Formålet med denne rapport er at beskrive protokollen for robust immunhistokemisk påvisning af epigenetiske markører, 5-methylcytosine (5mC) og 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) i at udvikle og postmitotic musen nethinden.
Epigenetik af retinal udvikling er en velundersøgte forskningsområde, som lover at bringe et nyt niveau af forståelse om mekanismerne af en lang række menneskelige retinal degenerative sygdomme og lokalisere nye behandlingsmetoder. Den nukleare arkitektur af musen nethinden er organiseret i to forskellige mønstre: konventionelle og omvendt. Konventionelle mønster er universel hvor heterochromatin er lokaliseret til periferien af kernen, mens active euchromatin er bosat i den nukleare interiør. Derimod er omvendt nukleare mønster unik for voksen stang fotoreceptor cellekerner, hvor heterochromatin lokaliserer til den nukleare center, og euchromatin er placeret i den nukleare periferien. DNA methylering er overvejende observeret i chromocenters. DNA methylering er en dynamisk kovalente ændring på cytosin restkoncentrationer (5-methylcytosine, 5mC) af CpG dinucleotides, der er beriget med regionerne promotor af mange gener. Tre DNA methyltransferases (DNMT1, DNMT3A og DNMT3B) deltage i methylering af DNA under udvikling. Afsløre 5mC med immunhistokemiske teknikker er meget udfordrende, bidrage til variation i resultaterne, som alle DNA-baser herunder 5mC modificeret baser er skjult i dobbelt-strenget DNA helix. Detaljeret afgrænsning af 5mC fordeling under udvikling er imidlertid meget informativ. Her, vi beskriver en reproducerbar teknik til robust immunhistokemisk påvisning af 5mC og en anden epigenetiske DNA markør 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), som colocalizes med den “åbne”, transcriptionally aktive kromatin i udviklingen og postmitotic musen nethinden.
Epigenetiske regulering af udvikling og postmitotic homeostase af musen nethinden er et spændende område for forskning, som lover at bringe en roman forståelse af biologiske mekanismer styrer retinogenesis og celle skæbne bestemmelse, celle type-specifikke metabolisk funktion samt celle patologier, celledød og regenerering1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. kromatin gennemgår dynamiske ændringer i udvikling, samt i svar på variable eksterne signaler om det er stress, metabolisk eller celle død stimuli6,14,15, 16 , 17 , 18. i mus kerner, kromatin er opdelt i aktive euchromatin og inaktive heterochromatin6,19,20. Interphase kerne, euchromatin er bosat i regionen indre af kernen boer heterochromatin linjer nukleare periferien og nucleolus. Dette mønster kaldes konventionelle og er meget bevaret i eukaryoter. Derimod har stang kerner i nataktive dyr som mus og rotter omvendt mønster hvor kernen er besat af heterochromatin i centrum omringet af euchromatin danner de yderste shell6,18, 20. Ved fødslen har stang cellekerner konventionelle nukleare arkitektur. Inversion af stang cellekerner opstår under udvikling af ombygning af konventionelle nukleare arkitektur. Under denne proces, perifere heterochromatin adskiller fra nukleare periferien og chromocenters smelter sammen til at danne en enkelt chromocenter i byens kerne6,18.
Genomisk DNA methylering deltager i at kontrollere lokale kromatin kropsbygning21. DNA methylering opstår ved 5′ position cytosin rester af CpG dinucleotides, der er beriget i regionen promotor af mange gener i mus genomer22,23,24,25,26 samt i intergenic og intron regioner, som bærer regulerende elementer27. Methylering af CpG øer i proksimale initiativtagere21,24 og CpG sekvenser i gen smagsforstærkere27,28 er vigtig for reguleringen af den dynamiske tilstand af bivalent kromatin, som indeholder mange udviklingsmæssige gener/transskription faktorer spiller vigtig rolle i udviklingen, kræft og aldring29,30,31,32,33,34 . Tre DNA methyltransferases (DNMTs) deltage i DNA methylering under musen udvikling35. Alle tre DNMTs udtrykkes under musen retinal udvikling36 og nethinden-specifikke ændringer i Dnmt gener indvirkning retinal udvikling2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) er den oxidative produkt af 5-methylcytosine (5mC) demetylering. Tre ti-elleve translokation (TET) enzymer deltage i 5mC demetylering37,38,39. Hydroxymethyl-C ændring er beriget med projektledere, gen organer og intergenic genomiske sekvenser i rig-gen og aktivt transskriberede regioner27,40.
Der er en bred vifte af beskrevne metoder til bestemmelse af skiftende DNA methylering mønstre i celler41,42,43,44,45,46, nogle af dem gør det muligt kvantificere globale ændringer af DNA methylering mens andre fokuserer på nøjagtige ændringer i CpG-rige regioner inden for initiativtagerne og smagsforstærkere. Metoder til påvisning og kvantificering af 5hmC blev også rapporteret47, herunder af Immunhistokemi13. Immunhistokemiske teknikker, hvorved robust overvågning af 5mC og 5hmC ændringer i kerner for at udvikle og postmitotic celler, er meget informativt for skildrer kromatin dynamics i situ som svar på eksterne eller interne ændringer påvirker cellerne4,13,48,49. Denne tilgang er dog tilbøjelig til at undervurdere DNA methylering og hydroxymethylation ændringer på grund af tekniske vanskeligheder forbundet med påvisning af cytosin ændringer i histologiske præparater. Dette er fordi det upolære DNA baser, herunder 5mC og 5hmC-ændret cytosin, er skjult i midten af dobbelt-strenget DNA helix50, og kræver demaskering. Dette er særligt udfordrende i frosne histologiske præparater, som kan hurtigt miste oplysende organisation af den oprindelige væv når hårde behandling anvendes.
Musen nethinden er en fremragende model for dissekere bidrag af DNA methylering neurale udvikling og postmitotic homeostase. Der er kun 6 typer for neuroner (stang og kegle fotoreceptorer, amacrine, bipolar, vandret og ganglion celler), én glial celletype (Muller glia) og en neuroepithelial celle type (retinale pigment epitel)51. Retinal celletyper blev rapporteret at have forskellige mønstre af DNA methylering18,19, som for nylig er blevet undersøgt på enkelt-base opløsning1,5,9,12. Vi har for nylig rapporteret Immunhistokemi ansøgning at afgrænse 5mC mønster af distribution inden for kerner af retinale celler og ændringer i kerner af voksen mus nethinden, hvor alle tre DNA methyltransferases er blevet fjernet af betingede målretning 7. i forhold til en række rapporter, hvor tilstedeværelsen af DNA methylering i retinale celler kunne betragtes kun som en positiv eller negativ signal i hypermethylated celler undergår apoptose, vores tilgang aktiveret afsløre specifikke kromatin ordning inden for de retinale cellekerner, som vi og flere grupper rapporterede og drøftet tidligere5,6,7,18,19,36 , 52. her, vi beskriver immunhistokemiske (IHC) teknik til påvisning af 5mC og 5hmC i frosne PARAFORMALDEHYD-fast histologiske snit i detaljer samt vise de data, som vi var i stand til at reproducere fra vores oprindelige betænkning7 .
DNA methylering og hydroxymethylation er dynamisk og reversible DNA ændringer, som modulatethe bred vifte af biologiske mekanismer i en udvikling såvel som i postmitotic celler. Her, vi beskriver en reproducerbar teknik til påvisning af 5mC og 5hmC DNA ændringer i situ ved immunhistokemiske teknik (ved hjælp af anti-5mC og anti-5hmC antistoffer) i PARAFORMALDEHYD-fast frosne dele af musen nethinden, og give retningslinjer for at forbedre og standardisere resultaterne, især når man sammenligner flere forskellige enheder. Vi tidligere brugte denne metode til at afgrænse 5mC ændringer i mus nethinden med retina-specifikke målretning af Dnmt1, Dnmt3a og Dnmt3b DNA methyltransferase gener, og rapporterede de (forventede) udtømning af 5mC mærker i deres nethinder7 .
Den kritiske trin i 5mC immunhistokemisk påvisning er optimering af behandlingen af histologiske sektioner med HCl: mindre end 15 min forbehandling ikke forventes at producere reproducerbare resultater, mens overdreven behandling med HCl ødelægger den nukleare arkitektur. Vi fandt bedst resultat efter 30 min inkubation med HCl. Vi anbefaler altid at bruge frisk fortyndet HCl og frisklavet 4% PFA løsning for DNA denaturering og retinal væv fiksering.
Du kan foretage fejlfinding af resultater, anbefaler vi for at omfatte tre biologiske replikater mens optimering 5mC signal. Mens hver enkelt sæt kan immunhistokemisk farvning generere lidt forskellige resultater (mere eller mindre lyse heterochromatic regioner), som forventes i immunhistokemisk metode, 5mC og 5hmC nukleare fordeling inden for de enkelte sæt sektioner er forventes at være meget reproducerbar, for så længe protokollen er fulgt.
Denne teknik har også begrænsning som vi konsekvent observeret variation i 5mC distribution i fotoreceptor cellekerner inden for samme afsnit. Vi fandt nogle kerner viste stærk 5mC signal, mens tilstødende cellekerner viste ingen 5mC signal. Dette er på grund af begrænsninger i demaskering 5mC antigen af HCl behandling i frosne sektioner.
Betydningen af denne teknik gør det muligt for 5mC lokalisering uden DNase og proteinase K behandling fører til bedre bevarelse af chromocenters. Denne teknik er forventes at arbejde effektivt på alle sektioner fra alle hvirveldyr dyrevæv, transporterer 5mC, 5hmC mærker og behandles med en lignende tilgang, ikke kun mus nethinden, for så længe protokollen er fulgt.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en SBIR grant (1R44EY027654-01A1).
Supplies | |||
29G1/2 ULTRA-FINE | BD Biosciences | 329461 | |
Ophthalmic scissor | Fine Science tools, Inc. | 15000-03 | |
PAP pen | RPICORP.com | 195505 | |
Microslide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Reagent | |||
Paraformaldehyde | Electron Microscope Science | 15710 | |
1x PBS | Corning | 21-031-CV | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) | VWR | 4583 | |
Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
6 N HCl | VWR analytical | BDH7204-1 | |
Tris-HCl pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
Goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
5mC | Genway Biotech | GWB-BD5190 | |
5hmC | Active Motif | 39791 | |
LaminB1 | Abcam | Ab16048 | |
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-225-1444 | |
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-585-166 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Prolong Gold Antifade medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
Equipment | |||
MICRM HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 388114 | |
Confocal microscope | Zeiss |