Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Vurdering af primære leukæmiceller metaboliske profil

doi: 10.3791/58426 Published: November 21, 2018

Summary

Her præsenterer vi en protokol til isolering af leukemic celler fra leukæmi patienter knoglemarven og analyse af deres metabolisk tilstand. Vurdering af den metaboliske profil af primære leukæmiceller kan hjælpe til bedre karakterisere efterspørgsel af primærelementer og kan føre op til mere personlig medicin.

Abstract

De metaboliske krav af kræftceller kan negativt påvirke overlevelse og behandling virkning. I dag, er farmaceutiske målretning af stofskifteveje testet i mange typer af tumorer. Karakterisering af kræft celle metaboliske setup er således uundgåeligt for at målrette den rigtige vej for at forbedre det samlede resultat af patienter. Desværre, i en de fleste kræftformer, de maligne celler er ganske vanskeligt at opnå i højere numre og væv biopsi er nødvendig. Leukæmi er en undtagelse, hvor et tilstrækkeligt antal leukemic celler kan isoleres fra knoglemarven. Her give vi en detaljeret protokol for isolering af leukemic celler fra leukæmi patienter knoglemarven og efterfølgende analyse af deres metaboliske tilstand ved hjælp af ekstracellulære flux analyzer. Leukemic celler er isoleret af tæthed farveforløb, som ikke påvirker deres levedygtighed. Det næste skridt i dyrkning hjælper dem til at regenerere, således den metaboliske stat målt er de celler i optimale betingelser. Denne protokol giver mulighed for at opnå konsistente, godt standardiserede resultater, som kunne bruges til den personlige terapi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den metaboliske profil er et af de vigtigste kendetegn for celler og ændrede bioenergetik er nu betragtes som en af kendetegnene ved kræft1,2,3. Derudover kunne ændringer i opsætningen af metaboliske bruges i behandling af kræft ved at målrette signaltransduktionsveje eller enzymatisk maskiner af kræft celler4,5,6. At kende den metaboliske disposition af kræftceller er således en fordel og kan hjælpe med at forbedre den nuværende terapi.

Der er masser af allerede etablerede metoder, som kan vurdere den metaboliske aktivitet af celler i kultur. Vedrørende glykolyse, glukoseoptagelse kan måles af den radioaktive mærkning, ved hjælp af 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) eller ekstracellulære laktat niveauer målt enzymatisk7,8. Fedtsyre oxidation sats er en anden metabolisk parameter målt ved brændselsfremstilling navngivet palmitat9,10. Ilt forbrugssats er en metode, der er almindeligt anvendt til bestemmelse af mitokondrie-aktivitet i cellerne11,12, sammen med den mitokondrielle membran potentielle evaluering13,14, ATP/ADP (adenosin 5 '-trifosfat/adenosin 5 '-ud) forholdet måling15 eller total intracellulære ATP måling16. Signalering veje kendt for at regulere metaboliske processer kunne bestemmes af protein kvantificeringer og kan forbedre forståelsen af metaboliske målinger17,18,19.

Men alle disse metoder måler kun én, eller i bedste fald et par metaboliske parametre i en prøve samtidigt. Vigtigere, kan samtidig måling af ilt forbrugssats (OCR) og ekstracellulære forsuring sats (ECAR) opnås ved den ekstracellulære flux analyse af, for eksempel, Seahorse XFp Analyzer. OCR er en indikator for mitokondrie respiration og ECAR er primært et resultat af glykolyse (vi ikke kan ignorere CO2 produktion eventuelt opløftende ECAR af celler med højt oxidativ fosforylering aktivitet)20. Hidtil har er forskellige celletyper blevet studeret ved hjælp af disse analysatorer21,22,23.

Her beskriver vi i protokollen for den ekstracellulære flux analyse af primære Blaster (leukæmiceller, der stammer fra den umodne hæmatopoietisk fase) fra leukæmi patienter. Til bedste af vores viden er en særlig protokol for primære eksplosionerne ikke tilgængelig endnu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prøver blev opnået med informed consent af børnenes forældre eller værger og godkendelse af etiske udvalg af Karlsuniversitetet i Prag, Tjekkiet, undersøgelsen ikke. NV15-28848A.

1. forberedelse af reagenser

  1. Forberede 500 mL PBS ved at opløse 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, i ddH2O. Juster pH-værdien til 7.4 med HCl. Sterilize ved autoklavering.
  2. Forberede 100 mL RPMI medium: RPMI-1640 medium med L-Alanyl-glutamin suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), (100 U/mL) penicillin og streptomycin (100 μg/mL).
  3. Forberede 50 mL af 0,1 M NaHCO3 i destilleret vand. PH indstilles til 8.1, filter sterilisere (0,22 μm) og opbevares ved 4 ° C.
    Bemærk: For to 8-godt ekstracellulære flux analyzer plader, forberede 250 μl af 0,1 M NaHCO3 pH 8.1.
  4. Forberede 1 mL 2 M D-glucose i destilleret vand. Filter sterilisere (0,22 μm) og opbevares ved-20 ° C.
  5. Forberede 100 μL af 1 mM oligomycinets A i ethanol. Filter sterilisere (0,22 μm) og opbevares ved-20 ° C.
  6. Forberede 250 μL 1 M 2-deoxy-D-glucose (2-DG) i Minimal DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle medium). Varm til 37 ° C og ph indstilles til 7.4 (udføre pH måling ved 37 ° C). Filter sterilisere (0,22 μm) og opbevares ved-20 ° C.
  7. Forberede 100 μL af 1 mM FCCP (carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) i DMSO. Filter sterilisere (0,22 μm) og opbevares ved-20 ° C.
  8. Forberede 100 μL af 1 mM rotenon i ethanol. Filter sterilisere (0,22 μm) og opbevares ved-20 ° C.
  9. Forberede 100 μL af 1 mg/mL Antimycin A i ethanol. Filter sterilisere (0,22 μm) og opbevares ved-20 ° C.
  10. Lige før brugen, forberede 10 mL af glykolyse stress test-mediet. Varm Minimal DMEM til 37 ° C i et vandbad og ph indstilles til 7.4 (udføre pH måling ved 37 ° C).
  11. Før brug, forberede 10 mL af celle Mito stresstest medium med BSA. Supplere Minimal DMEM med 2 mM L-glutamin, 10 mM D-glucose, 1 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM pyruvat og 0,1% BSA (bovint serumalbumin). Varm til 37 ° C i et vandbad og ph indstilles til 7.4 (udføre pH måling ved 37 ° C).
  12. Før brug, forberede 10 mL af celle Mito stresstest medium uden BSA. Supplere Minimal DMEM med 2 mM L-glutamin, 10 mM D-glucose, 1 mM HEPES (pH 7,4) og 1 mM pyruvat. Varm celle Mito stresstest medium uden BSA til 37 ° C i et vandbad og ph indstilles til 7.4 (udføre pH måling ved 37 ° C).
    Bemærk: BSA er tilføjet til celle Mito stresstest medium, fordi cellerne reagerer bedre på FCCP når mediet er suppleret med BSA (forskellige betingelser blev testet). Celle Mito stresstest medium uden BSA bruges til lastning portene, som fabrikanten anbefaler ikke at bruge BSA i medium.

2. isolering af mononukleære celler fra knoglemarven

Bemærk: Ideelt, måling af metabolisk tilstand af primære leukæmiceller bør starte umiddelbart efter knoglemarv samling og celle isolation. Ikke desto mindre opnås relevante data også fra celler isoleret efter transport fra andre hæmatologi centre i Tjekkiet. Udføre alle underordnede trin i en steril vævskultur hætte.

  1. Varm op PBS og tæthed gradient medium til stuetemperatur.
  2. Fortynd eksemplet knoglemarv for leukæmi patienten med PBS, i forholdet 1:1. Sørg for, at prøven indeholder mindst 80% af leukemic eksplosionerne.
  3. Bestemme procentdelen af eksplosioner ved flowcytometri ved hjælp af specifikke CD markører for immunophenotype karakterisering af celletyper. Efter tæthed gradient adskillelse, opdage nukleinsyre positive begivenheder med en nuklear farvestof for at fastsætte den samlede celletal.
  4. Derefter bestemme leukæmiceller ved hjælp af specifikke CD markører for hver type leukæmi: B-ALL (CD19, CD45), T-alle (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) og AML (CD45, CD33 og specifikke myeloide markører)24. Opdele antallet af leukæmiceller positive for specifikke CD markører af alle nukleare cellerne til at bestemme procentdelen af leukæmiceller blast.
    Bemærk: Knoglemarven har skal indsamles i rør med antikoagulantia.
  5. Omhyggeligt lag 6 mL fortyndet knoglemarv prøven over 6 mL af tæthed gradient medium i en 15 mL konisk slange. Der centrifugeres ved 400 x g i 35 min. ved 4 ° C i en svinge spanden rotor uden bremse.
    Bemærk: Større volumen af prøven kan opdeles i flere delprøver eller 50 mL konisk rør kan bruges med den større mængde af tæthed gradient medium.
  6. Brug Pasteur pipette, omhyggeligt overførsel laget interfase, som består af mononukleære celler (figur 1) til en ny 50 mL konisk slange med 5 mL PBS. Der centrifugeres ved 400 × g i 10 min. ved 4 ° C i en svinge spanden rotor.
    Bemærk: Overføre alle mononukleære cellelag i en enkelt 50 mL konisk slange med 5 mL PBS.
  7. Opsug supernatanten og resuspenderes celle i 2 mL steril PBS. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer.
    Bemærk: Antallet af leukæmiceller i én mL af indsugning knoglemarv varierer betydeligt blandt patienter25.

3. natten dyrkning af mononukleære celler

Bemærk: Udfør alle underordnede trin i en steril vævskultur hætte.

  1. Forbered to T75 kolber med 20 mL af RPMI. Til hver kolbe, tilføje 30 x 106 isoleret mononukleære celler. Inkuber cellerne med kolben stående til 16-24 timer ved 5% CO2 og 37 ° C.

4. forberedelse af celle lim-belagte plader

  1. Coat to 8-godt ekstracellulære flux analyzer plader.
    Bemærk: Udføre overfladebehandling i en steril vævskultur hætte.
  2. Tilføje 2,2 μL af celle lim (massefylde: 2,54 mg/ml) til 250 μl af 0,1 M NaHCO3, pH 8.1 og afpipetteres straks 12,5 μl af løsningen i hver brønd.
    Bemærk: Celle klæbende stamopløsninger kan varierer i deres tæthed, justere lydstyrken tilføjes NaHCO3 i overensstemmelse hermed.
  3. Lad plader sidde i hood i ca 20 min., derefter Opsug den celle selvklæbende og vaske hver godt to gange med 200 μl sterilt vand. Lad det sidde i hætte med låg åbent indtil brøndene er tørre.
  4. Bruge pladerne med det samme eller gemme op til 1 uge på 4 ° C med rim indpakket i paraffin film at undgå kondens. Sikre, at pladerne er varmet op til stuetemperatur (for ca. 20 min) i hætten før såning cellerne.

5. hydrering af Sensor patron

Bemærk: Hydrat to 8-godt ekstracellulære flux analyzer patroner.

  1. Separat hjælpeprogram plade og sensor patron. Placer sensoren patron op og ned på lab bænk.
  2. Fyld hver godt af den nytte plade med 200 μl kalibratoren. Fyld hver voldgrav omkring ydersiden af brøndene med 400 μL af kalibratoren.
  3. Returnere sensor patron til nytte pladen, der nu indeholder kalibratoren.
  4. Placere patronen forsamling i en fugtig, ikke-CO2, 37 ° C inkubator natten over.
  5. Tænd den ekstracellulære flux analyzer og lad det varme til 37 ° C natten over.

6. såning celler i celle lim-belagte plader

Bemærk: For glykolyse stresstest, bruge glykolyse stress test-mediet. For celle Mito stress test, skal du bruge celle Mito stresstest medium med BSA.

  1. Frø celler til glykolyse stresstest og celle Mito stresstest i separate plader. For hver test, skal du bruge celler fra en kolbe med overnight kultur.
  2. Der centrifugeres celler på 200 x g i 5 min ved stuetemperatur. Resuspend celler i 1 mL af den passende medium og tælle dem.
  3. Tilføje 4 x 106 af levende celler til den endelige mængden af 400 μL (brug passende medium).
  4. Plade 50 μL af en cellesuspension til brønde B-G. Sikre 500.000 cellerne udsås i en brønd.
    Bemærk: Det er afgørende at frø præcis 500.000 celler pr. brønd, som ingen andre normalisering er udført. På den måde, kan resultater fra forskellige patienter sammenlignes. Det optimale antal flergangsbestemmelser er seks, som er beskrevet her. Ved hjælp af mindre replikater anbefales ikke, da primærelementer kunne nogle gange opfører sig fejlagtigt.
  5. Tilføj 180 μL af passende medium i wells A og H (disse brønde vil tjene som en baggrundskorrektion).
  6. Der centrifugeres plade på 400 x g i 5 min ved stuetemperatur med bremse indstillet til 1.
  7. Tilføje 130 μL af passende medium til brønde B-G i to 8-godt ekstracellulære flux analyzer plader, langsomt og omhyggeligt. Bekræft visuelt, at cellerne er stabilt levet op til bunden af brøndene ved visning under mikroskop.
  8. Læg pladen ind i en fugtig, ikke-CO2, 37 ° C inkubator i 30 min.

7. lastning Sensor patron

  1. For stresstest glykolyse forberede 250 μL hver af 100 mM glukose, 20 μM oligomycinets A og 1 M 2-GD, alle i glykolyse stress test-mediet.
  2. For stresstest celle Mito forberede 250 μL hver 20 μM oligomycinets a, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP og en blanding af 10 μM rotenon og 10 μg/ml Antimycin A, alle i celle Mito stresstest medium uden BSA.
    Bemærk: Indsprøjtning to koncentrationer af FCCP i én analyse anbefales, da der ikke er nok patienternes materiale for FCCP titrering. Koncentrationerne bør imidlertid fastsættes af forskeren.
  3. Indlæse stofferne i de relevante injektor porte patron som følger (tabel 1):

8. opsætning af programmet

  1. Glykolyse stress test, skal du konfigurere programmet, som beskrevet i tabel 2.
  2. Celle Mito stress test, skal du konfigurere programmet, som beskrevet i tabel 3.
  3. Starte programmet. Erstatte kalibratoren plade med assay plade (når du bliver bedt om det).

9. evaluering og fortolkning af resultaterne

  1. I glykolyse stress testresultater, skal du trække den laveste ECAR værdi efter 2-GD injektion fra alle andre ECAR værdier.
    Bemærk: Denne laveste værdi repræsenterer den ikke-glycolytic forsuring. Normalt, er den laveste værdi fra den 4th måling.
  2. Beregn Basal forsuring, glykolyse, maksimal glykolyse og Glycolytic reserve parametre fra glycolytic funktion (figur 2A). Efter fratrække den laveste ECAR værdi, beregne Basal forsuring som et gennemsnit af ECAR fra de første tre målepunkter (udelade den første ECAR værdi, hvis adskiller sig væsentligt fra to andre), beregne glykolyse som et gennemsnit af ECAR fra tre måling point efter glukose injektion og beregne maksimal glykolyse som et gennemsnit af ECAR fra tre måling efter oligomycinets en injektion. Beregne Glycolytic reserve som maksimal glykolyse minus glykolyse.
    Bemærk: Alternativt til maksimal glykolyse beregning, anvende den højeste værdi i ECAR fra de tre point målt.
  3. I celle Mito stress testresultater, skal du trække den laveste OCR værdi efter rotenon/Antimycin A injektion fra alle andre OCR værdier.
  4. Beregn Basal respiration, ATP produktion, maksimal respiration og reservekapacitet parametre fra mitokondrie funktion (figur 2B). Efter fratrække den laveste OCR værdi, beregne Basal respiration som et gennemsnit af OCR fra de første tre målepunkter.
    Bemærk: Maksimal respiration er den højeste værdi i OCR efter FCCP injektion.
  5. ATP Produktionsberegning, træk gennemsnittet af de tre OCR-målepunkter efter oligomycinets A injektion fra Basal respiration. Beregne ekstra kapacitet som den maksimale respiration minus den basale respiration.
    Bemærk: Altid beregne den maksimale respiration fra den højeste OCR værdi, uanset FCCP koncentration anvendt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 3 viser kurverne efter glykolyse stresstest og celle Mito stresstest målinger af leukemic Blaster fra BCP-ALL (B-celle forløber akut lymfoblastær leukæmi) og AML (akut myeloid leukæmi) patienter. Beregningen af metaboliske parametre fra disse målinger er også angivet. 500.000 celler pr. brønd var seedede og alle målinger blev udført i hexaplicates.

I stresstesten glykolyse bruges kun basal mediet, således at cellerne er berøvet af næringsstoffer. Den første parameter opnåede er Basal forsuringen, som skal afspejle mængden glukose lagret i celler. Efter den første injektion, er ECAR steget siden celler udnytte glukose og kan gære det at laktat. Oligomycinets A i den anden injektion hæmmer ATPsyntase og dermed dirigerer celler til at producere ATP primært via glykolysen. Dette bør medføre yderligere udvidelse af ECAR. Injektion af 2-GD hæmmer helt glykolysen og ECAR dråber.

I celle Mito stress test, en medium suppleret med glutamin og glukose bruges, således at cellerne ikke berøves alle næringsstoffer og parameteren Basal respiration afspejler deres basale metaboliske tilstand. Efter første injektion med oligomycinets A, celler hæmmer mitokondrie respiration og skifte til glykolysen, der er repræsenteret som et fald i OCR. FCCP (den anden og tredje indsprøjtning), uncouples på anden side ATP produktion fra respiration, således at cellerne nu forbruger ilt på en maksimal hastighed og OCR anledning til sin højeste værdi. Den sidste indblæsning af rotenon og Antimycin A blanding hæmmer helt mitokondrie respiration og OCR er faldet næsten nul.

Figure 1
Figur 1: tæthed gradient centrifugering af knoglemarven prøven. Mononukleære celler beriget til leukemic celler adskilles af tæthed gradient medium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: oversigt over glykolyse stresstest og celle Mito stress test. (A) eksemplarisk resultatet af glykolyse stresstest. (B) eksemplarisk resultatet af celle Mito stresstest. Parametre er anført kurver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ekstracellulære flux analyse af leukemic Blaster fra BCP-ALL (A, B) og AML (B, C) patienten. (A og C) glykolyse stress testresultater. Bemærk venligst at den første målepunkt kan væsentligt afviger fra øvrige og bør udelukkes fra analysen i dette tilfælde. (B og D) celle Mito stress testresultater. Parametre er anført kurver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Port Glykolyse stresstest Celle mito stresstest
Indlæse til porten Endelige koncentration i brøndene Indlæse til porten Endelige koncentration i brøndene
A 20 μL 100 mM glukose 10 mM glukose 20 μL af 20 μM oligomycinets A 2 μM oligomycinets A
B 22 μL af 20 μM oligomycinets A 2 μM oligomycinets A 22 μL 15 μm FCCP 1,5 ΜM FCCP
C 25 μl 1 M 2-GD 100 mM 2-GD 25 μl 30 μm FCCP 4,5 ΜM FCCP
D X 25 μl af 10 μM rotenon og 10 μg/ml Antimycin A 1 μM rotenon og 1 μg/ml Antimycin A

Tabel 1: Sammensatte diskenheder.

Trin Indstillinger
Kalibrering Automatisk
Ækvilibrering Automatisk
Basismåling Tre gange: Mix-3 min, vente – 0 min, foranstaltning-3 min
Injektion af port A Injektion
Måling Tre gange: Mix-3 min, vente – 0 min, foranstaltning-3 min
Injektion af port B Injektion
Måling Tre gange: Mix-3 min, vente – 0 min, foranstaltning-3 min
Injektion af port C Injektion
Måling Fire gange: Mix-3 min, vente – 0 min, foranstaltning-3 min

Tabel 2: Program for glykolyse stresstest.

Trin Indstillinger
Kalibrering Automatisk
Ækvilibrering Automatisk
Basismåling Tre gange: Mix-3 min, vente – 0 min, foranstaltning-3 min
Injektion af port A Injektion
Måling Tre gange: Mix-3 min, vente – 0 min, foranstaltning-3 min
Injektion af port B Injektion
Måling Tre gange: Mix-3 min, vente – 0 min, foranstaltning-3 min
Injektion af port C Injektion
Måling Tre gange: Mix-3 min, vente – 0 min, foranstaltning-3 min
Injektion af port D Injektion
Måling Tre gange: Mix-3 min, vente – 0 min, foranstaltning-3 min

Tabel 3: Program for celle Mito stresstest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den ovenfor beskrevne protokol giver mulighed for måling af den metaboliske aktivitet vurderet af OCR og ECAR værdier i primær leukemic eksplosionerne afledt af patienter med akut lymfoblastær leukæmi (alle) eller akut myeloid leukæmi (AML). Fordelen ved måling ved hjælp af en ekstracellulære flux analyzer er, at det giver mulighed for påvisning af metaboliske profil i realtid i de levende celler. Det væsentlige, hvert trin i den angivne protokol kunne justeres afhængigt af hvilken celle en planer om at studere. Her diskuterer vi de vigtigste parametre, som kan påvirke resultaterne og kunne give mindre end optimale værdier.

Det første skridt mod optimering var en sammenligning af data indhentet fra frisk materiale vs frosne materiale. Evnen til at måle den metaboliske aktivitet fra den frosne materiale ville muliggøre retrospektive undersøgelser af patienternes prøver opbevares i flydende nitrogen bank. I tilfælde af alle prøver var vi i stand til at opdage konsekvent metaboliske aktivitet kun fra det friske materiale, mens AML celler blev målt også efter de-frysning med optimale resultater.

Det andet skridt mod optimering er dyrkning af primære leukemic eksplosionerne. Vi har testet den metaboliske aktivitet i cellerne, lige efter den tæthed gradient adskillelse (uden dyrkning) eller dyrkning natten over. Selvom cellerne efter tæthed gradient adskillelse kiggede levedygtige og afgørende under et mikroskop, var deres metaboliske aktivitet svækket. Samlet ECAR og OCR værdier var lavere og også, efter injektion, OCR eller ECAR værdier svarede ikke optimalt som de gjorde i dyrkede celler.

Dyrkning under forskellige forhold kan også påvirke resultaterne. Ved hjælp af insulin transferrin natrium selenite supplement (ITS) anses for at være en god praksis, når dyrke primære Blaster8, men dette supplement forstyrrer den metaboliske aktivitet i cellerne. Under celle Mito stresstest, leukemic eksplosionerne dyrket med ITS reagerede ikke på oligomycinets A (OCR skal falde for at beregne ATP-linked respiration). Vi har også forsøgt at co dyrke celler med mesenchymale stamceller (MSC), men i dette tilfælde OCR og ECAR værdier er blevet lavere sammenlignet med celler dyrket uden MSCs. Sammenfattende dyrker primære Blaster fra leukæmi patienter i RPMI medium med 10% FBS er den bedste løsning.

Patienter egnet til karakterisering af deres metaboliske profil skal opfylde visse kriterier, som dels begrænse antallet af testede prøver, men på den anden vil give relevante resultater. Vi målte den metaboliske funktion af patienter med høj celleforandringer (for én måling vi seedede 500.000 celler / per brønde i hexaplicate) og kun prøver med 80 og en højere procentdel af leukemic eksplosionerne kunne måles for at undgå afsløring af uspecifik metaboliske aktivitet af andre nuværende suspension celletyper.

En af de afgørende trin i dataanalyse er en normalisering, således at metaboliske parametre mellem forskellige leukemic prøver kunne sammenlignes. Ifølge vores tidligere eksperimenter udført med leukemic cellelinjer, fandt vi, at normalisering af antallet af celler giver de bedste resultater. Antallet af celler pr. brønd skal bestemmes af forskeren og afhænger af størrelse og metaboliske aktivitet af testede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke den tjekkiske Pediatric hæmatologi Centre. Dette arbejde blev støttet af tilskud af Ministeriet for sundhed (NV15-28848A), af Sundhedsministeriet i Tjekkiet, University Hospital Motol, Prag, Tjekkiet 00064203 og af Ministeriet for uddannelse, Ungdom og sport NPU nr. LO1604.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Gibco, ThermoFisher Scientific 61870-010
Fetal Bovine Serum Biosera FB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco, ThermoFisher Scientific 15240-062
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761-500G
D-(+) Glucose Sigma-Aldrich G7021-100G
Oligomycin A Sigma-Aldrich 75351-5MG
2-Deoxy-D-glucose Sigma-Aldrich D8375-1G
FCCP Sigma-Aldrich C2920-10MG
DMSO Sigma-Aldrich D8418-100ML
Rotenone Sigma-Aldrich R8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp. Sigma-Aldrich A8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mL Agilent Technologies 103193-100
L-glutamine solution, 200 mM Sigma-Aldrich G7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 Sigma-Aldrich H0887-100ML
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280-25G
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A2153-10G
Ficoll-Paque Plus Sigma-Aldrich GE17-1440-02 Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPak Agilent Technologies 103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive ThermoFisher Scientific CB40240
Seahorse Analyzer XFp Agilent Technologies S7802A
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation. Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).
  2. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate. Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).
  3. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).
  4. Wise, D. R., Thompson, C. B. Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).
  5. Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel. Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).
  6. Liberti, M. V., et al. A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product. Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).
  7. Lundgaard, I., et al. Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism. Nature Communications. 6, 6807 (2015).
  8. Hermanova, I., et al. Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells. Leukemia. 30, 209-218 (2016).
  9. Malandrino, M. I., et al. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).
  10. Patella, F., et al. Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).
  11. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).
  12. Simonnet, H., Vigneron, A., Pouysségur, J. Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption. Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).
  13. Martínez-Reyes, I., et al. TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions. Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).
  14. Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).
  15. Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio. The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).
  16. Morciano, G., et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).
  17. Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 12553-12558 (2010).
  18. Lee, K. -H., et al. Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator. The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).
  19. Godlewski, J., et al. MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells. Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).
  21. Kaplon, J., et al. A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence. Nature. 498, 109-112 (2013).
  22. Pardee, T. S., et al. A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).
  23. Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).
  24. Hrušák, O., Porwit-MacDonald, A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).
  25. Amin, H. M., et al. Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias. Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).
Vurdering af primære leukæmiceller metaboliske profil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).More

Hlozková, K., Starková, J. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (141), e58426, doi:10.3791/58426 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter