כאן אנו מציגים פרוטוקול בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח של מדינתם מטבולית. הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני יכול לעזור כדי לאפיין טוב יותר את הביקוש של ראשי תאים, עלול להוביל רפואה אישית יותר.
הדרישה המטבולית של תאים סרטניים יכולים להשפיע באופן שלילי על הישרדות, יעילות הטיפול. כיום, פילוח התרופות של מסלולים מטבוליים נבחנה סוגים רבים של גידולים. לפיכך, אפיון של סרטן תאים ההתקנה מטבולית בלתי נמנע כדי למקד את השביל הנכון כדי לשפר את התוצאה הכוללת של חולים. למרבה הצער, ברוב סוגי סרטן, שהתאים הממאירים הם די קשה להשיג במספרים גבוהים יותר, נדרשת ביופסיה רקמות. לוקמיה היא יוצאת דופן, שבו מספר מספיק של תאים לוקמיה ניתן לבודד ממח העצם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח הבאים של מצב מטבולי שלהם באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית. תאים לוקמיה מבודדות על-ידי מעבר הצבע צפיפות, אשר אינה משפיעה על יכולת הקיום שלהם. השלב הבא בטיפוח מסייעת להם להתחדש, ובכך המדינה מטבולית נמדד מצבו של תאים בתנאים אופטימליים. פרוטוקול זה מאפשר בהשגת תוצאות עקביות, מתוקננת היטב, אשר יכול לשמש עבור הטיפול אישית.
פרופיל מטבולי הוא אחד המאפיינים העיקריים של תאים, ביואנרגיה שינו עכשיו נחשבים לאחד גולת הכותרת של סרטן1,2,3. יתר על כן, שינויים בהגדרת מטבולית יכול לשמש לטיפול בסרטן על ידי מיקוד האות התמרה חושית מסלולים או מכונות אנזימטי של סרטן תאים4,5,6. בידיעה חילוף לנטייה של תאים סרטניים ולכן יש יתרון והוא יכול לעזור לשפר את הטיפול הנוכחי.
ישנן הרבה שיטות שכבר פועלת אשר יכול להעריך את הפעילות המטבולית של תאים בתרבות. לגבי גליקוליזה, ספיגת הגלוקוז נמדד על ידי תיוג רדיואקטיבי, באמצעות 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) או רמת חומצת החלב חוץ-תאית נמדד enzymatically7,8. קצב חמצון חומצות שומן הינו פרמטר נוסף מטבולית נמדדת פלמיתד שכותרתו isotopically9,10. קצב צריכת החמצן היא שיטה נפוץ לקביעת פעילות מיטוכונדריאלי בתאים11,12, יחד עם ממברנה מיטוכונדריאלי פוטנציאליים הערכה13,14, ATP/ADP (אדנוזין יונקות-טריפוספט/אדנוזין יונקות-diphosphate) יחס מידה15 או סך תאיים ATP מידה16. איתות המסלולים הידועים כדי לווסת את תהליכי חילוף החומרים יכול להיקבע על ידי חלבון quantifications, יכול לשפר את ההבנה של מדידות מטבולית17,18,19.
אולם, כל השיטות האלה למדוד רק אחת או, בתרחיש הטוב ביותר, מספר פרמטרים מטבולית אחד לטעום בו זמנית. חשוב, בו זמנית מדידה של קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב חוץ-תאית acidification (ECAR) יכולה להיות מושגת על ידי הניתוח השטף חוץ-תאית על ידי, לדוגמה, סוסון ים XFp מנתח. OCR הוא מחוון של הנשימה מיטוכונדריאלי, ECAR היא בעיקר התוצאה של גליקוליזה (אי אפשר להתעלם CO2 הפקה ואולי היא מרוממת ECAR של תאים עם פעילות גבוהה זרחון חמצוני)20. עד כה, סוגי תאים שונים נחקרו באמצעות אלה מנתחי21,22,23.
כאן נתאר הפרוטוקול עבור ניתוח חוץ-תאית השטף של תקיעות הראשי (תאים לוקמיה נגזר מן השלב hematopoietic ילדותי) של חולי לוקמיה. לפי מיטב ידיעתנו, פרוטוקול ספציפי עבור תקיעות הראשי אינו זמין עדיין.
הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר מדידת פעילות חילוף החומרים מוערך על ידי ערכים OCR, ECAR העיקרית בפיצוצים לוקמיה נגזר חולים עם לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) או לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). היתרון של מדידה באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית הוא שהם מאפשרים זיהוי פרופיל מטבולי בזמן אמת בתאים חיים. בעיקרו של ?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות המרכזים המטולוגיה לילדים הצ’כית. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק של משרד הבריאות (NV15-28848A), על ידי משרד הבריאות של הרפובליקה הצ’כית, אוניברסיטת בית החולים במוטול, פראג, הרפובליקה הצ’כית 00064203 ועל ידי משרד החינוך, נוער, ספורט NPU אני נ. LO1604.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |