जिगर से ऊतक extracellular Vesicles के अलगाव
Summary
यह जिगर से ऊतक extracellular vesicles (EVs) को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रोटोकॉल जिगर ऊतक EVs को अलग करने के लिए अंतर ultracentrifugation द्वारा पीछा किया कोलैजानेस perfusion शामिल एक दो कदम प्रक्रिया का वर्णन करता है.
Abstract
extracellular vesicles (EVs) कई अलग अलग सेल प्रकार से जारी किया जा सकता है और सबसे में पता चला, नहीं तो सभी, शरीर के तरल पदार्थ. ईवीएस जैव सक्रिय अणुओं जैसे आरएनए या प्रोटीन को एक सेल से दूसरे में बंद करके सेल-टू-सेल संचार में भाग ले सकते हैं। EVs के अधिकांश अध्ययन सेल संस्कृति मॉडल में या शरीर के तरल पदार्थ से अलग EVs में प्रदर्शन किया गया है. शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए उनके योगदान का अध्ययन करने के लिए ऊतकों से ईवीएस के अलगाव में रुचि उभर रही है और कैसे वे रोग में बदल रहे हैं। ऊतकों से पर्याप्त उपज के साथ EVs के अलगाव सेलुलर क्षति के बिना ऊतक वियोजन की आवश्यकता की वजह से तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. इस विधि माउस जिगर ऊतक से EVs के अलगाव के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है. विधि एक दो कदम प्रक्रिया situ collagenase पाचन में अंतर अल्ट्रा-centrifugation द्वारा पीछा के साथ शुरू शामिल है. कोलैजेनस का उपयोग कर ऊतक perfusion प्राप्त EVs की अपनी वृद्धि हुई उपज के कारण यांत्रिक काटने या जिगर के ऊतकों के homogenization पर एक लाभ प्रदान करता है। जिगर से EVs को अलग करने के लिए इस दो कदम प्रक्रिया का उपयोग ऊतक EVs के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Introduction
extracellular vesicles (EVs) झिल्ली बाध्य vesicles कि शरीर में कोशिकाओं के कई अलग अलग प्रकार से जारी कर रहे हैं. ईवीएस में अणुओं का एक कार्गो होता है जिसमें आरएनए, डीएनए और प्रोटीन शामिल होते हैं। ईवीएस द्वारा इस माल का एक सेल से दूसरे को अंतरण एक तंत्र के रूप में अभिगृहीत किया जाता है जिसके द्वारा ऊतकों के भीतर की कोशिकाएं एक दूसरे के साथ संवाद करते हैं1. सामान्य स्वास्थ्य और रोगों में ईवीएस के कार्गो या भूमिकाओं के बारे में अधिकांश जानकारी संस्कृति में कोशिकाओं से प्राप्त ईवीएस पर अध्ययन से प्राप्त की गई है या परिसंचरण या शरीर के अन्य तरल पदार्थ2से एकत्र की गई है . विवो मेंउनकी शारीरिक भूमिकाओं को समझने के लिए , ऊतक ईवीएस के अलगाव के लिए एक मजबूत विधि आवश्यक है जो ईवीएस की सभी आबादी को कैप्चर करती है और सेलुलर क्षति या संदूषण3से बचाती है . यहाँ वर्णित विधि का समग्र लक्ष्य माउस जिगर से ऊतक EVs को अलग करने के लिए है.
जिगर में अधिकांश सेल प्रकार EVs का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है, और EV आधारित संकेतन के अध्ययन के बुनियादी ज्ञान और यकृत रोगों की समझ को आगे बढ़ रहा है. हालांकि, ऊतकों के भीतर विभिन्न कोशिका प्रकारों से EVs के संयुक्त प्रभाव केवल आंशिक रूप से समझा जाता है. जिगर के ऊतकों से EVs के अलगाव के लिए ऊतक वातावरण के भीतर EVs के insitu योगदान को समझने के लिए आवश्यक है. यहाँ वर्णित दृष्टिकोण ऊतक वियोजन को बढ़ाने और सेल क्षति को कम करने के लिए एक दो कदम perfusion पर आधारित है. बाद में, EVs अलग जिगर ऊतक से अलग कर रहे हैं. hepatocytes के अलगाव के लिए दो कदम perfusion का उपयोग दृष्टिकोण 1950 के दशकके शुरूसे 4 के बाद से इस्तेमाल किया गया है . हेपेटोसाइट अलगाव के लिए इन तरीकों को संशोधित किया गया है और लगातार सुधार किया गया है और अब संस्कृतियों में हेपाटोसाइट्स के अलगाव के लिए मानक दृष्टिकोण हैं, सेल निलंबन में, और ऊतकों से5,6,7. पहले चरण में, जिगर कैल्शियम मुक्त बफर, हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ एक गैर-पुनर्संचार भ्रम के अधीन है। दूसरे चरण में, जिगर कोलाजनेस के साथ perfused है desmosomal सेल से सेल जंक्शनों के आगे जुदाई के लिए extracellular मैट्रिक्स भंग करने के लिए. कोलैजानेस विघटन के लिए एक इष्टतम उपचार समय 7 से 10 मिनट है। उपचार की एक छोटी अवधि अपूर्ण विघटन का कारण होगा और जिगर में सेल संपर्कों को बनाए रखने, जबकि एक लंबी अवधि जिगर की क्षति या पोर्टल नस व्यवधान का कारण बन सकता है. EVs तो अलग कर रहे हैं अलग अलग अलग कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को दूर करने के लिए अंतर centrifugation का उपयोग कर. यह उच्च पैदावार है कि आगे बहाव विश्लेषण या अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में EV संग्रह में परिणाम है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में यकृत ऊतक EV के अलगाव के लिए एक इष्टतम और पुन: प्रोड्यूसकरनेयोग्य विधि का वर्णन किया गया है, जो पोर्टल नस के माध्यम से द्वि-चरणीय भ्रम प्रक्रिया का उपयोग करता है जिसके बाद अंतर ultracentrifugation होता है। प्रक्रिया के महत्वपूर्ण चरणों में कैनुला प्लेसमेंट, कोलाजनेस एकाग्रता और पाचन समय, माध्यम के प्रवाह की गति, पाचन के बाद ऊतक की हैंडलिंग, और शास्त्रीय अंतर ultracentrifugation शामिल हैं।
कोशिका जुदाई कोलैजास प्रकार IV का उपयोग कर पाचन के बाद संयोजी ऊतक घटकों से जुदाई द्वारा हासिल की है। परफ्यूजन के लिए उपयोग किए जाने वाले कोलैडेस की सांद्रता 0.1 से 5 मिलीग्राम/एमएल तक हो सकती है। ऊतक पाचन के लिए कोलैजानेस की प्रभावकारिता में काफी बैच-टू-बैच भिन्नता हो सकती है। 0.5 से 5 मिलीग्राम/एमएल तक कोलैडेंस की सांद्रता का परीक्षण किया गया था, लेकिन उपयोग की गई सांद्रता का प्राप्त ईवीएस की उपज पर कोई बड़ा प्रभाव नहीं पड़ा। कोलैनासेस की एक उच्च एकाग्रता का उपयोग एक और अधिक तेजी से सूजन और जिगर की सफेदी में परिणाम होगा. लक्ष्य अत्यधिक संदूषण या क्षति के बिना संतोषजनक सेल वियोजन प्राप्त करने के लिए है। इन आइसोलेशन में प्रयोग किए जाने वाले कोलैडेज का इष्टतम सांद्रता 8 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर 7-8 मिनट के लिए 1-2 मिलीग्राम/एमएल है। एक भ्रम प्रक्रिया है कि बहुत लंबा है जिगर के भीतर पतली संयोजी ऊतक को नष्ट करने के जोखिम में वृद्धि के रूप में अच्छी तरह के रूप में इस तरह के पोर्टल नस या नस के साथ हवा फँसाने से सुई dislodgment के रूप में तकनीकी जोखिम में वृद्धि होगी.
इस प्रोटोकॉल का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू पोर्टल नस का कैनुलेशन है। यह प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से चूहों में 18 से 25-जी आकार की सीमा. कोलैजानेस परफ्यूजन के लिए तकनीक मूल रूप से चूहों में उपयोग के लिए विकसित की गई थी और बाद में कई संशोधनों और समायोजनों के बाद चूहों में उपयोग के लिए अपनाया गया था। एक 23G रक्त संग्रह सेट का उपयोग कर Cannulation छोटे luminal व्यास के रक्त वाहिकाओं में एक कैथेटर की नियुक्ति की तुलना में आसान है. एक डाट गाँठ के साथ धागे का उपयोग कर cannula फिक्सिंग dislodgement से बचने के लिए सिफारिश की है और गाँठ भी पोर्टल नस स्थान के एक मार्कर के रूप में कार्य करता है मामले में cannula पोत से आता है.
डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं से न्यूनतम संदूषण होना अत्यंत महत्वपूर्ण है। पाचन के बाद ऊतक की हैंडलिंग में कई महत्वपूर्ण विचार हैं। सबसे पहले, जब जिगर रक्त संदूषण से बचने के लिए निकाला जाता है, तो संदंश और कैंची बदल रहे हैं। दूसरा, यह महत्वपूर्ण है कि पित्ताशय की थैली को पित्त से फाड़और अवांछित संदूषण से बचने के लिए यकृत से सावधानी से हटाया जाए। तीसरा, एक बार जिगर माउस से हटा दिया गया है, जिगर बहुत धीरे PBS का उपयोग कर किसी भी रक्त को दूर धोया जाता है. कोशिकाओं के साथ संदूषण को कम करने से प्राप्त ईवीएस की उपज में कमी की तुलना में उच्च प्राथमिकता दी जानी चाहिए।
ईवीएस8,9,10,11के अलगाव और शुद्धि के लिए अल्ट्रासेंट्रीफेशन सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है . इस दृष्टिकोण इस तरह के hepatocytes या cholangiocytes और ऐसे Kupffer कोशिकाओं के रूप में गैर parenchymal कोशिकाओं के रूप में सबसे parenchymal कोशिकाओं को दूर करेगा, sinusoidal endothelial कोशिकाओं, और स्टेलेट कोशिकाओं, इसके अलावा, सेल मलबे, सेल समुच्चय, और मृत कोशिकाओं को भी हो जाएगा अंतर centrifugation द्वारा हटा दिया. इसके अलावा शुद्धि और विशिष्ट आबादी के अलगाव आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा किसी भी गैर vesicular प्रोटीन समुच्चय या लिपोप्रोटीन को दूर करने के लिए किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह सभी ऊतक vesicles पर कब्जा नहीं हो सकता है, संभावना है कि कुछ vesicles perfusate में हटाया जा सकता है दिया. यदि एक वैश्विक मूल्यांकन की जरूरत है, perfusate और perfusate के भीतर vesicles के अलगाव के संग्रह पर विचार किया जाना चाहिए. एक और सीमा सेल क्षति के लिए संभावित है. अत्यधिक सेल मौत के संभावित प्रभाव पर नजर रखने के लिए, सेल व्यवहार्यता पर नजर रखी जा सकती है और ऊतक EV अलगाव के लिए गुणवत्ता मानकों के भीतर शामिल किया जा सकता है. अंत में, इस प्रक्रिया को एक अनुकूलित कार्यप्रवाह पोर्टल नस के माध्यम से एक दो कदम perfusion तकनीक का उपयोग कर एक उच्च उपज पर माउस जिगर से जिगर ऊतक EVs प्राप्त करने के लिए अंतर ultracentrifugation द्वारा पीछा किया वर्णन करता है. ये ऊतक ईवीएस डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त हैं जैसे जैव-अणुक संरचना की विशेषता और अन्य अध्ययन जिनका उद्देश्य रोग मार्कर के रूप में उनकी शारीरिक या पैथोफिजियोलॉजिकल भूमिकाओं या संभावित अनुप्रयोगों की विशेषता है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन राष्ट्रीय कैंसर संस्थान अनुदान सीए-217833 से धन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 125 mL Erlenmeyer flask | Fisher scientific | FB500125 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Fisher scientific | FB500125 | |
| Curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Masking tape | Home supply store | ||
| Aluminum foil | Home supply store | ||
| Styrofoam pad | Home supply store | ||
| Absorbent Bench Underpad | Scientific inc. | B1623 | |
| Masterflex L/S Digital Miniflex Pump | Cole-parmer | ZX-07525-20 | |
| Water bath | Thermo Electron Precision | 2837 | |
| Blood collection sets | Becton Dickinson | 367292 | |
| Petri dish, clear lid 100×15 | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Falcon 70mm Nylon Cell Strainers | Fisher scientific | 352350 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Cotton Tipped Applicators | Moore medical | 69622 | |
| 25mL Serological Pipet | Falcon | 357525 | |
| Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser | BioSurplus | 203-2751 | |
| O2 gas | |||
| Isoflurane | |||
| Levo Plus Motorized Pipette Filler | Scilogex | 74020002 | |
| Centrifuge 5804R | Sigma-aldrich | 22628048 | |
| Beckman Coulter Optima L-100 XP | Beckman | 969347 | |
| Beckman Coulter Avanti JXN-26 | Beckman | B34182 | |
| 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman | 337922 | |
| JA-25.50Fixed-Angle Rotor | Beckman | 363055 | |
| Nalgene Round-bottom tube | Thermo Scientific | 3118-0028 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly | Beckman | 355618 | |
| Reagents | |||
| HyClone Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free | Fisher scientific | SH30588.01 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Fisher scientific | 17104019 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher scientific | SH30256.01 |
References
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