Denne protokol beskriver de generelle processer og kvalitetskontrol kontrol nødvendig for at forberede droplet-baseret, høj overførselshastighed enkelt celle RNA-Seq præparater sunde voksne pattedyr enkelt celler. Sekventering parametre, tilbydes Læs justering og downstream encellede bioinformatic analyse også.
Analyse af enkelt celle genekspression på tværs af tusindvis af individuelle celler i et væv eller mikromiljø er et værdifuldt redskab til at identificere celle sammensætning, forskelsbehandling af funktionel stater og molekylær veje underliggende observerede væv funktioner og dyrs adfærd. Isolering af intakt, sund enkelt celler fra voksne pattedyr væv for efterfølgende downstream enkelt celle Molekylær analyse kan dog være udfordrende. Denne protokol beskriver de generelle processer og kvalitetskontrol kontrol er nødvendige for at opnå høj kvalitet voksen enkelt celle præparater fra nervesystemet eller hud der aktiveret efterfølgende upartiske enkelt celle RNA sekvensering og analyse. Retningslinjer for downstream bioinformatic analyse er også tilgængelige.
Med udviklingen af high throughput enkelt celle teknologi1,2 og fremskridt i brugervenlige bioinformatik værktøjer over det sidste årti3opstået et nyt felt af høj opløsning gen expression analyse- encellede RNA sekventering (scRNA-Seq). Studiet af enkelt celle genekspression blev først udviklet til at identificere heterogenitet inden for definerede cellepopulationer, såsom i stamceller eller kræftceller, eller til at identificere sjældne populationer af celler4,5, som var uopnåelig ved hjælp af traditionelle bulk RNA sekventering teknikker. Bioinformatic værktøjer har aktiveret identifikation af roman delpopulationer (Seurat)2, visualisering af celler langs en psuedotime plads (Monocle)6, definition af aktiv signaling netværk inden for eller mellem populationer ( NATURSKØNNE)7, forudsigelse af forsamlingen af single-celler i en kunstig 3D space (Seurat, og mere)8. Med disse nye og spændende analyser tilgængelige til det videnskabelige samfund bliver scRNA-Seq hurtigt-den nye standard metode til gen expression analyse.
Trods det enorme potentiale i scRNA-FF., kan tekniske skillsets kræves for at producere en ren datasæt og præcist fortolke resultaterne være udfordrende for nytilkomne. En grundlæggende, men omfattende protokol, startende fra isolering af enkelt celler fra hele primære væv til visualisering og præsentation af dataene til offentliggørelse her præsenteres (figur 1). Først, isolering af sunde enkelt celler kan anses for udfordrende, som forskellige væv varierer i deres grad af følsomhed over for enzymatisk fordøjelse og efterfølgende mekanisk dissociation. Denne protokol giver vejledning i fremgangsmåden isolation og identificerer vigtige kvalitetskontrol checkpoints under hele processen. Andet forståelse kompatibilitet og krav mellem enkelt celle teknologi og næste generation sequencing kan være forvirrende. Denne protokol giver retningslinjer for at gennemføre en brugervenlig, droplet-baserede encellede stregkodesystem platform og udføre sekvensering. Endelig, computerprogrammering er en vigtig forudsætning for analysere encellede transkriptom datasæt. Denne protokol indeholder ressourcer for at komme i gang med programmeringssproget Rasmussen og giver vejledning i implementering af to populære scRNA-Seq-specifikke R pakker. Sammen, kan denne protokol guide nyankomne i udfører scRNA-Seq analyse for at opnå klare og fortolkelige resultater. Denne protokol kan tilpasses de fleste væv i musen, og vigtigere kunne ændres til brug med andre organismer, herunder humane væv. Vil være nødvendigt med korrektioner afhængig af væv og brugeren.
Der er flere overvejelser at huske mens efter denne protokol; herunder, 1) efter alle kvalitetskontrol retningslinjer i trin 1 og 2 i denne protokol er anbefales for at sikre en levedygtig fælles cellesuspension af alle celler i stikprøven af interesse samtidig sikre nøjagtige samlede celle nummer tæller (sammenfattet i figur 2 ). Når dette er opnået, og hvis alle de betingelser, der er optimeret følges, kvalitetskontrol trin kan være faldet (til at spare tid – bevare RNA kvalitet og reducere celle tab). Bekræfter vellykket isolation af høj rentabilitet enkelt celler fra vævet af interesse stærkt anbefale før nogen nedstrøms behandling. 2) da nogle celletyper er mere følsomme end andre til stress, kan overdreven dissociation teknikker uforvarende bias befolkning, derfor confounding downstream analyse. Blid dissociation uden unødvendige cellulære klipning og fordøjelsen er kritisk for at opnå høje cellulære udbytter og en nøjagtig repræsentation af vævssammensætning. Shear styrker forekomme i ændring, FACS og resuspension skridt. 3) som med enhver RNA arbejde, er det bedst at indføre som lidt ekstra RNase i stikprøven som muligt under forberedelse. Dette vil hjælpe med at opretholde høj kvalitet RNA. Bruge ribonuklease-inhibitor løsninger med skylning til ren værktøjer og udstyr, ikke der er RNase-fri, men undgå DEPC-behandlet produkter. 4) udføre præparater så hurtigt som muligt. Dette vil hjælpe opretholde høj kvalitet RNA og reducere celledød. Afhængig af væv dissektion længde og animalske nummer, overveje starter flere dissektioner/præparater samtidig. 5) forberede celler på is, når muligt at opretholde høj kvalitet RNA, reducere celledød og langsom celle signalering og transcriptional aktivitet. Omend iskold forarbejdning er ideel til de fleste celletyper, udfører visse celletyper (fx, neutrofiler) bedre når forarbejdet ved stuetemperatur. 6) undgå calcium, magnesium, EDTA og DEPC-behandlet produkter under celle forberedelse.
Denne protokol viser hvordan den passende forberedelse af enkelt celler kan afdække den transcriptional heterogenitet af tusindvis af enkelt celler og diskriminere funktionel stater eller unikke cellulære identiteter i et væv. Protokollen kræver ikke fluorescerende reporter proteiner eller transgene værktøjer og kan anvendes til isolering af enkelt celler fra forskellige væv af interesse herunder fra mennesker; holde i sindet hver væv er unikke og denne protokol vil kræve en vis grad af tilpasning/ændring.
De forskelligartede og yderst dynamisk transcriptional programmer inden for celler har fremhævet værdien af encellede genomforskning. Bortset fra isolere høj kvalitet RNA, en kritisk prøve præparationstrin nødvendige for høj kvalitet datasæt er at sikre at cellerne frigives helt fra væv og celler er sund og intakt. Dette er forholdsvis ligetil for indsamling celler, der er let løst, såsom cirkulerende celler eller væv celler bevares hvor løst, såsom i lymfoide væv. Men det kan være udfordrende for andre voksent væv, på grund af den højt udviklede cellulære arkitektur der strækker sig over store afstande, omkring ekstracellulære matrix og ofte stive cytoskeletal proteiner involveret i at opretholde cellestruktur. Selv med passende dissociation teknikker for fuld frigivelse af celler er der mulige at streng og ofte langvarig behandling kræves ville ændre mRNA kvalitet og celle integritet. Derudover påvirke de høje temperaturer bruges til enzym-assisteret dissociation også transcriptional signaturer29,30. Hensigten med protokollen er at præsentere kvalitetskontrol Kontroller, ved hjælp af væv som voksen myelinerede nerve og den ekstracellulære matrix-rige voksen hud, for at demonstrere, hvordan optimering kan hjælpe med at overvinde disse hindringer.
En vigtig overvejelse ved udformningen af enhver scRNA-Seq eksperiment er valget af sekventering dybde. Sekventering kan være yderst multipleksede og læse dybde kan variere fra at være meget lav, ved hjælp af Drop-Seq2 til op til 5 millioner lyder/celle14 ved hjælp af en fuld-længde RNA-Seq metode som Smart-FF. De fleste scRNA-Seq eksperimenter kan registrere moderat til høj udtryk udskrifter med sekventering så lavt som 10.000 læser/celle, som er normalt tilstrækkelig til celle type klassificering41,42. Lavvandede sekventering dybde er af værdi at spare på udgifterne til sekvensering, når de forsøger at afsløre sjældne cellepopulationer på tværs af komplekse væv hvor tusindvis af celler kan være nødvendigt at trygt tilskrive sjældne populationer. Men lavvandede dybde sekventering er ikke tilstrækkelige, når detaljerede oplysninger om genekspression og processer forbundet med subtile transcriptional signaturer er nødvendige. I øjeblikket anslås det, at det store flertal af gener i en celle er fundet med 500.000 læser/celle, men dette kan variere afhængigt af protokollen og væv Skriv43,44. Mens fuld længde udskrift sekventering omgår behovet for forsamlingen og kan derfor afsløre roman eller sjældne splice varianter, begrænse sekventering omkostningerne ofte skalering sådanne tilgange for at undersøge tusindvis af celler, der omfatter et komplekst væv system. Derimod markeret 3′ én celle biblioteker som de, der er beskrevet i denne protokol typisk har lavere kompleksitet og kræver lavvandede sekvensering. Det er vigtigt at bemærke, at biblioteker genereret ved hjælp af den beskrevne protokol kan blive sekventeret på en af fem understøttede sequencere: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 hurtige Run og højkapacitet, 4) NextSeq 500/550 og 5) MiSeq.
En alternativ tilgang til enkelt celle RNA-FF., der reducerer behovet for fine vævs- og håndtering endnu bevarer nogle af fordelene ved enkelt celle RNA-FF., er analysen af RNA fra enkelt kerner45. Denne tilgang giver mulighed for hurtig behandling reducerer RNA nedbrydning, og mere ekstreme foranstaltninger for at sikre tilstrækkelig frigivelse af kerner, og dermed sandsynligvis giver mulighed for en mere sikker erobringen af de transcriptional profiler, der repræsenterer alle celler i et givet væv. Dette giver naturligvis kun en del af det transkriptionel aktivitet inden for en given celle, således alt efter hvad eksperimentel mål er af interesse denne fremgangsmåde måske eller måske ikke være passende.
Udover den fuldstændig karakterisering af cellulære identitet inden for en given væv er en af de mest værdifulde analyser for scRNA-Seq datasæt vurdering af mellemliggende transcriptional stater på tværs ‘defineret’ cellepopulationer. Disse mellemliggende stater kan give indsigt i lineage relationerne mellem celler inden for identificerede populationer, hvilket ikke var muligt med traditionelle bulk RNA-Seq tilgange. Flere scRNA-Seq bioinformatic værktøjer er nu blevet udviklet for at belyse dette. Sådanne værktøjer kan vurdere processer involveret i, for eksempel, kræftceller skiftes til slutbrugeren muterede/metastatisk stamceller modnes til forskellige terminal skæbner eller immunceller shuttling mellem aktiv og inaktiv stater. Subtile transkriptom forskelle i celler kan også være tegn på lineage bias, nyligt udviklede bioinformatic værktøjer som FateID, kan udlede47. Da sondringer mellem skiftes celler kan være vanskeligt at fastslå givet transcriptional forskellene kan være subtile, dybere sekventering kan være nødvendige46. Dækning af en grundt sekventeret bibliotek kan heldigvis øges, hvis du er interesseret i sondering datasæt yderligere af re-løb biblioteket på en anden flow celle.
Tilsammen giver denne protokol en nem at tilpasse arbejdsproces, der gør det muligt for brugerne at transcriptionally profil hundreder til tusinder af single-celler i et eksperiment. Den endelige kvalitet af en scRNA-Seq datasæt bygger på optimeret celle isolation, flowcytometri, cDNA bibliotek generation og fortolkning af rå gen-stregkode matricer. Med henblik herpå giver denne protokol et samlet overblik over alle vigtige skridt, som nemt kan redigeres for at aktivere undersøgelser af forskellige vævstyper.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender personalet på UCDNA tjenester facilitet, samt dyrs pleje facilitet personalet på University of Calgary. Vi takke Matt Workentine for hans støtte i bioinformatik og Jens Durruthy for hans teknisk support. Dette arbejde blev finansieret af et CIHR tilskud (R.M. og JB), en CIHR nye Investigator Award til J.B. og en Alberta børns sundhed Research Institute Fellowship (js).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |