इस प्रोटोकॉल सामांय प्रक्रियाओं और गुणवत्ता नियंत्रण छोटी बूंद-आधारित, उच्च प्रवाह एकल सेल आरएनए-Seq तैयारी के लिए स्वस्थ वयस्क स्तनधारी एकल कोशिकाओं की तैयारी के लिए आवश्यक जांच का वर्णन करता है । अनुक्रमण पैरामीटर, संरेखण पढ़ें, और बहाव एकल-कक्ष bioinformatic विश्लेषण भी प्रदान की जाती हैं ।
एक ऊतक या microenvironment के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के हजारों भर में एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण कोशिका संरचना की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, कार्यात्मक राज्यों के भेदभाव, और आणविक मार्ग निहित मनाया ऊतक कार्य और पशु व्यवहार । तथापि, बरकरार के अलगाव, स्वस्थ एकल कोशिकाओं बाद के बहाव के लिए वयस्क स्तनधारी ऊतकों से एक सेल आणविक विश्लेषण चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस प्रोटोकॉल सामांय प्रक्रियाओं और गुणवत्ता नियंत्रण तंत्रिका तंत्र या त्वचा है कि बाद में निष्पक्ष एकल सेल आरएनए अनुक्रमण और विश्लेषण सक्षम से उच्च गुणवत्ता वयस्क एकल सेल की तैयारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक जांच का वर्णन करता है । बहाव bioinformatic विश्लेषण के लिए दिशानिर्देश भी दिए गए हैं ।
उच्च प्रवाह एकल सेल प्रौद्योगिकी के विकास के साथ1,2 और उपयोगकर्ता के अनुकूल bioinformatics उपकरण में प्रगति पर पिछले3दशक, उच्च संकल्प जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के एक नए क्षेत्र में उभरा है- एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण (scRNA-Seq). एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन पहले परिभाषित कोशिका आबादी के भीतर विविधता की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था, जैसे स्टेम सेल या कैंसर की कोशिकाओं में, या कोशिकाओं की दुर्लभ आबादी की पहचान करने के लिए4,5, जो अप्राप्य थे का उपयोग कर पारंपरिक बल्क आरएनए अनुक्रमण तकनीक । Bioinformatic उपकरण उपंयास उप की पहचान-आबादी (Seurat)2, एक psuedotime अंतरिक्ष (Monocle)6, के भीतर या आबादी के बीच सक्रिय संकेतन नेटवर्क की परिभाषा के साथ कोशिकाओं के क्रम के दृश्य सक्षम है ( दर्शनीय)7, एक कृत्रिम 3 डी अंतरिक्ष में एकल कोशिकाओं के विधानसभा की भविष्यवाणी (Seurat, और अधिक)8. वैज्ञानिक समुदाय के लिए उपलब्ध इन नए और रोमांचक विश्लेषण के साथ, scRNA-Seq तेजी से जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए नए मानक दृष्टिकोण बन रहा है ।
scRNA-Seq की विशाल क्षमता के बावजूद, तकनीकी skillsets एक साफ dataset उत्पादन और सही परिणाम की व्याख्या करने के लिए नए चेहरे के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है की आवश्यकता है । यहां, एक बुनियादी, लेकिन व्यापक प्रोटोकॉल, दृश्य और प्रकाशन के लिए डेटा की प्रस्तुति के लिए पूरे प्राथमिक ऊतकों से एकल कोशिकाओं के अलगाव से शुरू प्रस्तुत है (चित्रा 1) । सबसे पहले, स्वस्थ एकल कोशिकाओं के अलगाव चुनौतीपूर्ण समझा जा सकता है, के रूप में विभिंन ऊतकों एंजाइमी पाचन और बाद यांत्रिक पृथक्करण संवेदनशीलता के अपने अंश में बदलती हैं । यह प्रोटोकॉल इन आइसोलेशन चरणों में मार्गदर्शन प्रदान करता है और प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण चौकियों को पहचानता है । दूसरा, एक सेल प्रौद्योगिकी और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के बीच अनुकूलता और आवश्यकताओं को समझने भ्रमित किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता के अनुकूल, छोटी बूंद-आधारित एकल-कक्ष barcoding प्लेटफ़ॉर्म को कार्यान्वित करने और sequencing निष्पादित करने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है. अंत में, कंप्यूटर प्रोग्रामिंग एकल-कक्ष transcriptomic datasets का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण पूर्वावश्यकता है । यह प्रोटोकॉल r प्रोग्रामिंग भाषा के साथ प्रारंभ करने के लिए संसाधन प्रदान करता है और दो लोकप्रिय scRNA-Seq-विशिष्ट R पैकेज को कार्यान्वित करने पर मार्गदर्शन प्रदान करता है. एक साथ, इस प्रोटोकॉल scRNA-स्पष्ट, व्याख्यात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए Seq विश्लेषण प्रदर्शन में नए चेहरे गाइड कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल माउस में सबसे ऊतकों को समायोजित किया जा सकता है, और महत्वपूर्ण बात यह मानव ऊतक सहित अंय जीवों के साथ प्रयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है । ऊतक और उपयोगकर्ता के आधार पर समायोजन की आवश्यकता होगी ।
इस प्रोटोकॉल का पालन करते समय ध्यान में रखने के लिए कई विचार हैं; सहित, 1) चरणों में सभी गुणवत्ता नियंत्रण दिशा निर्देशों का पालन 1 और इस प्रोटोकॉल के 2 के लिए ब्याज के नमूने के भीतर सभी कोशिकाओं के एक व्यवहार्य एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है, जबकि सटीक कुल सेल संख्या गिनती सुनिश्चित करने ( चित्रा 2 में संक्षेप ). एक बार यह हासिल की है, और अगर सभी अनुकूलित शर्तों का पालन कर रहे हैं, गुणवत्ता नियंत्रण कदम (समय बचाने के लिए शाही सेना की गुणवत्ता और सेल नुकसान को कम करने) को छोड़ दिया जा सकता है । उच्च व्यवहार्यता के सफल अलगाव की पुष्टि ब्याज के ऊतकों से एकल कोशिकाओं को अत्यधिक किसी भी बहाव प्रसंस्करण से पहले की सिफारिश है । 2) के बाद से कुछ कोशिका प्रकार के तनाव के लिए दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील हैं, अत्यधिक पृथक्करण तकनीक अनजाने में जनसंख्या पक्षपात कर सकते हैं, इसलिए बहाव विश्लेषण की स्थापना । अनावश्यक सेलुलर बाल काटना और पाचन के बिना कोमल पृथक्करण उच्च सेलुलर पैदावार और ऊतक संरचना का एक सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । कतरनी बलों trituration, FACS और resuspension चरणों के दौरान होते हैं । 3) किसी भी आरएनए काम के साथ के रूप में, यह सबसे अच्छा के रूप में तैयार करने के दौरान संभव के रूप में नमूना में थोड़ा अतिरिक्त RNase परिचय । यह उच्च गुणवत्ता आरएनए बनाए रखने में मदद करेगा । स्वच्छ उपकरण और किसी भी उपकरण है कि RNase मुक्त नहीं है, लेकिन DEPC इलाज उत्पादों से बचने के लिए धोने के साथ ribonuclease अवरोधक समाधान का प्रयोग करें । 4) जितनी जल्दी हो सके तैयारी करें । यह उच्च गुणवत्ता आरएनए को बनाए रखने और सेल मौत को कम करने में मदद करेगा । ऊतक विच्छेदन लंबाई और पशु संख्या पर निर्भर करता है, एक ही समय में कई विच्छेदन/तैयारी शुरू करने पर विचार करें । 5) बर्फ पर कोशिकाओं को तैयार उच्च गुणवत्ता आरएनए बनाए रखने के लिए संभव है, कोशिका मृत्यु को कम करने, और धीमी गति से सेल संकेतन और transcriptional गतिविधि. हालांकि, बर्फ शीत प्रसंस्करण सबसे सेल प्रकार के लिए आदर्श है, कुछ सेल प्रकार (जैसे, न्यूट्रोफिल) बेहतर प्रदर्शन जब कमरे के तापमान पर संसाधित । 6) सेल की तैयारी के दौरान कैल्शियम, मैग्नीशियम, EDTA, और DEPC-इलाज वाले उत्पादों से बचें ।
यह प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है कि कैसे एकल कोशिकाओं की उचित तैयारी एकल कोशिकाओं और भेदभाव कार्यात्मक राज्यों या एक ऊतक के भीतर अद्वितीय सेलुलर पहचान के हजारों की transcriptional विविधता उजागर कर सकते हैं । प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन या ट्रांसजेनिक उपकरण की आवश्यकता नहीं है और मनुष्यों से उन सहित ब्याज के विभिंन ऊतकों से एकल कोशिकाओं के अलगाव के लिए लागू किया जा सकता है; प्रत्येक ऊतक अद्वितीय है और इस प्रोटोकॉल को ध्यान में रखते हुए समायोजन के कुछ डिग्री/
कक्षों के भीतर विविध और अति गतिशील transcriptional कार्यक्रमों ने एकल-कक्ष जीनोमिक्स के मूल्य पर बल दिया है. उच्च गुणवत्ता वाली आरएनए को अलग करने के अलावा, उच्च गुणवत्ता वाले डेटासेट के लिए आवश्यक एक महत्वपूर्ण नमूना तैयारी चरण यह सुनिश्चित करना है कि कोशिकाएं ऊतक से पूरी तरह से जारी की जाएं और वह कोशिकाएं स्वस्थ और अक्षुण्ण हों । यह अपेक्षाकृत सीधे आगे कोशिकाओं है कि आसानी से जारी कर रहे हैं, ऐसे परिसंचारी कोशिकाओं के रूप में या ऊतकों में जहां कोशिकाओं को ढीला बनाए रखा है, जैसे लसीकावत् ऊतकों में, को इकट्ठा करने के लिए है । लेकिन यह अंय वयस्क ऊतकों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, अत्यधिक विकसित सेलुलर वास्तुकला बड़ी दूरी फैले, extracellular मैट्रिक्स और अक्सर-कठोर cytoskeletal प्रोटीन सेल संरचना बनाए रखने में शामिल की वजह से । यहां तक कि कोशिकाओं की पूरी रिलीज के लिए उपयुक्त पृथक्करण तकनीकों के साथ, वहां क्षमता है कि कठोर और अक्सर लंबी प्रसंस्करण mRNA गुणवत्ता और कोशिका अखंडता में परिवर्तन होगा आवश्यक है । इसके अलावा, उच्च तापमान एंजाइम सहायता पृथक्करण के लिए इस्तेमाल भी transcriptional हस्ताक्षर29,30प्रभावित करते हैं । प्रोटोकॉल के इरादे के लिए गुणवत्ता नियंत्रण की जांच वर्तमान है, जैसे myelinated वयस्क तंत्रिका और extracellular मैट्रिक्स अमीर वयस्क त्वचा के रूप में ऊतकों का उपयोग कर, कैसे अनुकूलन के लिए इन बाधाओं को दूर करने में मदद कर सकते है प्रदर्शन ।
एक प्रमुख विचार जब किसी भी scRNA-Seq प्रयोग डिजाइन अनुक्रमण गहराई का विकल्प है । अनुक्रमण अत्यधिक मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है और पढ़ें गहराई बहुत कम किया जा रहा ड्रॉप-Seq2 का उपयोग करने के लिए अप करने के लिए ५,०००,००० पुस्तकें/14 एक पूर्ण लंबाई आरएनए-Seq विधि जैसे स्मार्ट-Seq का उपयोग कर से भिंन हो सकते हैं । अधिकांश scRNA-Seq प्रयोगों के रूप में १०,००० पढ़ता/सेल, जो आमतौर पर सेल प्रकार वर्गीकरण४१,४२के लिए पर्याप्त है के रूप में कम sequencing के साथ मॉडरेट करने के लिए उच्च अभिव्यक्ति टेप का पता लगा सकते हैं । उथले अनुक्रमण गहराई मूल्य की है अनुक्रमण लागत पर बचाने के लिए जब जटिल ऊतकों भर में दुर्लभ कोशिका आबादी का पता लगाने की कोशिश कर रहा है जहां कोशिकाओं के हजारों विश्वास परमशॆवर दुर्लभ आबादी के लिए आवश्यक हो सकता है । लेकिन उथले गहराई अनुक्रमण पर्याप्त नहीं है जब जीन अभिव्यक्ति और सूक्ष्म transcriptional हस्ताक्षर के साथ जुड़े प्रक्रियाओं पर विस्तृत जानकारी आवश्यक है । वर्तमान में, यह अनुमान है कि एक सेल में जीन के बड़े बहुमत ५००,००० के साथ पाया जाता है पढ़ता/सेल, लेकिन यह प्रोटोकॉल और ऊतक प्रकार४३,४४के आधार पर भिंन हो सकते हैं । जबकि पूर्ण लंबाई की प्रतिलिपि अनुक्रमण विधानसभा के लिए की जरूरत है दरकिनार और कर सकते हैं, इसलिए, उपंयास या दुर्लभ ब्याह वेरिएंट का पता लगाने, sequencing लागत अक्सर इस तरह के एक जटिल ऊतक प्रणाली शामिल कोशिकाओं के हजारों की जांच करने के लिए दृष्टिकोण स्केलिंग सीमा । इसके विपरीत, 3 ‘ टैग एकल सेल पुस्तकालयों इस प्रोटोकॉल में वर्णित लोगों के रूप में आम तौर पर कम जटिलता है और आमूलचूल अनुक्रमण की आवश्यकता होती है । यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पुस्तकालयों वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न पांच समर्थित sequencers में से एक पर अनुक्रम किया जा सकता: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq २५०० तेजी से चलाने और उच्च उत्पादन, 4) NextSeq 500/550, और 5) MiSeq.
एकल सेल आरएनए-Seq के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, कि नाजुक ऊतक और सेल हैंडलिंग के लिए की जरूरत को कम कर देता है अभी तक एकल कोशिका आरएनए-Seq के लाभों में से कुछ का कहना है, एकल नाभिक४५से आरएनए के विश्लेषण है. इस दृष्टिकोण और अधिक तेजी से आरएनए गिरावट को कम करने के प्रसंस्करण की अनुमति देता है, और अधिक चरम उपायों नाभिक की पर्याप्त रिहाई सुनिश्चित करने के लिए, और इस तरह की संभावना एक दिया ऊतक के भीतर सभी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व transcriptional प्रोफाइल का एक और अधिक विश्वास कब्जा के लिए अनुमति देता है । यह जाहिर है, केवल transcriptional गतिविधि के एक हिस्से को दिए गए सेल के भीतर मौजूद प्रदान करते हैं, इस प्रकार क्या प्रयोगात्मक उद्देश्यों ब्याज की इस दृष्टिकोण हो सकता है या उचित नहीं हो सकता है पर निर्भर करता है ।
एक दिए गए ऊतक के भीतर सेलुलर पहचान के पूर्ण लक्षण वर्णन के अलावा, scRNA-Seq डेटासेट के लिए सबसे मूल्यवान विश्लेषणों में से एक ‘ ‘ परिभाषित सेल आबादी ‘ भर में मध्यवर्ती transcriptional राज्यों का आकलन है. इन मध्यस्थ राज्यों की पहचान की आबादी है, जो पारंपरिक सामूहिक आरएनए-Seq दृष्टिकोण के साथ संभव नहीं था भीतर कोशिकाओं के बीच वंश संबंधों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । कई scRNA-Seq bioinformatic उपकरण अब इस स्पष्ट को विकसित किया गया है । इस तरह के उपकरण में शामिल प्रक्रियाओं का आकलन कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, कैंसर एक oncogenic/मेटास्टेटिक राज्य में संक्रमण की कोशिकाओं, स्टेम विविध टर्मिनल भाग्य या सक्रिय और quiescent राज्यों के बीच की प्रतिरक्षा कोशिकाओं में परिपक्व कोशिकाओं । कोशिकाओं में सूक्ष्म transcriptome मतभेद भी वंश पूर्वाग्रहों का संकेत हो सकता है कि, हाल ही में FateID तरह विकसित bioinformatic उपकरण,४७का अनुमान कर सकते हैं । संक्रमण कोशिकाओं के बीच भेद के बाद से transcriptional मतभेद दिया पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है सूक्ष्म हो सकता है, गहरी अनुक्रमण आवश्यक हो सकता है४६. सौभाग्य से, एक उथले अनुक्रम पुस्तकालय के कवरेज में वृद्धि की जा सकती है यदि डेटासेट की जांच में रुचि फिर से एक और फ्लो सेल पर पुस्तकालय चल रहा है ।
एक साथ लिया, इस प्रोटोकॉल एक आसान करने के लिए अनुकूलन कार्यप्रवाह है कि उपयोगकर्ताओं को एक प्रयोग के भीतर एकल कोशिकाओं के हजारों transcriptionally प्रोफ़ाइल सैकड़ों करने के लिए सक्षम बनाता है प्रदान करता है । एक scRNA-Seq डेटासेट के अंतिम गुणवत्ता अनुकूलित सेल अलगाव, प्रवाह cytometry, सीडीएनए पुस्तकालय पीढ़ी, और कच्चे जीन बारकोड मैट्रिक्स की व्याख्या पर निर्भर करता है । इस अंत करने के लिए, इस प्रोटोकॉल सभी महत्वपूर्ण कदम है कि आसानी से विविध ऊतक प्रकार के अध्ययन को सक्षम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है की एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम UCDNA सेवाओं की सुविधा में समर्थन स्टाफ स्वीकार करते हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैलगरी विश्वविद्यालय में पशु देखभाल सुविधा स्टाफ । हम अपने bioinformatics समर्थन और जेएनएन Durruthy के लिए अपने तकनीकी समर्थन के लिए मैट Workentine धंयवाद । यह काम एक CIHR अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था (R.M. और J.B.), J.B. के लिए एक CIHR नए अन्वेषक पुरस्कार, और एक अलबर्टा बच्चों के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान फैलोशिप (J.S.).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |