Denne protokollen beskriver generelle prosesser og kvalitetskontroll sjekker nødvendig for sunn voksen pattedyr enkeltceller forberedte slippverktøy-basert, høy gjennomstrømming enkeltcelle RNA-Seq forberedelser. Sekvensering parametere, tilbys Les justering og nedstrøms encellede bioinformatic analyse også.
Analyse av enkeltcelle genuttrykk over tusen individuelle celler innenfor en vev eller microenvironment er et verdifullt verktøy for å identifisere celle komposisjon, diskriminering av funksjonelle stater og molekylære baner underliggende observert vev funksjoner og dyrenes atferd. Imidlertid kan isolering av intakt, sunn enkeltceller fra voksen pattedyr vev for påfølgende nedstrøms enkeltcelle molekylær analyse være utfordrende. Denne protokollen beskriver generelle prosesser og kvalitetskontroll sjekker nødvendig for å få høy kvalitet voksen enkeltcelle preparater fra nervesystemet eller hud som aktivert påfølgende upartiske enkeltcelle RNA sekvensering og analyse. Retningslinjer for nedstrøms bioinformatic analyse tilbys også.
Med utviklingen av høy gjennomstrømning enkeltcelle teknologi1,2 og fremskritt i brukervennlig Bioinformatikk verktøy over de siste tiår3, et nytt felt av høyoppløselige gene expression analyse har dukket opp- encellede RNA sekvensering (scRNA-Seq). Studiet av enkeltcelle genuttrykk ble først utviklet identifisere heterogenitet innenfor definerte celle populasjoner, som i stilk celler og kreftceller, eller identifisere sjeldne bestander av celler4,5, som var uoppnåelig med tradisjonelle bulk RNA sekvensering teknikker. Bioinformatic verktøy har aktivert identifikasjon av romanen Sub-populasjoner (Seurat)2, visualisering av celler langs en psuedotime plass (Monocle)6, definisjonen av aktive signalnettverk nettverk i eller mellom populasjoner ( NATURSKJØNNE)7, prediksjon av enkelt-celler i en kunstig 3D-rom (Seurat og mer)8. Med disse nye og spennende analyser tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet, er scRNA-Seq raskt bli den nye tilnærmingen til gene expression analyse.
Til tross for det store potensialet i scRNA-Seq, kan teknisk skillsets kreves for å produsere ren dataset og nøyaktig tolke resultatene være utfordrende for nykommere. En grunnleggende, men omfattende protokoll, fra isolering av enkeltceller fra hele primære vev visualisering og presentasjon av data for publisering her presenteres (figur 1). Først kan isolering av sunn enkeltceller anses utfordrende, ulike vev variere i deres grad av følsomhet for enzymatisk fordøyelsen og påfølgende mekanisk dissosiasjon. Denne protokollen gir følgende isolasjon og identifiserer viktige kvalitetskontroll sjekkpunkter gjennom hele prosessen. Andre, forstå kompatibilitet og krav mellom enkeltcelle teknologi og neste generasjons sekvensering kan være forvirrende. Denne protokollen gir retningslinjer for å implementere en brukervennlig, slippverktøy-baserte encellede barcoding plattform og utføre sekvensering. Endelig er programmering en viktig forutsetning for å analysere encellede transcriptomic datasett. Denne protokollen gir ressurser i å komme i gang med programmeringsspråket R og gir veiledning om implementering av to populære scRNA-Seq-R pakker. Sammen, veileder denne protokollen nykommere i utføre scRNA-Seq analyse for å få klar, interpretable resultater. Denne protokollen kan justeres til de fleste vev i musen, og viktigst kan bli endret for bruk med andre organismer, inkludert menneskelig vev. Justeringer avhengig av vev og brukeren vil være nødvendig.
Det er flere hensyn å huske på når du følger denne protokollen; inkludert 1) etter alle kvalitetskontroll retningslinjer i trinn 1 og 2 av denne protokollen anbefales å sikre en levedyktig enkeltcelle suspensjon av alle celler i utvalget rundt samtidig sikre nøyaktige totalt antall celletall (sammenfattet i figur 2 ). Når dette er oppnådd, og hvis alle optimalisert forholdene er fulgt, kvalitetskontroll trinnene kan drop (å spare tid – bevarer RNA kvalitet og redusere celle tap). Bekrefter vellykket isolering av høy levedyktighet enkeltceller fra vevet rundt er svært anbefaler før noen nedstrøms behandling. 2) siden noen celletyper er mer følsomme enn andre stress, kan overdreven dissosiasjon teknikker utilsiktet bias befolkningen, derfor confounding nedstrøms. Mild dissosiasjon uten unødvendige mobilnettet klipping og fordøyelsen er avgjørende for å oppnå høy mobilnettet avkastning og en nøyaktig gjengivelse av vev komposisjon. Skjær krefter oppstå under føden, FACS og rørets trinnene. 3) som med RNA arbeid, er det best å innføre som lite ekstra RNase i prøven som mulig under forberedelse. Dette vil hjelpe opprettholde høy kvalitet RNA. Bruke ribonuclease hemmer løsninger med skylling ren verktøy og utstyr som ikke er RNase-fri men unngå DEPC-behandlet produkter. 4) utføre forberedelser så raskt som mulig. Dette vil hjelpe opprettholde høy kvalitet RNA og redusere celledød. Avhengig av vev disseksjon lengde og dyr tall, Vurder å starte flere disseksjoner/forberedelser samtidig. 5) forberede celler på is når mulig å opprettholde høy kvalitet RNA, redusere celledød og langsom celle signalnettverk og transcriptional aktivitet. Riktignok iskald behandling er ideell for de fleste celletyper, gir noen celletyper (f.eks, nøytrofile) bedre når behandlet ved romtemperatur. 6) unngå kalsium, magnesium, EDTA og DEPC-behandlet produkter under cellen forberedelse.
Denne protokollen demonstrerer hvordan riktig utarbeidelse av enkeltceller kan avdekke den transcriptional heterogeniteten av enkeltceller og diskriminere funksjonelle stater eller unike mobilnettet identiteter innenfor en vev. Protokollen krever ikke fluorescerende reporter proteiner eller transgene verktøy og kan brukes på isolasjon av enkeltceller fra ulike vev inkludert de fra mennesker; holde i tankene hvert vev er unik, og denne protokollen krever en viss justering/ombygging.
Allsidig og svært dynamisk transcriptional programmene i celler har understreket verdien av én celle genomics. Bortsett fra isolere høykvalitets RNA, et kritisk eksempel forberedelse skritt nødvendig for høykvalitets datasett er å sikre at celler helt frigjøres fra vev, og at cellene er sunn og intakt. Dette er relativt rett frem for å samle celler som er lett utgitt, som sirkulerende celler eller i vev celler beholdes der løst, som lymfoid vev. Men dette kan være utfordrende for andre voksen vev, på grunn av høyt utviklet mobilnettet arkitektur som spenner over store avstander, rundt ekstracellulær matrix og ofte stive cellen cytoskjelett proteiner involvert i vedlikehold cellestruktur. Selv med riktig dissosiasjon teknikker for den fulle versjonen av celler er det mulig at strenge og ofte lang behandling kreves ville endre mRNA kvalitet og celle integritet. I tillegg påvirke til høye temperaturer brukes for enzym-assistert dissosiasjon også transcriptional signaturer29,30. Hensikten med protokollen er å presentere kvalitetskontroll sjekker, bruker vev som myelinated voksen nerve og ekstracellulær matrix-rik voksen huden, for å demonstrere hvordan optimalisering kan hjelpe for å overvinne disse hindringene.
En viktig faktor når du utformer en scRNA-Seq eksperiment er valget av sekvensering dybde. Sekvensering kan være svært multiplekset og lese dybde kan variere fra å være svært lav bruker Drop-Seq2 til opp til 5 millioner leser/mobiltelefon14 bruke en full lengde RNA-Seq som Smart-Seq. De fleste scRNA-Seq eksperimenter kan oppdage moderat til høy uttrykk utskrifter med sekvensering så lavt som 10 000 leser/mobiltelefon, hvilke er vanligvis nok for celle type klassifisering41,42. Grunne sekvensering dybden er av verdi å lagre sekvensering kostnader når prøver å finne sjeldne celle populasjoner over komplekse vev hvor tusenvis av celler kanskje behøves å trygt tilskrive sjeldne populasjoner. Men grunne dybden sekvensering er ikke tilstrekkelig når detaljert informasjon om genuttrykk og prosesser knyttet til subtile transcriptional signaturer er nødvendig. Det er foreløpig anslått at det store flertallet av gener i en celle er oppdaget med 500.000 leser/mobiltelefon, men dette kan variere avhengig av protokollen og vev skriver43,44. Mens full transkripsjon omgår behovet for montering og kan derfor oppdage roman eller sjeldne skjøte varianter, begrenser sekvensering kostnader ofte skalering slike tilnærminger for å undersøke tusenvis av celler som består av en kompleks vev system. Derimot merket 3 encellede biblioteker som de som er beskrevet i denne protokollen vanligvis har lavere kompleksitet og krever grunnere sekvensering. Det er viktig å merke seg at biblioteker generert ved hjelp av beskrevet protokollen kan være sekvensielt på en av fem støttes sequencere: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 rask kjøre og høy produksjon, 4) NextSeq 500/550 og 5) MiSeq.
En alternativ tilnærming til enkeltcelle RNA-Seq, som reduserer behovet for sarte vevet og håndtering ennå vedlikeholder noen av fordelene med enkeltcelle RNA-Seq, er analysen av RNA fra enkelt kjerner45. Denne tilnærmingen kan raskere behandling reduserer RNA fornedrelse, og flere ekstrem måler å sikre tilstrekkelig utgaven av kjerner, og dermed sannsynligvis gir en mer trygg fangst av transcriptional profiler som representerer alle celler innenfor en gitt vev. Dette, selvfølgelig, bare gi en del av transcriptional aktivitet stede i en gitt celle, dermed avhengig av hva eksperimentelle mål er rundt denne tilnærmingen kan eller ikke kan være riktig.
Foruten komplett karakterisering av mobilnettet identiteter innenfor en gitt vev er en av de mest verdifulle analysene for scRNA-Seq datasett vurdering av mellomliggende transcriptional tilstander over ‘definerte’ celle populasjoner. Disse mellomliggende tilstander kan gi innsikt i avstamning relasjonene mellom celler i identifiserte befolkninger, som ikke var mulig med tradisjonelle bulk RNA-Seq tilnærminger. Flere scRNA-Seq bioinformatic verktøy er nå utviklet for å klargjøre dette. Slike verktøy kan vurdere prosessene involvert i, for eksempel kreftceller overgang til en kreftfremkallende/metastatisk tilstand, stamceller modning i ulike terminal skjebne eller immunceller skytteltrafikk mellom aktive og quiescent. Subtile transcriptome forskjeller i celler kan også være indikativ av avstamning biases, nylig utviklede bioinformatic verktøy som FateID, kan antyde47. Siden forskjellene mellom overgang celler kan være vanskelig å fastslå gitt transcriptional forskjellene kan være subtile, dypere sekvensering kan være nødvendig46. Heldigvis kan dekning av en lav sekvensert bibliotek økes hvis interessert i utprøvende datasettet ytterligere ved å kjøre biblioteket på nytt med en annen flyt celle.
Samlet gir denne protokollen en lett-å-adapt arbeidsflyt som gjør det mulig å transcriptionally profil hundrevis til tusenvis av enkelt-celler i et eksperiment. Den endelige kvaliteten på scRNA-Seq dataset er avhengig av optimalisert cellen aisolering, flowcytometri, cDNA biblioteket generasjon og tolkning av rå gen-strekkode matriser. Dette gir denne protokollen en omfattende oversikt over alle viktige trinn som kan enkelt endres for å aktivere studier av ulike vev.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner støttepersonale på UCDNA tjenester anlegget og Animal Care anlegg personalet på University of Calgary. Vi takker Matt Workentine bioinformatics underhold og Jens Durruthy hans kundestøtte. Dette arbeidet ble finansiert av en CIHR grant (RM og JB), en CIHR ny etterforsker tildeling JB, og en Alberta barns helse Research Institute fellesskap (js).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |