Syftet med denna rapport är att beskriva protokollet för robust immunhistokemisk detektion av epigenetiska markörer, 5-metylcytosin (5mC) och 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) i utvecklingen och postmitotic mus näthinnan.
Epigenetiken retinal utveckling är en väl studerat forskningsfält, som lovar att sätta en ny nivå av förståelse om mekanismerna bakom en mängd mänskliga retinala degenerativa sjukdomar och peka ut nya behandlingsmetoder. Nukleära arkitekturen av mus näthinnan är organiserad i två olika mönster: konventionella och inverterad. Konventionella mönster är universell där Heterokromatin är lokaliserad till periferin av kärnan, medan aktiva euchromatin är bosatt i det nukleära inre. Däremot är inverterad nukleära mönster unikt för de vuxna rod ljusmätare cellkärnor där Heterokromatin lokaliserar till nukleära center, och euchromatin är bosatt i nukleära peripheryen. DNA-metylering är huvudsakligen observeras i chromocenters. DNA-metylering är en dynamisk kovalent modifiering på cytosin rester (5-metylcytosin, 5mC) av CpG dinucleotides som är berikad med Regionkommittén arrangören av många gener. Tre DNA-metyltransferaser (DNMT1, DNMT3A och DNMT3B) delta i metylering av DNA under utveckling. Upptäcka 5mC med immunhistokemiska tekniker är mycket utmanande, bidrar till variation i resultat, som alla DNA-baser inklusive 5mC modified baser är dolda inom dubbelsträngat DNA spiralen. Detaljerad beskrivning av 5mC fördelning under utveckling är dock mycket informativ. Här, vi beskriver en reproducerbar teknik för robust immunhistokemisk detektion av 5mC och en annan epigenetisk DNA markör 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), som colocalizes med ”öppna”, transcriptionally aktivt kromatinet i utvecklingen och postmitotic mus näthinnan.
Epigenetisk reglering av utveckling och postmitotic homeostas av mus näthinnan är ett spännande område för forskning, som lovar att föra en ny förståelse för biologiska mekanismer som styr retinogenesis och cell öde bestämning, cell typspecifika metabolisk funktion samt cell patologier, celldöd och förnyelse1,2,3,4,5,6,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. kromatin genomgår dynamiska förändringar i utveckling, liksom svar på variabeln externa signaler om det är stress, metaboliska eller cell death stimuli6,14,15, 16 , 17 , 18. i mus kärnor, kromatin delas in i aktiv euchromatin och inaktiva Heterokromatin6,19,20. Interphase kärnan, euchromatin är bosatt i regionen inre kärnan medan Heterokromatin fodrar den nukleära periferi och nucleolus. Detta mönster kallas konventionella och är starkt bevarad i Eukaryoter. Däremot har rod kärnor i nattaktiva djur som mus och råtta inverterad mönster där kärnan är ockuperat av Heterokromatin i mitten omgiven av euchromatin bildar den yttersta skal6,18, 20. Vid födseln har rod atomkärnor konventionell nukleär arkitekturen. Inversion av rod atomkärnor uppstår under utvecklingen av ombyggnad av konventionell nukleär arkitekturen. Under denna process, perifer Heterokromatin separerar från kärntekniska periferin och chromocenters smälter samman för att bilda en enda chromocenter i centrera av nucleus6,18.
Genomiskt DNA-metylering deltar i styra lokala kromatin konformation21. DNA-metylering sker vid 5′ position cytosin rester av CpG dinucleotides som är berikad i regionen arrangören av många gener i mus genomen22,23,24,25,26 liksom i intergenic och intron regioner, som bära reglerande element27. Metylering av CpG öar i proximala initiativtagare21,24 och CpG sekvenser i gen enhancers27,28 är viktiga i regleringen av den dynamiska delstaten bivalent kromatin, som innehåller många utvecklingsmässiga gener/transkriptionsfaktorer spelar viktig roll i utveckling, cancer och åldrande29,30,31,32,33,34 . Tre DNA-metyltransferaser (DNMTs) delta i DNA-metylering under musen utveckling35. Alla tre DNMTs uttrycks under musen retinal utveckling36 och retina-specifika ändringar i Dnmt gener påverkar näthinnans utveckling2,7. Hydroxymethylcytosine (5hmC) är en oxidativ produkt av 5-metylcytosin (5mC) demetylering. Tre tio-elva translokation (TET) enzymer delta i 5mC demetylering37,38,39. Hydroxymetyl-C ändring anrikas i initiativtagare, gen organ och intergenic genomsekvenser inom genen rikt och aktivt transkriberas regioner27,40.
Det finns en mängd av beskrivs metoder för att fastställa förändrade DNA metylering mönster i celler41,42,43,44,45,46, några av dem gör det möjligt kvantifiera globala förändringar av DNA metylering medan andra fokuserar på exakta förändringar i CpG-rika regioner inom initiativtagare och smakförstärkare. Metoder för påvisande och kvantifiering av 5hmC var också rapporterade47, inklusive av immunhistokemi13. Immunhistokemiska tekniker, vilket aktiverar robust övervakning av 5mC och 5hmC förändringar i kärnor för att utveckla och postmitotic celler, är mycket informativ för avgränsar kromatin dynamics i situ svar på yttre eller inre förändringar påverkar de celler4,13,48,49. Men är detta synsätt benägna att underskatta DNA-metylering och hydroxymethylation förändringar på grund av tekniska svårigheter, i samband med att upptäcka cytosin ändringar i histologiska preparat. Detta beror på att nonpolar DNA-baser, inklusive 5mC och 5hmC-modifierade cytosin, döljs i center av dubbelsträngat DNA helix50, och kräver demaskerar. Detta är speciellt utmanande i frysta histologiska preparat, som kan snabbt förlora informativ organisation av den ursprungliga vävnaden när hårda behandling tillämpas.
Mus näthinnan är en utmärkt modell att dissekera bidraget av DNA metylering neural utveckling och postmitotic homeostas. Det finns bara 6 typer av nervceller (rod och konen fotoreceptorer, amakrina, bipolär, horisontell och ganglion celler), en glial celltyp (Muller glia) och en neuroepithelial cell typ (pigmentepitelet)51. Retinal celltyper rapporterades ha distinkta mönster av DNA metylering18,19, som nyligen har studerats vid singel-base resolution1,5,9,12. Vi rapporterade nyligen immunhistokemi för att avgränsar 5mC mönster av fördelning inom atomkärnor av näthinnans celler och förändringar i kärnan av vuxen mus näthinnan, där alla tre DNA-metyltransferaser har tagits bort av villkorlig inriktning 7. vår metod jämfört med ett antal rapporter, där närvaron av DNA-metylering i näthinnans celler kan ses bara som en positiv eller negativ signal i hypermethylated celler som genomgår apoptos, och aktiverat upptäcka särskilda kromatin arrangemang inom de retinala cellkärna, som vi och flera grupper rapporterade och diskuterats tidigare5,6,7,18,19,36 , 52. här, vi beskriver den immunhistokemiska (IHC) tekniken för att upptäcka 5mC och 5hmC i frusna PARAFORMALDEHYD-fasta histologiska snitt i Detaljer såväl som visar data, som vi har kunnat återge från vårt ursprungliga betänkande7 .
DNA-metylering och hydroxymethylation är dynamisk och reversibel DNA ändringar, som modulatethe olika sorters biologiska mekanismer i en utveckla såväl som i postmitotic celler. Här, vi beskriver en reproducerbar teknik för att upptäcka 5mC och 5hmC DNA ändringar i situ genom immunhistokemisk teknik (med anti-5mC och anti-5hmC antikroppar) i PARAFORMALDEHYD-fasta frusna snitt av mus näthinnan, och ge riktlinjer för att förbättra och standardisera resultaten, särskilt när man jämför flera olika exemplar. Vi tidigare använt denna metod för att avgränsa 5mC förändringar i mus näthinnan med retina-specifika inriktning av Dnmt1, Dnmt3a och Dnmt3b DNA methyltransferase gener, och rapporterade (förväntade) utarmning av 5mC märken i deras näthinnor7 .
Det kritiska steget i 5mC immunhistokemisk detektion är optimering av behandling av histologiska sektioner med HCl: mindre än 15 min förbehandling inte förväntas ger reproducerbara resultat, medan överdriven behandling med HCl förstör kärn arkitektur. Vi hittade bästa resultat efter 30 min inkubation med HCl. Vi rekommenderar att alltid använda färskt utspädd HCl och nygjorda 4% PFA lösning för DNA denaturering och retinala vävnad fixering.
Felsök resultat, rekommenderar vi för att inkludera tre till fyra biologiska replikat samtidigt optimera 5mC signal. Medan varje uppsättning kan immunhistokemisk färgning generera något olika resultat (mer eller mindre ljusa heterochromatic regioner), vilket förväntas i immunhistokemisk metod, 5mC och 5hmC nukleära fördelning inom den enskilda av avsnitt förväntas vara mycket reproducerbara, för så länge protokollet följs.
Denna teknik har också begränsning som vi konsekvent övervakat variabilitet i 5mC fördelning i ljusmätare cellkärnor i samma avsnitt. Vi hittade vissa kärnor som visade stark 5mC signal medan angränsande cellkärna visade ingen 5mC signal. Detta beror på begränsningar i Demaskering 5mC antigen av HCl behandling i frusna snitt.
Betydelsen av denna teknik kan 5mC lokalisering utan DNAS och proteinas K behandling leder till bättre bevarande av chromocenters. Denna teknik är förväntas arbeta kraftfullt om alla delar från alla ryggradsdjur djurvävnader, bärande 5mC, 5hmC märken, och behandlas med ett liknande angreppssätt, inte bara musen näthinnan, för så länge protokollet följs.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett SBIR bidrag (1R44EY027654-01A1).
Supplies | |||
29G1/2 ULTRA-FINE | BD Biosciences | 329461 | |
Ophthalmic scissor | Fine Science tools, Inc. | 15000-03 | |
PAP pen | RPICORP.com | 195505 | |
Microslide Superfrost plus | VWR | 48311-703 | |
Reagent | |||
Paraformaldehyde | Electron Microscope Science | 15710 | |
1x PBS | Corning | 21-031-CV | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Tissue-Tek Optical cutting compound (OCT) | VWR | 4583 | |
Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
6 N HCl | VWR analytical | BDH7204-1 | |
Tris-HCl pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
Goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
5mC | Genway Biotech | GWB-BD5190 | |
5hmC | Active Motif | 39791 | |
LaminB1 | Abcam | Ab16048 | |
Cy2 AffiniPure Goat Ant-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-225-1444 | |
Cy3 AffiniPure Goat Ant-Mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-585-166 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Prolong Gold Antifade medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
Equipment | |||
MICRM HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 388114 | |
Confocal microscope | Zeiss |