pesquisadores usaram microfluidic chips para condições de tratamento de tela e entrega vascular de fotossensibilizadores. No entanto, microfluidic fichas podem ser caro para desenvolver ou difíceis de implementar para os investigadores não estão familiarizados com a técnica. Além disso, esferoides e microfluidic chips podem não refletir o tratamento clínico de cancros da pele em que fotossensibilizadores são aplicados diretamente para a superfície do tumor sem disseminação vascular. Pesquisadores podem ser necessário avaliar os prós e contras de cultura monocamada e modelos de tumor esferoide microfluidic fichas para estudar PDT em sistemas diferentes de doença. Como não existem células imunes ou matriz extracelular, não é possível determinar como PDT afeta as interações célula-célula complexas. Pesquisadores podem precisar confirmar em vitro resultados experimentais usando modelos animais e ensaios clínicos. Para alcançar alta validade inter teste, é importante manter a incubação consistente e luz parâmetros ao realizar experimentos em vitro PDT.
Temperatura é conhecida por alterar a eficácia do PDT19. Um estudo demonstrou que a morte celular, absorção de 5-ALA, PP-IX formação e liberação de citocinas podem ser melhoradas incubando-se células com 5-ALA em temperaturas acima de 44 ° C19. Temperaturas de incubação acima de 44 ° C podem levar à morte celular induzida térmica e temperaturas de incubação abaixo de 20 ° C não podem levar à absorção de 5-ALA significativa e acumulação19. Recomendamos que os investigadores realizar incubação do PS em um bloco de aquecimento temperatura ajustável a uma temperatura constante de Controlarar para confundir potencialmente efeitos térmicos. Além disso, é importante Incubar o fotossensibilizador para uma quantidade suficiente de tempo para permitir a conversão de 5-ALA em PP-IX. Neste protocolo, SCC-13 células foram incubadas com 5-ALA por 30 min, que com sucesso induziu a apoptose celular. Demonstramos anteriormente que uma incubação de 10 min de 5-ALA não aumentou significativamente apoptose em fibroblasto em relação ao controle não tratados fibroblastos11,14. PP-IX começa a acumular-se na pele de rato depois de 5-ALA está incubando durante seis minutos a 37 ° C. Portanto, após dez minutos de incubação de 5-ALA, pode não haver suficiente acumulação de PP-IX para induzir a apoptose de células20. Recomendamos um período de incubação mínimo de 20 a 30 min para 5-ALA baseado em nossos anteriores estudos11,14. Pesquisadores podem ser necessário otimizar o período de incubação, com base no laboratório de configuração, fotossensibilizador de interesse, tipo de célula e indicação clínica. Experimentos de otimização e titulação de anticorpos podem ser realizados para obter melhores resultados usando as orientações de fabricantes. Outros ensaios de interesse podem ser realizados seguindo o photoactivation luz azul, incluindo dihydroethidium quantificação fluxo cytometric ROS. 14
Variação na quantidade de luz entregues por unidade de superfície (ou seja, irradiância) e dose de irradiação total (ou seja, fluência) durante a fase de fotoativação pode afetar a formação de ROS e de apoptose celular21. A relação entre tempo, irradiância e fluência pode ser descrita pela seguinte equação:
Fluência (J/cm2) = irradiância (W/cm2) x tempo (s)
Como fluência é dependente do tempo, aumentando ou reduzindo as photoactivation fases pode mudar eficácia do tratamento. A irradiância é proporcional à distância ao quadrado entre a fonte luminosa e o tecido-alvo. Como resultado, se a luz for muito longe, pode não haver energia suficiente luz, entregada para o tecido-alvo para excitar o PS. Alternativamente, a irradiação pode ser aumentada pela luz refletindo as superfícies circundantes. Portanto, recomendamos realizar irradiações de luz com as placas de cultura de células colocadas sobre uma superfície preta para evitar a reflexão da luz. Pesquisadores podem adquirir comercialmente disponíveis ou aprovado pela FDA azuis diodos emissores de luz e dispositivos fluorescentes para uso nas experiências do PDT, mas estes dispositivos podem ter diferentes potências e uniformidade de campo claro. Um fotômetro de comprimento de onda específico deve ser usado para medir a radiação na superfície da célula e uniformidade do campo de luz antes de cada experimento para resultados consistentes. Um difusor comercialmente disponível pode ser usado para melhorar a uniformidade do campo, se necessário.
Em resumo, descrevemos uma abordagem in vitro para investigar PDT por detalhando a teoria, métodos experimentais, limitações, possíveis armadilhas e recomendações para a otimização. PDT é que uma investigação clínica útil em procedimento e in vitro pode permitir o desenvolvimento do romance PSs, otimização de protocolos e novas indicações para o PDT.
The authors have nothing to disclose.
Os autores têm sem agradecimentos.
Keratinocyte serum free medium | Thermofisher | 17005042 | Culture medium for SSC-13 cells |
DMEM low glucose glutamax | Thermofisher | 10567022 | Possible culture medium for other cell types |
6-well culture plates | Thermofisher | 720083 | |
PBS | Thermofisher | 14190250 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25200056 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | For cell counting and plating |
BLU-U light | DUSA | Request from manufacturer | Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used |
5-ALA | DUSA | Request from manufacturer | |
FBS | Atlanta Biologicals | C17032 | |
FlowCellect Annexin Red Kit | Millipore Sigma | FCCH100108 | Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer |
FACSCanto II | BD | Request from manufacturer | Any flow cytometer may be used |
Counting Chamber | Hausser | 3120 | For cell counting and plating |
FlowJo | FlowJo | Request from manufacturer | Flow cytometry analysis software |