Här presenterar vi ett protokoll för isolering av leukemiska celler från benmärg leukemi patienter och analys av deras metaboliska tillstånd. Bedömning av den metabola profilen av primära leukemiceller kan bidra till att bättre karaktärisera efterfrågan av primära celler och leda till mer personlig medicin.
Den metabola kraven av cancerceller kan negativt påverka överlevnad och behandlingseffektivitet. Nuförtiden, är farmaceutiska inriktningen av metaboliska vägar testad i många typer av tumörer. Karakterisering av cancer cell metabola setup är alltså oundvikliga för att rikta den rätta vägen för att förbättra det totala resultatet av patienter. Tyvärr i de flesta cancerformer, elakartade cellerna är ganska svårt att få i högre siffror och vävnad biopsi krävs. Leukemi är ett undantag, där ett tillräckligt antal leukemic celler kan isoleras från benmärgen. Här, ger vi ett detaljerat protokoll för isolering av leukemiska celler från benmärg leukemi patienter och efterföljande analys av deras metaboliska tillstånd att använda extracellulära flux analyzer. Leukemiska celler isoleras av täthetlutningen, som inte påverkar deras livskraft. Nästa odling steg hjälper dem att regenerera, således den metabola stat mätt är densamma av celler i optimala förhållanden. Detta protokoll tillåter att uppnå konsekvent, väl standardiserade resultat, som skulle kunna användas för personlig terapin.
Den metabola profilen är en av de viktigaste egenskaperna hos celler och förändrad bioenergetik anses nu vara ett av kännetecknen av cancer1,2,3. Dessutom skulle förändringar i metabola setup kunna användas i behandling av cancer genom att rikta cellsmedierade reaktioner eller enzymatisk maskiner cancer celler4,5,6. Att veta den metabola anlag för cancerceller är således en fördel och kan bidra till att förbättra den nuvarande behandlingen.
I området i närheten finns det gott om redan etablerade metoder som kan bedöma den metaboliska aktiviteten av celler i kultur. Angående glykolys, kan glukosupptag mätas av radioaktiva märkningen, med 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) eller extracellulära laktat nivåer mätt enzymatiskt7,8. Fettsyra är oxidation en annan metabolisk parameter mätt med isotopically märkta palmitat9,10. Syre materialåtgången är en metod som ofta används för att bestämma mitokondriell aktivitet i cellerna11,12, tillsammans med den mitokondriella membranet potentiella utvärdering13,14, ATP/ADP (adenosin 5 ‘-trifosfat/5′-adenosindifosfat) baserat på mätning15 eller totalt intracellulära ATP mätning16. Signalering vägar kända för att reglera metabola processer kunde fastställas av protein kvantifieringar och kan förbättra förståelsen av metabola mätningar17,18,19.
Men alla dessa metoder mäter endast en eller, i bästa fall, några metabola parametrar i en prov samtidigt. Ännu viktigare, kan samtidig mätning av syre materialåtgången (OCR) och extracellulära försurning rate (ECAR) uppnås genom den extracellulära flux analysen av, till exempel Seahorse XFp Analyzer. OCR är en indikator på mitokondriell respiration och ECAR är huvudsakligen en följd av glykolys (vi inte kan ignorera CO2 produktion möjligen upphöja ECAR celler med hög oxidativ fosforylering aktivitet)20. Hittills har har olika celltyper studerats med hjälp av dessa analysatorer21,22,23.
Här beskriver vi protokollet för extracellulära flux analys av primära Blaster (leukemiceller från omogna hematopoetiska scenen) från leukemipatienter med. Till bäst av vår kunskap är ett visst protokoll för primära Blaster inte tillgänglig ännu.
Ovan beskrivna protokollet tillåter för mätning av den metaboliska aktiviteten bedömt OCR och ECAR värden i primära leukemiska Blaster härrör från patienter med akut lymfatisk leukemi (ALL) eller akut myeloisk leukemi (AML). Fördelen med mätning med en extracellulär flux analysator är att det möjliggör upptäckt av metabola profilen i realtid i levande celler. I huvudsak kunde varje steg i enlighet med protokollet justeras beroende på vilken celltyp en planerar att studera. Här, kommer vi att diskutera d…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka de tjeckiska pediatriska hematologi centra. Detta arbete var stöds av Grant av hälsoministeriet (NV15-28848A), av hälsoministeriet av Tjeckien, University Hospital Motol, Prag, Tjeckien 00064203 och ministeriet för utbildning, ungdom och sport NPU jag nr. LO1604.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco, ThermoFisher Scientific | 61870-010 | |
Fetal Bovine Serum | Biosera | FB-1001/100 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15240-062 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
Oligomycin A | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375-1G | |
FCCP | Sigma-Aldrich | C2920-10MG | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875-1G | |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674-25MG | |
Seahorse XF Base Medium, 100 mL | Agilent Technologies | 103193-100 | |
L-glutamine solution, 200 mM | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | |
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6 | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-25G | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
Ficoll-Paque Plus | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Density gradient medium |
Seahorse XFp FluxPak | Agilent Technologies | 103022-100 | |
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | CB40240 | |
Seahorse Analyzer XFp | Agilent Technologies | S7802A | |
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 |