Vi viser en metode for innskudds Escherichia coli bakteriell biofilm i vilkårlig romlige mønstre med høy oppløsning med optisk stimulering av en genetisk kodet overflaten vedheft konstruksjon.
Romlig struktur og mønstre spille en viktig rolle i bakteriell biofilm. Her viser vi en tilgjengelig metode for dyrking E. coli biofilm i vilkårlig romlige mønstre med høy romlig oppløsning. Teknikken bruker en genetisk kodet optogenetic konstruksjon-pDawn-Ag43-at par biofilm formasjon i E. coli til optiske stimulering av blått lys. Vi detalj prosessen for å transformere E. coli med pDawn-Ag43, forbereder det nødvendige optisk oppsettet og protokollen dyrking mønstret biofilm bruker pDawn-Ag43 bakterier. Bruker denne protokollen, kan biofilm med en romlig oppløsning under 25 μm være mønstret på forskjellige overflater og miljøer, inkludert vedlagte chambers, uten microfabrication, ren-rom eller overflate forbehandling. Teknikken er praktisk og egnet for bruk på programmer som undersøker effekten av biofilm strukturen, gir tunable kontroll over biofilm mønstre. Videre, den likeledes har potensielle anvendelser i biologisk materiale, utdanning og bio-art.
Biofilm er overflaten tilknyttet samfunn av mikrober, og er godt kjent for sine sterk struktur-funksjon kopling. Romlig geometri og mønstre av biofilm spiller en viktig rolle i totale samfunnet funksjonen (og omvendt)1. Hvor liten skalerer involvert i biofilm struktur-på titalls mikrometer2-gjøre tunable og praktisk kontroll over biofilm mønstre et utfordrende problem. Her viser vi en protokoll som tillater biofilm å være nettopp mønstret i vilkårlig geometrier, basert på optiske belysning.
Protokollen presenteres her bruker pDawn-Ag433, en optogenetic konstruksjon som par biofilm formasjon i E. coli bakterier å optisk belysning ved kjøring uttrykk for Ag43 (en adhesin genet er ansvarlig for overflaten vedheft og biofilm formasjon) under kontroll av pDawn4 (en transcriptional regulator kontrollert av optisk belysning). Metoden er praktisk å bruke og kan overflaten mønster biofilm på ulike miljøer, inkludert lukket (gjennomsiktig) kultur kamre. Sammenlignet med eksisterende celle deponering metoder, for eksempel slippverktøy-baserte deponering5 eller overflate prepatterning/behandling6, pDawn-Ag43 krever ikke microfabrication eller ren-rom og krever ikke materialer utover de tilgjengelig til en typisk mikrobiologi. Det er kjøpedyktig mønster med en romlig oppløsning under 25 μm, nærmer de romlige dimensjonene av microcolonies i naturlig eksisterende biofilm2. Total, denne teknikken gir muligheten til å manipulere biofilm struktur, som åpner mange muligheter for å studere microecology i bakteriell samfunn7. I tillegg kan mønstret biofilm gi en praktisk plattform som ingeniør nyttig biologisk materiale8,9. I dette papiret, vi diskutere grunnleggende protokollen kreves for mønstre biofilm bruker pDawn-Ag43 og potensielle endringer og feilsøking knyttet til metoden.
I lys av behovet for forskningsverktøy som tillater biofilm struktur kontroll, har vi presentert en lett-å-bruke protokoll for mønstre bakteriell biofilm bruker den pDawn-Ag43 optogenetic konstruksjonen. Med denne teknikken, kan E. coli biofilm være optisk mønstret på ulike overflaten miljøer, inkludert lukket kammer, med en romlig oppløsning under 25 μm.
Samlet denne protokollen kan deles inn i fire hoveddeler: (1) utarbeidelsen av pDawn-Ag43 bakterier, (2) utarbeidelsen av den optiske og kultur sette opp maskinvare, (3) før belysning bakterievekst trinnene og (4) etter belysning skyller og bildebehandling.
Den kritiske delen av avsnittet 1 er vellykket transformasjonen av pDawn-Ag43 plasmider i E. coli belastningen av interesse. Dette muliggjøres ved å isolere høykvalitets renset plasmider og generere høy kvalitet kompetent celler for transformasjon (tabell 1, feilsøking).
Den kritiske delen av inndeling 2 er optimalisering av projektoren oppsettet slik at belysning intensitet justeres til 50 μW/cm2 på 460-nm bølgelengde og projektoren er riktig fokusert på biofilm eksempel høyden. Merk at i denne protokollen, beskriver vi en invertert belysning oppsett der projektoren skinner lys nedenfor, oppover mot biofilm prøven. Fordelen med dette oppsettet er at lyset trenger bare å reise gjennom bunnen av kultur rett før havoverflaten biofilm formasjon. Lys ovenfra betyr at lyset må reise gjennom flytende media over biofilm overflaten, som i løpet av veksten, blir med planktoniske celler. I tillegg til disse bekymringene, det er også viktig å redusere uønsket lys i optisk oppsettet som mulig, for eksempel ved å dekke opp reflekterende overflater på indre av inkubatoren – dette bidrar til å oppnå skarpere mønstret biofilm. På et beslektet notat, kan skarpere biofilm mønstre også oppnås ved hjelp av en photomask til å styre belysning mønstre (figur 3D, figur 4C). Vanlige problemer krever feilsøking inkluderer projektor pålitelighetsproblemer ved høyere temperaturer (f.eks, 37 ° C), som kan reduseres ved rugende biofilm veksten ved lavere temperaturer (f.eks, 30 ° C), samt programvare som forårsaker operativsystemet eller blått lys filtrering under overnatting vekst (tabell 1). Det er også viktig å merke seg at avhengig av projektoren og inkubator modellen som brukes, er det også mulig at varmen som genereres fra projektoren vil resultere i en høyere indre temperatur enn inkubator temperatur, som må rettes.
Den kritiske delen av avsnitt 3 er å få pålitelig og repeterbare bakteriell prøver før de er indusert av belysning. Derfor anbefales det å få klonal kolonier av pDawn-Ag43 bakterier ved striper dem ut på en agar plate og deretter bruke flytende kultur trinnene slik at bakterier er opplyst/indusert på slutten eksponentiell vekstfase i en repeterbar måte.
Endelig, det viktig del av del 4 er å grundig, men også forsiktig vaske vekk planktoniske cellene igjen etter biofilm mønstre protokoll; Derfor er det anbefalt å utføre flere mild skyll trinn med PBS.
Sammenlignet med eksisterende teknikker for cellen mønstre5,har6, optisk biofilm mønstre basert på pDawn-Ag43 en rimelig lav barriere for innreise til å bruke, ved at den ikke krever microfabrication, rene rom, komplekse kjemi, eller overflate forbehandling, men er fremdeles kjøpedyktig mønster med høy oppløsning (25 μm) vanligvis assosiert med microfabrication teknikker. Metoden utvider tidligere arbeid på bakteriell klima og jordsmonn for å kontrollere gene expression17. PDawn-Ag43 plasmider er foreløpig begrenset til E. coli, som den bruker en pUC-baserte opprinnelsen til replikering, men pDawn og Ag43 er begge kompatible i andre (Gram-negative) bakterie-art. Genetisk teknikker tilgjengelig for potensielt innføre lys regulert biofilm formasjonen til ulike bakteriell arter og representerer en mulig retning for fremtidig forskning. En annen potensiell begrensning av teknikken er at det fungerer ved å øke biofilm formasjon i stammer med svak innfødt biofilm dannelse (f.eksMG1655 E. coli). Imidlertid har stammer med sterk innfødt biofilm dannelse biofilm form uansett belysning forhold, slik at mønstret biofilm dannelse med pDawn-Ag43 som beskrevet her; ennå kan optogenetic teknikker fortsatt bli gjeldende i å regulere biofilm formasjon. Vi oppmerksom på at i andre sammenhenger, alternative metoder for biofilm mønstre kan være tilgjengelige, for eksempel via optisk c-di-GMP modulering18.
Samlet pDawn-Ag43 basert mønstre vil være riktig for bruk i programmer som undersøke effekten av biofilm strukturen på funksjonen1 , og derfor kan ha nytte av tunable kontroll over biofilm mønstre-et spesielt relevant eksempel å markere er studiet av microbial ecology i biofilm2. Fremtidige retninger inkluderer gjør mønstret biologisk materiale8,9 og/eller strukturert bakteriell samfunn. Alternative programmer av denne tilgjengelig protokollen også omfatte bio-art19, gitt klare estetiske potensialet, i tillegg til formelle og uformelle livet vitenskap utdanning20,21,22. Fra et pedagogisk perspektiv, protokollen beskrevet her kombinerer mange relevante teknikker (bakteriell kultur, transformation, optikk/optogenetics) og er også modulbasert utvides (f.eksinkluderer microfluidics).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker D. Glass, H. Kim, N. Cira, A. Choksi, S. Rajan og B. nøkler for sine forslag og Spormann laboratorium for tilgang til deres AC confocal mikroskop. Videre erkjenner forfatterne støtten fra Stanford Bio-X Bowes og NSERC PGS stipend, National Institute of Health (R21-AI-139941) og American Cancer Society (RSG-14-177-01).
DH5alpha/pDawn-Ag43 | Addgene | 107742 | DH5alpha cloning strain hosting pDawn-Ag43 plasmid – plasmid needs to be moved to E. coli strain of interest prior to use |
MG1655 E. coli | Coli Genetic Stock Center – Yale University | CGSC #6300 | MG1655 was used as E. coli strain of interest in this paper's representative results |
RFP expression plasmid | iGEM biobricks | J04450-pSB4K5bb | Many options exist to obtain fluorescent bacteria – if using plasmid, ensure backbone does not conflict with colE1 ori of pDawn-Ag43 |
Plasmid miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
LB broth powder | Affymetrix | 75852 | Add 20 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin to get sterile LB+spec |
LB agar powder | Affymetrix | 75851 | Add 35 g/L to water, autoclave, add 50 μg/mL spectinomycin, pour into petri dishes to get sterile LB+spec plates |
Petri dishes | Fisherbrand | 431760 | |
Spectinomycin hydrochloride pentahydrate | abcam | ab141968 | Make 1000x stock 50mg/mL in water, filter sterilize and dilute into media as needed |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Mix at 1:1 ratio with water, sterilize by autoclave or filter to obtain 50% glycerol |
M63 media salts 5X solution | Bio-world | 705729 | Add cas-amino acids, glucose and MgSO4, bring to 1X salts concentration by adding sterile water |
Casamino acids | Amresco | J851 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.1%) |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Make 20% stock in water, filter sterilize and add to M63 as supplement (final concentration 0.2%) |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Make 1 M stock in water, autoclave and add to M63 as supplement (final concentration 1 mM) |
Crystal violet | Acros organics | 212120250 | Dilute to 0.1% in water prior to use |
Self-hardening mounting media (Shandon immumount) | Thermo Scientific | 9990402 | Use to preserve samples over long term for fluorescence imaging |
Phosphate buffered saline (PBS) solution | Gibco | 10010023 | Can also use PBS prepared from powder / tablets |
6 well plate | Fisherbrand | 351146 | Used as biofilm culture dish for representative results |
PDMS kit | Dow | SYLGARD 184 | Can be used to make enclosed microchamber cavities using soft lithography |
1 mL syringe | BD syringe | 309659 | For use with liquid handling with enclosed microchambers |
Blunt tip needle | CML supply | 901-23-050 | Attaches to 1 mL syringe |
Lab tape | Fisherbrand | 15-901 | Use to attach culture chamber to incubator ceiling |
Bacterial incubator | Sheldon Manufacturing | SMI6 | Ensure interior height of incubator is tall enough to focus projector at the ceiling |
Portable projector | Ivation | IV-PJ-PRO-4-1 | Many portable projector models exist, pDawn-Ag43 has been tested with multiple models including LED/laser based, with blue light channel ranging from 450-460nm central wavelength |
Optical breadboard base | ThorLabs | MSB6 | Base for optical setup to hold projector – many other setups possible, just need to hold projector firmly at bottom of incubator, pointing upwards |
Optical post | ThorLabs | TR8 | 2 posts needed – one to be set up vertically extending out of breadboard base, one horizontally attached via right-angle clamp |
Optical post right-angle clamp | ThorLabs | RA90 | Connects vertical and horizontal posts |
Mounting base | ThorLabs | BA1S | Connects optical breadboard base and vertical post |
1/4"-20 screw | ThorLabs | SH25S050 | Attaches vertical post to mounting base, mounting base to breadboard base |
1/4"-20 set-screw | ThorLabs | SS25E63D | Connects horizontal post to projector via tripod screw-hole |
Optical power meter | Newport | 840 | Use with power meter detector to measure projector illumination intensity – many power meter models exist, using one that has extendable detector will facilitate measurement |
Optical power meter detector | Newport | 818-UV | Connects to power meter (above) – UV detector not strictly necessary as blue light is within visible range |
Adjustable ND filter | K&F Concept | SKU0689 | Adjustable (by rotating) neutral density filter – place above projector aperture |
Presentation-projector software | Microsoft | Powerpoint | Any software that allows drawing / presentation will suffice |
CAD software | Autodesk | AutoCAD | Used for designing photomasks, many mask printing services are compatible with AutoCAD files |
Film photomask | Fineline Imaging | n/a | Many photomask printer services exist for high resolution (>30000DPI) film photomask printing |