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Cancer Research

原发性白血病细胞代谢谱的评价

doi: 10.3791/58426 Published: November 21, 2018

Summary

在这里, 我们提出了一个方案, 从白血病患者骨髓中分离白血病细胞, 并分析他们的代谢状态。对原代白血病细胞代谢状况的评估有助于更好地确定原代细胞的需求, 并可导致更个性化的药物。

Abstract

癌细胞的代谢需求会对生存和治疗效果产生负面影响。目前, 药物靶向代谢途径已在多种类型的肿瘤中进行了测试。因此, 对癌细胞代谢设置的描述是不可避免的, 以便针对正确的途径, 提高患者的整体结局。不幸的是, 在大多数癌症中, 恶性细胞的数量相当困难, 需要组织活检。白血病是一个例外, 在这种情况下, 可以从骨髓中分离出足够数量的白血病细胞。在这里, 我们提供了一个详细的方案, 从白血病患者骨髓中分离白血病细胞, 并随后分析他们的代谢状态使用细胞外通量分析仪。白血病细胞是由密度梯度隔离, 这不影响他们的生存能力。下一个培养步骤帮助他们再生, 因此代谢状态测量是细胞在最佳条件下的状态。该协议可以实现一致、标准化的结果, 可用于个性化治疗。

Introduction

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代谢谱是细胞的主要特征之一, 改变生物能量现在被认为是癌症123 的特征之一。此外, 代谢设置的变化可用于癌症的治疗, 靶向信号转导途径或酶机制的癌细胞 4,5,6。因此, 了解癌细胞的代谢倾向是一个优势, 可以帮助改善目前的治疗。

已经有很多方法可以评估细胞在培养中的代谢活性。关于糖酵解, 葡萄糖的摄取可以通过放射性标记来测量, 使用 2-枯草 (2-(n-(n-(n-(n-(7-松-2-osca-1, 3-二唑-4-基) 氨基酸) 或细胞外乳酸水平测量酶7, 8。脂肪酸氧化速率是由同位素标记棕榈酸9,10测定的另一个代谢参数。氧消耗率是一种广泛用于测定细胞11,12中线粒体活性的方法, 同时还可与线粒体膜电位评估13,14、atp/adp (腺苷)5′-triphosphate/Adenosine 5 '-二磷酸) 比测量15或全细胞内 atp 测量16。已知的调节代谢过程的信号通路可以通过蛋白质定量来确定, 并且可以提高对代谢测量的理解17,18,19.

然而, 所有这些方法只测量一个或在最好的情况下, 一个样本中的几个代谢参数。重要的是, 通过海马 xfp 分析仪等细胞外流量分析, 可以同时测量耗氧率 (ocr) 和细胞外酸化率 (ecar)。ocr 是线粒体呼吸的指标, ecar 主要是糖酵解的结果 (我们不能忽视 co2 的产生可能会提高具有高氧化磷酸化活性的细胞的 ecar)20。到目前为止, 已经使用这些分析仪研究了各种细胞类型 212223

在这里, 我们描述了细胞外通量分析的方案, 从未成熟的造血阶段的原生细胞 (白血病细胞) 从白血病患者。据我们所知, 目前还没有关于一次爆炸的具体协议。

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Protocol

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所有样本都是在儿童父母或监护人知情同意和捷克共和国布拉格查尔斯大学道德委员会批准的情况下获得的, 研究结果为。nv15-28848a。

1. 试剂的制备

  1. 通过溶解 137 mm ncl、2.7 mm kcl、4.3 mm na 2 hpo 4、1.47 mm kh kh2 po 4, 在 ddh2o,用 hcl 将 ph 值调整到 7.4, 并通过自压灭菌, 准备500毫升的 pbs.
  2. 制备100毫升 rpmi 培养基: rpmi-1640 培养基, 用 l-alnyl-负有谷氨酰胺, 辅以10% 的胎牛血清 (fbs)、青霉素 (100 uml) 和链霉素 (100μgml)。
  3. 在蒸馏水中制备 0.1 m nhco3的50毫升。将 ph 值调整到 8.1, 过滤灭菌 (0.22μm), 并存储在4°c。
    注: 对于两个8井的细胞外磁通分析仪板, 准备 250μl 0.1 m nhco3 ph 值8.1。
  4. 在蒸馏水中制备1毫升 d-葡萄糖。过滤灭菌 (0.22μm), 并储存在-20°c。
  5. 在乙醇中制备100μl 的 1 mm 低霉素 a。过滤灭菌 (0.22μm), 并储存在-20°c。
  6. 在最小 dmem (dulbecco 的修饰鹰培养基) 中准备250μl 的 1 m 2-脱氧 d-葡萄糖 (2-dg)。将 ph 值加热至 37°c, 并将 ph 值调整为 7.4 (在37°c 下进行 ph 测量)。过滤灭菌 (0.22μm), 并储存在-20°c。
  7. 在 dmso 中制备100μl 的 1 mm fccp (碳基氰化物-p-三氟甲基苯甲酰氨)。过滤灭菌 (0.22μm), 并储存在-20°c。
  8. 在乙醇中制备100μl 的 1 mm 罗酮。过滤灭菌 (0.22μm), 并储存在-20°c。
  9. 在乙醇中制备100μl 的 1 mgml 反霉素 a。过滤灭菌 (0.22μm), 并储存在-20°c。
  10. 就在使用前, 制备10毫升的糖酵解应力试验介质。在水浴中将最小 dmem 加热至 37°c, 并将 ph 值调整为 7.4 (在37°c 下进行 ph 测量)。
  11. 在使用之前, 用 bsa 制备10毫升细胞水户应力测试介质。补充最小 dmem 与 2 mm l-谷氨酰胺, 10 mm d-葡萄糖, 1 mm hepes (ph 7.4), 1 mm 丙酮酸和 0.1% bsa (牛血清白蛋白)。在水浴中加热至 37°c, 并将 ph 值调整为 7.4 (在37°c 下进行 ph 测量)。
  12. 在使用之前, 准备10毫升的细胞水户应力测试介质, 而无需 bsa。补充最小 dmem 与 2 mm l-谷氨酰胺, 10 mm d-葡萄糖 1 mm hepes (ph 7.4) 和 1 mm 丙酮酸。温暖细胞水上无 bsa 至37°c 的氢托应力测试介质, 并将 ph 值调整为 7.4 (在37°c 下进行 ph 测量)。
    注: bsa 被添加到细胞米托应力测试介质中, 因为当培养基补充 bsa 时, 细胞对 fccp 的反应更好 (测试了不同的条件)。不使用 bsa 的细胞米托应力测试介质用于装载端口, 因为制造商不建议在介质中使用 bsa。

2. 骨髓中单个核细胞的分离

注: 理想情况下, 在骨髓采集和细胞分离后, 应立即开始测量原代白血病细胞的代谢状态。不过, 也可以从从捷克共和国其他血液中心运输后分离的细胞中获得相关数据。在无菌组织培养罩中执行所有子步骤。

  1. 将 pbs 和密度梯度介质加热至室温。
  2. 用 pbs 稀释白血病患者的骨髓样本, 比例为1:1。确保样本中至少含有80% 的白血病爆炸。
  3. 使用特定的 cd 标记物通过流式细胞术确定爆炸的百分比, 以确定细胞类型的免疫表型特征。密度梯度分离后, 用核染料检测核酸阳性事件, 以建立整体细胞计数。
  4. 然后, 使用每种类型的白血病使用特定的 cd 标记确定白血病细胞: b-all (cd19, cd45)、t-all (cd3、cd4、cd8、cd5、cd7、cd99) 和 aml (cd45、cd33 和特定骨髓标记)24.将所有核细胞对特定 cd 标记物呈阳性的白血病细胞数量进行划分, 以确定白血病爆炸细胞的百分比。
    注: 骨髓必须用抗凝剂收集到试管中。
  5. 在 15 ml 锥形管中, 稀释后的骨髓样品中的6毫升, 密度梯度介质超过6毫升。在4°c 条件下, 在没有刹车的秋千桶转子中, 以 400 x g 离心35分钟。
    注: 较大体积的样品可分为更多的等高线或50毫升锥形管, 可用于较大量的密度梯度介质。
  6. 使用巴斯德移液器, 小心地将由单个核细胞组成的相间层 (图 1) 转移到具有5毫升 pbs 的 50 ml 锥形管。在4°c 条件下, 在旋转桶转子中以400xg 离心10分钟。
    注: 将所有单个核细胞层转移到一个具有 5 ml pbs 的 50 ml 锥形管中。
  7. 在2毫升无菌 pbs 中吸收上清液并重新悬浮细胞颗粒。用血细胞仪计数细胞。
    注: 在25例患者中, 吸入骨髓一毫升中的白血病细胞数量有显著差异

3. 单核细胞的隔夜培养

注: 在无菌组织培养罩中执行所有子步骤。

  1. 准备两个 t75 烧瓶与20毫升的 rpmi。在每个烧瓶中, 添加 30x 10 6 分离的单个核细胞。用烧瓶在5% 的 co2 和37°c 下将电池培养16–24小时.

4. 细胞粘附涂层板的制备

  1. 涂布两个8英寸的细胞外助焊剂分析仪板。
    注: 在无菌组织培养罩中进行涂层。
  2. 将2.2μl 的细胞粘合剂 (密度: 2.54 mg ml) 添加到 0.1m nahco3、ph 8.1 的250μl 中, 然后将溶液的移液器立即12.5 μl 添加到每口井中。
    注: 电池粘合剂库存解决方案的密度可能不同, 相应地调整添加到 nahco3的体积。
  3. 让盘子在引擎盖里坐20分钟左右, 然后吸进细胞粘合剂, 用200μl 的无菌水清洗每口井两次。让它坐在引擎盖与盖子打开, 直到井是干的。
  4. 立即使用这些板材, 或在4°c 下将边缘包裹在石蜡膜中, 最多可保存1周时间, 以避免结露。在播种细胞之前, 确保将板材加热到室温 (约 20分钟)。

5. 传感器墨盒的水合作用

注: 对两个8英寸的细胞外流量分析仪墨盒进行水化。

  1. 将公用板和传感器墨盒分开。将传感器墨盒倒置在实验室工作台上。
  2. 用200μl 校准器填充公用板的每口井。用400μl 的校准剂填充井外的每个护城河。
  3. 将传感器墨盒返回到现在包含校准器的实用板。
  4. 将墨盒组件放置在加湿、非 co2、37°c 孵化器中过夜。
  5. 打开细胞外磁通分析仪, 让它在夜间加热到37°c。

6. 细胞粘附涂层板中的种子细胞

注: 对于糖酵解应力测试, 请使用糖酵解应力测试介质。对于细胞水户应力测试, 使用细胞水户应力测试介质与 bsa。

  1. 种子细胞用于糖酵解应力测试和细胞米托应激测试在单独的板。对于每个测试, 使用一个烧瓶中的细胞和隔夜培养。
  2. 在室温下以 200 x g 离心细胞5分钟。在适当培养基的1毫升中重新移植细胞并对其进行计数。
  3. 在 400μl的最终体积 (使用适当的介质) 中添加 4 x 10 6 活细胞。
  4. 板材50μl 的细胞悬浮到井 b-g。确保50万细胞在一个井里播种。
    注: 至关重要的是, 种子确切地 500, 000个细胞, 因为没有其他归一化执行。这样, 不同患者的结果就可以比较了。复制的最佳数量为 6个, 如此处所述。不建议使用较少的复制, 因为主单元有时可能会有错误的行为。
  5. 将适当介质的180μl 添加到 a 井和 h 井中 (这些井将作为背景校正)。
  6. 在室温下以 400 x g 离心板 5分钟, 制动设置为1。
  7. 在两个8井外磁量分析仪板中缓慢而仔细地添加130μl 的适当介质来打井 b-g。通过在显微镜下观察, 直观地确认细胞稳定地粘附在井底。
  8. 将板材放入加湿、非二氧化碳2、37°c 孵化器30分钟。

7. 加载传感器墨盒

  1. 对于糖酵解应力试验, 准备250μl 每个 100 mm 葡萄糖, 20μm 低霉素 a 和 1m2-dg, 所有在糖酵解应力测试介质。
  2. 对于细胞水上组织的应力测试, 准备250μm 低聚霉素 a、15μm fccp、30μm fccp 和 10μm rotenone 和 10μml antimycin a 的混合物, 均在无 bsa 的细胞水上应力测试介质中。
    注: 建议在一次试验中注入两种浓度的 fccp, 因为没有足够的患者材料进行 fccp 滴定。然而, 浓度应由研究人员确定。
  3. 将化合物装入墨盒的相应喷油器端口, 如下表 1):

8. 设置程序

  1. 对于糖酵解应力测试, 请按照表 2中的说明设置程序。
  2. 对于细胞水户应力测试, 请按照表 3中的说明设置程序。
  3. 启动该程序。将校准板更换为检测板 (如出现提示时)。

9. 成果的评价和解释

  1. 在糖酵解应力测试结果中, 从所有其他 ecar 值中减去2-dg 注入后的最低 ecar 值。
    注: 此最小值表示非糖酵解酸化。通常, 最小值来自第4次测量.
  2. 从糖酵解功能计算基础酸化、糖酵解、最大糖酵解和糖酵解储备参数 (图 2a)。减去最低 ecar 值后, 从前三个测量点 (如果第一个 ecar 值与其他两个值有显著差异, 则省略第一个 ecar 值) 计算为 ecar 的平均值, 从三个测量值中计算出糖酵解作为 ecar 的平均值葡萄糖注射液后的点, 并计算出最大糖酵解作为 ecar 的平均值, 从三个测量点后, 低维霉素 a 注射。计算糖酵解储备为最大糖酵解减去糖酵解。
    注: 或者, 对于最大糖酵解计算, 请使用测量的三个点的最高 ecar 值。
  3. 在细胞水户应力测试结果中, 从所有其他 ocr 值中减去 rotenone/antimycin a 注射后的最低 ocr 值。
  4. 从线粒体功能计算基础呼吸、atp 产生、最大呼吸和备用容量参数 (图 2b)。减去最低 ocr 值后, 从前三个测量点中计算出基础呼吸作为 ocr 的平均值。
    注: 最大呼吸是 fccp 注射后的最高 ocr 值。
  5. 在 atp 生产计算中, 从基底呼吸中减去低霉素 a 注射后三个 ocr 测量点的平均值。计算备用容量为最大呼吸量减去基础呼吸。
    注: 始终计算最高 ocr 值的最大呼吸, 而不考虑所使用的 fccp 浓度。

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Representative Results

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图 3显示了糖酵解应激试验和细胞米托压力试验测量 bcp-all (b 细胞前体急性淋巴细胞白血病) 和 aml (急性髓系白血病) 患者白血病爆炸后的曲线。还指出了这些测量的代谢参数的计算。每口井播种50万细胞, 所有测量均以六胞胎进行。

在糖酵解应激试验中, 使用的是唯一的基础培养基, 使细胞失去营养。得到的第一个参数是基础酸化, 它应该反映细胞中储存的葡萄糖量。第一次注射后, ecar 增加, 因为细胞利用葡萄糖, 并可以发酵到乳酸。第二次注射中的低霉素 a 抑制 atp-合合酶, 从而引导细胞主要通过糖酵解产生 atp。这将导致 ecar 的进一步提升。注射2-dg 完全抑制糖酵解和 ecar 下降。

在细胞 mito 应激试验中, 使用了补充谷氨酰胺和葡萄糖的培养基, 使细胞不会被剥夺所有营养物质, 基础呼吸参数反映了细胞的基本代谢状态。首次注射低维霉素 a 后, 细胞抑制线粒体呼吸, 并切换到糖酵解, 表现为 ocr 的减少。另一方面, fccp (第二和第三次注射) 将 atp 的产生从呼吸中解锁, 使细胞现在以最大的速度消耗氧气, ocr 上升到最高值。最后一次注射罗替诺和安替米星 a 混合物完全抑制线粒体呼吸, ocr 降低到接近零。

Figure 1
图 1: 骨髓样本的密度梯度离心.用密度梯度培养基分离出富含白血病细胞的单个核细胞。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 糖酵解应力试验和细胞水原应力试验的概要.(a) 糖酵解应力试验的典型结果。(b) 细胞水上应力试验的典型结果。参数在曲线中指示。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: bcp-all (a, b) 和 aml (b, c) 患者白血病细胞通量分析. (ac) 糖酵解应力测试结果。请注意, 第一个测量点可能与其他测量点有很大差异, 在这种情况下, 应将其排除在分析之外。(bd) 细胞水户应力测试结果。参数在曲线中指示。请点击这里查看此图的较大版本.

港口 糖酵解应力试验 细胞微应力测试
加载到端口 井内的最终浓度 加载到端口 井内的最终浓度
a 个 20μl 100 mm 葡萄糖 10 mm 葡萄糖 20μl 20μm 低霉素 a 2μm 低聚霉素 a
B 22μl 20μm 低霉素 a 2μm 低聚霉素 a 22μl 的 15μm fccp 1.5μm fccp
C 25μl 的 1 m 2-dg 100 mm 2-dg 25μl 30μm fccp 4.5 微米 fccp
D X 25μl 为 10μm rotenone 和10μml 反它霉素 a 1μm rotenone 和1μg/ml 反霉素 a

表 1: 复合体积。

设置
校准 自动
平衡 自动
基线测量 三次: 混合– 3分钟, 等待– 0分钟, 测量–3分钟
端口 a 的注入 注射
测量 三次: 混合– 3分钟, 等待– 0分钟, 测量–3分钟
端口 b 的注射 注射
测量 三次: 混合– 3分钟, 等待– 0分钟, 测量–3分钟
端口 c 的注入 注射
测量 四次: 混合– 3分钟, 等待– 0分钟, 测量–3分钟

表 2: 糖酵解应力测试程序。

设置
校准 自动
平衡 自动
基线测量 三次: 混合– 3分钟, 等待– 0分钟, 测量–3分钟
端口 a 的注入 注射
测量 三次: 混合– 3分钟, 等待– 0分钟, 测量–3分钟
端口 b 的注射 注射
测量 三次: 混合– 3分钟, 等待– 0分钟, 测量–3分钟
端口 c 的注入 注射
测量 三次: 混合– 3分钟, 等待– 0分钟, 测量–3分钟
端口 d 的注射 注射
测量 三次: 混合– 3分钟, 等待– 0分钟, 测量–3分钟

表 3: 细胞水户应力测试程序。

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Discussion

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上述方案允许测量急性淋巴细胞白血病 (all) 或急性髓系 (aml) 患者的原发性白血病细胞中 ocr 和 ecar 值评估的代谢活性。使用细胞外助焊剂分析仪进行测量的优点是, 它能够实时检测活细胞中的代谢分布。从本质上讲, 所提供的协议中的每一步都可以根据你计划研究的细胞类型进行调整。在这里, 我们将讨论可能影响结果并可能提供不太理想的值的最重要参数。

优化的第一步是比较从新鲜材料中获得的数据和冷冻材料的数据。从冷冻物质中测量代谢活动的能力将允许对储存在液氮库中的患者样本进行回顾性研究。在 all 样本的情况下, 我们只能从新鲜材料中检测到一致的代谢活动, 而反检细胞也在解冻后进行测量, 并获得最佳结果。

优化的第二步是原代白血病细胞的培养。我们已经测试了细胞的代谢活性直接后, 密度梯度分离 (不培养) 或培养过夜后。即使密度梯度分离后的细胞在显微镜下看起来是可行和重要的, 它们的代谢活动也会受到损害。整体 ecar 和 ocr 值较低, 而且, 注射后, ocr 或 ecar 值的反应并不像培养细胞中的值那样最佳。

不同条件下的栽培也会影响结果。使用胰岛素转铁蛋白硒酸钠补充剂 (its) 被认为是一个很好的做法, 当培养原生爆炸 8, 但这种补充干扰细胞的代谢活动。在细胞米托应力测试中, 用 its 培养的白血病细胞对低霉素 a (ocr 应减少以计算 atp 连接的呼吸) 没有反应。我们还尝试与间充质干细胞 (msc) 共同培养细胞, 但在这种情况下, ocr 和 ecar 值低于没有骨髓间充质干细胞的细胞。总之, 在 10% fbs 的 rpmi 培养基中培养白血病患者的原生细胞是最好的选择。

适合其代谢状况特征的患者必须符合某些标准, 一方面限制检测样本的数量, 但另一方面会产生相关结果。我们测量了高纤维素患者的代谢功能 (一次测量, 我们用六氯塔为每瓶50万细胞播种), 只能测量80和较高比例的白血病细胞的样本, 以避免检测到不特异性悬浮液中存在的其他细胞类型的代谢活性。

数据分析的关键步骤之一是规范化, 以便比较不同白血病样本之间的代谢参数。根据我们之前对白血病细胞系进行的实验, 我们发现, 对细胞数量的归一化给出了最好的结果。每口井的特定细胞数量需要由研究人员确定, 并取决于被检测细胞的大小和代谢活性。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢捷克儿科血液学中心。这项工作得到了卫生部赠款 (nv15-28848a)、捷克共和国卫生部、捷克共和国布拉格莫托大学医院00064203和教育、青年和体育部 nr 的支持。lo1604。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Gibco, ThermoFisher Scientific 61870-010
Fetal Bovine Serum Biosera FB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco, ThermoFisher Scientific 15240-062
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
D-(+) Glucose Sigma-Aldrich G7021-100G
Oligomycin A Sigma-Aldrich 75351-5MG
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375-1G
FCCP Sigma-Aldrich C2920-10MG
DMSO Sigma-Aldrich D8418-100ML
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mL Agilent Technologies 103193-100
L-glutamine solution, 200 mM Sigma-Aldrich G7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 Sigma-Aldrich H0887-100ML
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280-25G
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2153-10G
Ficoll-Paque Plus Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPak Agilent Technologies 103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive ThermoFisher Scientific CB40240
Seahorse Analyzer XFp Agilent Technologies S7802A
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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原发性白血病细胞代谢谱的评价
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Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).More

Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).

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