यहाँ हम एक गहरी sequencing दृष्टिकोण है कि नवजात 3 की एक निष्पक्ष दृढ़ संकल्प प्रदान करता है वर्तमान-टर्मिनी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एकल असहाय डीएनए अणुओं के उत्परिवर्तन प्रोफाइल । मुख्य आवेदन नवजात retroviral पूरक DNAs (cDNAs), retroviral रिवर्स प्रतिलेखन की प्रक्रिया के दौरान उत्पंन मध्यवर्ती के लक्षण वर्णन है ।
वायरस प्रतिकृति के दौरान न्यूक्लिक एसिड मध्यवर्ती की निगरानी एंटीवायरल यौगिकों और वायरल डीएनए संश्लेषण पर मेजबान सेल प्रोटीन की कार्रवाई के प्रभाव और तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । यहां हम एक सेल की कमी का पता आधारित, उच्च कवरेज, और उच्च संकल्प परख है कि वायरस के संक्रमण के शारीरिक संदर्भ के भीतर retroviral रिवर्स प्रतिलेखन मध्यवर्ती परिभाषित करने में सक्षम है । वर्णित विधि 3 ‘-नवजात पूरक डीएनए के टर्मिनी (सीडीएनए) एचआईवी के भीतर अणुओं-1 एकल न्यूक्लियोटाइड संकल्प पर संक्रमित कोशिकाओं को कब्जा । प्रोटोकॉल पूरे सेल डीएनए की कटाई शामिल है, संकर पर कब्जा, अनुकूलक बंधाव, जेल शुद्धि, पीसीआर प्रवर्धन, गहरी अनुक्रमण, और डेटा विश्लेषण द्वारा आकार अंश के माध्यम से वायरल डीएनए के संवर्धन लक्षित । एक महत्वपूर्ण कदम है अनुकूलक अणुओं के कुशल और निष्पक्ष बंधाव 3 ‘ खोलने के लिए-डीएनए टर्मिनी । वर्णित विधि के आवेदन एक दिए गए नमूने में प्रत्येक विशेष लंबाई की रिवर्स टेप की बहुतायत निर्धारित करता है । यह भी रिवर्स टेप में (आंतरिक) अनुक्रम भिंनता के बारे में जानकारी प्रदान करता है और इस तरह किसी भी संभावित उत्परिवर्तनों । सामांय में, परख किसी भी डीएनए से संबंधित प्रश्नों के लिए उपयुक्त है ‘ 3-विस्तार, बशर्ते कि टेंपलेट अनुक्रम जाना जाता है ।
काटना और वायरल प्रतिकृति पूरी तरह से समझने के लिए, तेजी से परिष्कृत तकनीक है कि कब्जा प्रतिकृति मध्यवर्ती आवश्यक हैं । विशेष रूप से, संक्रमित कोशिकाओं के संदर्भ में वायरल न्यूक्लिक एसिड प्रजातियों की सटीक परिभाषा नई अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, के बाद से कई वायरल प्रतिकृति तंत्र की तारीख को अलग इन विट्रो प्रतिक्रियाओं में जांच की गई है । एक प्रमुख उदाहरण retroviruses में रिवर्स प्रतिलेखन की प्रक्रिया है, जैसे मानव इम्यूनो वायरस 1 (एचआईवी-1) । एचआईवी के विभिंन कदम-1 रिवर्स प्रतिलेखन, जिसके दौरान वायरल एंजाइम रिवर्स transcriptase (आरटी) डबल-असहाय डीएनए में एकल-असहाय आरएनए जीनोम प्रतियां, प्राइमरी विस्तार परख में शुद्ध प्रोटीन और न्यूक्लिक के साथ मुख्य रूप से अध्ययन किया गया है एसिड1,2,3,4,5। जबकि मौलिक सिद्धांतों की स्थापना की थी, ऐसे परख सभी वायरल और सेलुलर घटकों को शामिल नहीं है और शामिल कारकों के जैविक रूप से प्रासंगिक stoichiometries को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं । इसलिए, हम एक शक्तिशाली तकनीक के लिए उनके सटीक सीडीएनए 3 ‘ के साथ रिवर्स प्रतिलेखन मध्यवर्ती के स्पेक्ट्रा निर्धारित करने के लिए डिजाइन-टर्मिनी (यानी, उनके सटीक लंबाई का निर्धारण) और जीने के संक्रमण के संदर्भ में न्यूक्लियोटाइड दृश्यों कक्ष6. समय पाठ्यक्रम प्रयोगों से डेटा का संग्रह एंटीवायरल अणुओं या प्रोटीन की उपस्थिति के रूप में विभिन्न स्थितियों के तहत टेप के प्रोफ़ाइल की तुलना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, कि दक्षता और डीएनए संश्लेषण की processivity को प्रभावित कर सकते हैं और संचय. यह प्राकृतिक रोगज़नक़ जीवन चक्र, जो अक्सर लक्षित दवा डिजाइन और सफल चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए आधार है की एक अधिक विस्तृत समझ की अनुमति देता है ।
एचआईवी-1 उल्टा प्रतिलेखन एक tRNA प्राइमर के एनीलिंग द्वारा जीनोमिक आरएनए टेंपलेट है, जो तो आरटी द्वारा विस्तारित करने के लिए एक कम एकल-कतरा सीडीएनए प्रतिलिपि का उत्पादन किया जाता है एक शूंय-किनारा मजबूत-बंद (-एसएसएस) (देखो के लिए शुरू की घटनाओं की एक श्रृंखला शामिल चित्रा 1) । बाद में,-एसएसएस सीडीएनए 5 ‘-लांग टर्मिनल दोहराने (बाएं से दाएं) 3 ‘ जीनोमिक आरएनए, जहां यह anneals और शूंय से जारी आरटी मध्यस्थता बढ़ाव के लिए प्राइमर के रूप में कार्य करता है की लीटर के बाएं से स्थानांतरित किया जाता है (रिवर्स प्रतिलेखन पर समीक्षा देखें1 , 2 , 3 , 4). यह पहला किनारा हस्तांतरण दर-रिवर्स प्रतिलेखन के कदम को सीमित करने में से एक है; अत: sss सीडीएनए संचय करने के लिए जाना जाता है । संक्रमित कोशिकाओं में रिवर्स प्रतिलेखन उत्पादों पर कब्जा करने के लिए मूल कार्यप्रवाह और पुस्तकालय डिजाइन चित्रा 2aमें उल्लिखित है । विशिष्ट प्राइमर और विश्लेषण सेटिंग्स है कि प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है और तालिका 1 लक्ष्य में सूचीबद्ध सभी जल्दी रिवर्स प्रतिलेखन सीडीएनए मध्यवर्ती की लंबाई सीमा के भीतर 23 करने के लिए ~ ६५० nt, जो शामिल है 180-182 nt-sss डीएनए । हालांकि, रणनीति के लिए उपयुक्त मामूली रूपांतरों न केवल देर प्रतिलेखन उत्पादों लेकिन यह भी अंय वायरस और प्रणालियों, जहां उद्देश्य 3 का पता लगाने के लिए है आवेदन की अनुमति देगा ‘-ओह युक्त डीएनए समाप्त होता है । विचार करने के लिए महत्वपूर्ण सीमाएं पुस्तकालय में अंतिम पीसीआर उत्पाद की लंबाई रेंज शामिल हैं; विशेष रूप से, टेंपलेट्स जिसमें खुले 3 ‘ पर अनुकूलक के बीच की दूरी-टर्मिनस और ऊपर प्राइमर साइट से अधिक ~ १००० nt की संभावना कम कुशलता से अनुक्रम होगा, संभावित पुस्तकालय की तैयारी के दौरान भ्रामक तकनीकी पूर्वाग्रह शुरू ( अधिक जानकारी और अनुकूलन सुझावों के लिए चर्चा देखें) ।
पहले 3 ‘ के व्यवस्थित दृढ़ संकल्प के लिए तकनीक की सूचना दी-न्यूक्लिक एसिड किस्में के टर्मिनी आरएनए पर ध्यान केंद्रित किया है, नहीं डीएनए, अणु । एक उदाहरण है 3 ‘ रेस (सीडीएनए समाप्त होता है की तेजी से प्रवर्धन)7, जो mRNA के polyadenylation पर निर्भर करता है । इसके अलावा, अनुकूलक बंधाव आधारित रणनीति आरएनए ligases को रोजगार विकसित किया गया है, जो RLM-दौड़ (आरएनए ligase-मध्यस्थता दौड़)8 या फीता (बंधाव आधारित प्रवर्धन के रूप में)9शामिल किया गया है. यह महत्वपूर्ण है कि बंधाव आधारित प्रवर्धन किसी भी बंधाव प्रतिक्रिया ही द्वारा शुरू पूर्वाग्रह के प्रति संवेदनशील हैं । उदाहरण के लिए, बंधाव 3 ‘ स्थिति, अनुक्रम, कुल अणु लंबाई, या स्थानीय संरचना में एक विशेष न्यूक्लियोटाइड के आधार पर अधिक या कम कुशल हो सकता है । इस तरह के ligase वरीयताओं को readout, जो हम और दूसरों में9,10मनाया है में अणुओं और मिथ्या छाप के अधूरा कब्जा करने के लिए सीसा । यहां वर्णित प्रोटोकॉल में एडेप्टर अतिरिक्त कदम के दौरान बंधाव पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, हम बंधाव रणनीतियों की एक संख्या का परीक्षण किया और एक hairpin एकल असहाय डीएनए अनुकूलक के साथ टी-4 डीएनए ligase के उपयोग पाया (के रूप में Kwok एट अलद्वारा वर्णित है । 11) के पास मात्रात्मक बंधाव है कि बंधाव दक्षता में महत्वपूर्ण अंतर में परिणाम नहीं किया जब नियंत्रण oligonucleotides6के एक विशेष रूप से चयनित सेट के साथ मूल्यांकन के साथ ही प्रक्रिया हो । इस बंधाव रणनीति का विकल्प है, इसलिए, इस प्रोटोकॉल की सफलता में एक महत्वपूर्ण विशेषता है ।
तारीख करने के लिए, एचआईवी की निगरानी-1 आर टी संक्रमित कोशिकाओं में प्रगति मुख्य रूप से मात्रात्मक पीसीआर के साथ विभिंन लंबाई के रिवर्स प्रतिलेखन उत्पादों को मापने द्वारा पूरा किया गया है (qPCR) प्राइमर का उपयोग-जांच सेट है कि विशिष्ट उपाय कम या ज्यादा (जल्दी और देर से, क्रमशः) सीडीएनए उत्पाद12,13,14। हालांकि इस qPCR दृष्टिकोण सेलुलर सिस्टम में रिवर्स प्रतिलेखन प्रक्रिया के आंतरिक क्षमता निर्धारित करने के लिए उपयुक्त है, उत्पादन अपेक्षाकृत कम संकल्प का है, कोई अनुक्रम जानकारी के साथ व्युत्पंन किया जा रहा है । हमारे नए दृष्टिकोण, अनुकूलित एडेप्टर बंधाव, पीसीआर-मध्यस्थता पुस्तकालय पीढ़ी के आधार पर, और गहरी sequencing प्रौद्योगिकी गैप पते और एक को एचआईवी-1 संक्रमण मात्रा के दौरान रिवर्स प्रतिलेखन की निगरानी का अवसर प्रदान करता है और एकल न्यूक्लियोटाइड संकल्प.
हम एक अध्ययन में इस पद्धति की उपयोगिता सचित्र है कि एचआईवी की क्षमता के लिए दो प्रस्तावित मॉडलों के बीच प्रतिष्ठित-1 प्रतिबंध कारक APOBEC3G (apolipoprotein बी mRNA संपादन एंजाइम उत्प्रेरक पॉलीपेप्टाइड-3 जी की तरह) के साथ हस्तक्षेप करने के लिए वायरल रिवर्स टेप का उत्पादन6।
तेजी से, विश्वसनीय की उपलब्धता, और लागत प्रभावी गहरी अनुक्रमण जीवन विज्ञान के क्षेत्र में कई पहलुओं में क्रांति ला दिया है, अनुक्रमण आधारित विश्लेषण में महान गहराई की अनुमति । एक शेष चुनौती अभिनव डिजाइन और प्रतिनिधि अनुक्रमण पुस्तकालयों के निर्माण में निहित है । यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन नवजात वायरल सीडीएनए अणुओं पर कब्जा करने के लिए, विशेष रूप से एचआईवी के मध्यवर्ती-1 रिवर्स प्रतिलेखन प्रक्रिया ।
इस रणनीति में सबसे महत्वपूर्ण कदम ‘ ओपन 3 ‘ के लिए एक अनुकूलक के बंधाव है-एक मात्रात्मक और निष्पक्ष तरीके से टर्मिनी । दो ssDNA टर्मिनी, दोनों अंतर और intramolecular के बीच ligations की क्षमता, जांच की गई है और विभिंन अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित11,26,27,28,29। ३.३ चरण में वर्णित शर्तों के तहत टी-4 डीएनए ligase के साथ एक hairpin अनुकूलक का उपयोग करने का विकल्प अनुभवजंय अनुकूलन का परिणाम है जिसमें हम सिंथेटिक बंधाव का प्रतिनिधित्व करने के oligonucleotides के लिए विभिन्न ligases, एडेप्टर और रिएजेंट का मूल्यांकन किया एचआईवी-1 अनुक्रम (तालिका 2) (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इन इन विट्रो परीक्षण प्रतिक्रियाओं में, हम ने पुष्टि की कि टी-4 डीएनए ligase मध्यस्थता बंधाव के hairpin अनुकूलक, के रूप में Kwok एट अलद्वारा वर्णित. 11, एक बहुत कम पूर्वाग्रह है, और जब एडेप्टर अतिरिक्त में प्रयोग किया जाता है स्वीकारकर्ता अणुओं की पूरी बंधाव के पास प्राप्त करता है । बंधाव दक्षता मल्टीप्लेक्स प्राइमरी प्रणाली के लिए संगत एडेप्टर प्रदान करने के लिए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के अलावा से अप्रभावित था ( चित्रा 4देखें). इसकी तुलना में हमने पाया है कि एक thermostable 5 ‘ डीएनए/आरएनए ligase (“ligase ए”, सटीक ligases के लिए सामग्री की तालिका यहाँ देखें), जो एक इंजीनियर आरएनए ligase है कि भाग में विकसित किया गया था बंधाव के साथ ssDNA दक्षता पर सुधार करने के लिए स्वीकारकर्ता के रूप में 27, ligating पर वास्तव में अधिक प्रभावी था आरएनए ligase से दो ssDNA अणु (“ligase बी”) लेकिन एक महत्वपूर्ण पूर्वाग्रह था, बंधाव दक्षता में मजबूत मतभेदों के साथ भी oligonucleotides के बीच एकल आधार लंबाई मतभेदों के साथ [तालिका 2 ; HTP con मध्य जी (a) और (b)]. इसके अलावा, हम “Ligase सी” एक ‘ यादृच्छिक 5 ‘-टर्मिनी (एक रणनीति “Ligase सी के ज्ञात न्यूक्लियोटाइड पूर्वाग्रह ऑफसेट करने के लिए इस्तेमाल किया” ले जाने के साथ संयुक्त प्रतिक्रियाओं में केवल एक ंयूनतम पूर्वाग्रह पाया; डिंग एट अलउदाहरण के लिए देखें । 30). हालांकि, “Ligase सी” मध्यस्थता आणविक ligations अपूर्ण थे, टी-4 डीएनए Ligase प्रणाली बेहतर विकल्प प्रतिपादन.
प्रोटोकॉल के पाठ्यक्रम और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के शामिल किए जाने पर कई गुणवत्ता नियंत्रण कदम परख निरंतरता से पहले संभावित समस्याओं का पता लगाने के लिए अनुमति देते है और समस्या निवारण के प्रयासों के लिए मार्गदर्शन प्रदान करते हैं । qPCR quantifications में कदम -8 और 2.3.12 सुनिश्चित करें कि इनपुट सामग्री की मात्रा पर्याप्त है । ठेठ सीडीएनए कॉपी नंबर २०० µ एल रेफरेंस में (स्टेप २.१ से) रेंज करीब १०,००० से ३००,००० प्रति µ एल. संकर कब्जा कदम समग्र एचआईवी के कुछ नुकसान में परिणाम कर सकते है-1 सीडीएनए मात्रा लेकिन विशिष्ट एचआईवी के एक मजबूत संवर्धन में परिणाम चाहिए सेलुलर डीएनए पर 1 सीडीएनए, जो उचित प्राइमरों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है जीनोमिक डीएनए यों तो से पहले और संवर्धन के बाद qPCR या कुल डीएनए एकाग्रता को मापने के द्वारा । बरामद एचआईवी-1 सीडीएनए के बाद संकर कब्जा कदम इनपुट के कम से 10% होना चाहिए । कम शुरू सामग्री अंयथा एक सफल oligonucleotide सकारात्मक नियंत्रण (3.3.2 कदम देखें), लेकिन केवल सीमित नमूनों में प्राप्त पढ़ता है समझा सकता है । कम पढ़ें समग्र भी MiSeq एडेप्टर के बिना अप्रासंगिक डीएनए प्रजातियों की उपस्थिति के कारण पुस्तकालय एकाग्रता के अधिक आकलन द्वारा समझाया जा सकता है । यह कम क्लस्टर घनत्व में परिणाम होगा और fluorometric परख द्वारा कुल डीएनए राशि के अलावा qPCR द्वारा पुस्तकालय में एचआईवी-1 दृश्यों की एकाग्रता का निर्धारण करके सुधार किया जा सकता है । विधि की अति संवेदनशील प्रकृति के कारण, विशेष देखभाल भी निम्न स्तर के संदूषण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए, दोनों अन्य नमूनों से (विशेष रूप से, उच्च एकाग्रता नियंत्रण oligonucleotide स्टॉक से) के रूप में अच्छी तरह से प्रयोगशाला उपकरणों से. एक यूवी बंध्याकरण पीसीआर कार्य केंद्र में काम कर इस संबंध में फायदेमंद है । अंतिम लाइब्रेरी (step 6.1.2) की ऑटोमेटेड जेल ट्रो एक और गुणवत्ता नियंत्रण उपाय है । न्यूक्लिक एसिड आकार रेंज आमतौर पर मनाया १५० ५०० nt. प्राइमरों के बीच है कि पीसीआर के बाद वैकल्पिक नियंत्रण में पाया जा सकता है और शुद्धि से पहले (नोट चरण ५.२ में देखें) अब अनुपस्थित होना चाहिए । एक प्रतिनिधि परिणाम में, नमूना तीव्रता वक्र १६० के आसपास एक चोटी है १७० nt और ३२० के आसपास एक दूसरे तेज शिखर ३५० nt के लिए । यह संभावना अक्सर दोनों अपेक्षाकृत कम में देखा उच्च बहुतायत (1 से 20 nt डालने की लंबाई) रिवर्स टेप और पूर्ण लंबाई मजबूत रोक (१८० १८२ nt डालने की लंबाई) (चित्रा 3बी) को दर्शाता है ।
जबकि प्रस्तुत प्रोटोकॉल और चयनित प्राइमरों जल्दी एचआईवी के लिए विशिष्ट है-1 रिवर्स प्रतिलेखन का निर्माण, विधि आम तौर पर किसी भी ‘ खुले 3 निर्धारित लक्ष्य अध्ययन के लिए लागू है ‘-डीएनए के टर्मिनी । मुख्य अंय संदर्भों में आवश्यक संशोधनों संकर कब्जा और प्राइमर डिजाइन रणनीति के लिए विधि होगी । उदाहरण के लिए, यदि लक्ष्य को देर से एचआईवी-1 टेप के लिए अनुकूलित किया जा रहा है, विभिंन कैप्चरिंग biotinylated oligonucleotides सीडीएनए की लंबाई भर में एनीलिंग की एक बड़ी संख्या उचित होगा और संभावना संकर पर कब्जा कदम में कमी होगी । के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, यह सीमाओं पर विचार महत्वपूर्ण है जब सीमा पर 3 ‘-टर्मिनी के लिए पूर्वाग्रह के विभिंन स्रोतों से बचने का पता लगाया जा रहे है डिजाइनिंग । सबसे पहले, वहां पीसीआर प्रतिक्रियाओं में पूर्वाग्रह हो सकता है अगर अनुकूलक के साथ टेंपलेट्स काफी लंबाई बदलती हैं । दूसरा, अनुक्रमण मंच यहां इस्तेमाल किया (जैसे, MiSeq) इष्टतम clustering के लिए एक पसंदीदा डालने की लंबाई सीमा है, और काफी कम है और अब उत्पादों को एक ही दक्षता के साथ अनुक्रम नहीं किया जा सकता है । भाग में, यह अभिकलन संबोधित किया जा सकता है, के रूप में रैखिक लंबाई पूर्वाग्रह के लिए एक सुधार कारक गणना द्वारा किया गया था ( चित्रा 4, नीचे ग्राफ देखें) । हालांकि, जहां 3 ‘ के क्षेत्र-टर्मिनी मानचित्रण वांछित है (> १००० nt) लंबा है, यह और अधिक के लिए ligated टेप के साथ प्रतिक्रियाओं विभाजन और एकाधिक नदी के ऊपर प्राइमरों का उपयोग करने के लिए 3 ‘ का आकलन-टर्मिनी वर्गों में सलाह दी जाती है ।
विश्लेषण कार्यक्रम में लिखा गया था-घर में एचआईवी-1 के दोनों अंतिम न्यूक्लियोटाइड का विश्लेषण करने के विशिष्ट प्रयोजन के लिए तय एडेप्टर अनुक्रम से सटे अनुक्रम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सभी कुर्सियां के आधार रूपांतर के लिए किसी भी परिवर्तन की पहचान । व्यक्तिगत चरणों में निम्न शामिल हैं: पहला, एडेप्टर अनुक्रम fastx-0.0.13 टूलकिट का उपयोग कर छंटनी कर रहे हैं; फिर, डुप्लिकेट किए गए किसी भी अनुक्रम (अर्थ समान क्रम बारकोड सहित) निकाल दिए जाते हैं । सभी शेष अद्वितीय पढ़ता है तो Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) अधिकतम बेमेल तीन ठिकानों पर सेट के साथ का उपयोग कर एचआईवी-1 अनुक्रम के लिए गठबंधन कर रहे हैं । टेंपलेट अनुक्रम एचआईवी के पहले ६३५ nt-1 सीडीएनए (nl 4.3 तनाव) है, जो-एसएसएस अनुक्रम और पहले किनारा हस्तांतरण उत्पाद शामिल है polypurine ट्रैक (U5-R-U3-PPT के शामिल है, चित्रा 1देखें) । इस प्रकार, प्रदान की सॉफ्टवेयर और टेंपलेट्स केवल सीधे उपयुक्त है अगर विधि एक ही आवेदन के लिए प्रयोग किया जाता है (एचआईवी के जल्दी रिवर्स टेप का पता लगाने-1nl 4.3) । समायोजन अन्य लक्ष्य अनुक्रम के लिए किया जाना होगा । प्रत्येक पढ़ने के लिए 3 ‘-टर्मिनी की स्थितियां संरेखण में स्थान द्वारा निर्धारित की गई थीं । प्रत्येक स्थिति के लिए आधार कॉल दर्ज की गई है और उत्परिवर्तन दरों प्रत्येक आधार है, जो बदलता है की कुल कवरेज से गणना कर रहे हैं, के रूप में पढ़ता है अलग लंबाई के होते है और लंबे आवेषण पूरी तरह से Read2 में १२५-आधार अनुक्रमण द्वारा कवर नहीं किया जा सकता है ।
समाप्त करने के लिए, हमारा मानना है कि वर्णित विधि अध्ययन के कई प्रकार के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो । स्पष्ट आवेदन एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं या सेलुलर प्रतिबंध कारकों के माध्यम से रिवर्स प्रतिलेखन निषेध अंतर्निहित तंत्र की जांच शामिल हैं । हालांकि, केवल अपेक्षाकृत मामूली समायोजन करने के लिए सिस्टम को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक होना चाहिए 3 ‘-टर्मिनी मैपिंग अन्य एकल-कतरा डीएनए वायरल मध्यवर्ती के भीतर, जो मौजूद हैं, उदाहरण के लिए, parvovirus प्रतिकृति में. इसके अलावा, विधि के सिद्धांत, विशेष रूप से अपने अनुकूलित बंधाव कदम, किसी भी 3 ‘ के लक्षण वर्णन के लिए पुस्तकालय की तैयारी डिजाइन का एक मुख्य हिस्सा प्रदान कर सकते हैं-डीएनए एक्सटेंशन सेलुलर डबल-कतरा डीएनए द्वारा catalyzed सहित, polymerases ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक मल्म प्रयोगशाला, लुइस Apolonia, Jernej उले, और रेबेका Oakey के सदस्यों से समर्थन स्वीकार करते हैं । लेखकों के राजा कॉलेज लंदन जीनोमिक सेंटर और डेबी ह्यूजेस पर विश्वविद्यालय कॉलेज लंदन (UCL), न्यूरोलॉजी अगली पीढ़ी sequencing सुविधा के लिए संस्थान में मैट Arno धंयवाद, MiSeq अनुक्रमण रन के साथ मदद के लिए । इस कार्य को यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (G1000196 और MR/M001199/1 to M.M.), वेलकम ट्रस्ट (106223/z/14/z to M.M.), यूरोपीय आयोग के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम (FP7/2007-2013) के तहत ग्रांट एग्रीमेंट सं. PIIF-GA-2012-329679 (D.P. करने के लिए), और स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए एक राष्ट्रीय संस्थान के माध्यम से स्वास्थ्य विभाग व्यापक जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए पुरस्कार है लड़के और सेंट थॉमस ‘ एन एच एस फाउंडेशन राजा कॉलेज लंदन और राजा के साथ साझेदारी में ट्रस्ट को अवार्ड कॉलेज अस्पताल एन एच एस फाउंडेशन ट्रस्ट ।
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco | 31966-021 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15150-122 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
HeraCell Vios 250i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030966 | |
Laminar flow hood – CAS BioMAT2 | Wolflabs | CAS001-C2R-1800 | |
10mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
TrypLE™ Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme | Gibco | 12605-010 | |
OptiMEM® (Minimal Essential Medium) | Gibco | 31985-047 | |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | NIH Aids reagent program | 114 | |
Polyethylenimine (PEI) – MW:25000 | PolySciences Inc | 23966-2 | dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7 |
RQ1- Rnase free Dnase | Promega | M6101 | |
Filter 0.22 μm | Triple Red Limited | FPE404025 | |
15 mL polypropylene tubes | Corning | CLS430791 | |
Sucrose | Calbiochem | 573113 | |
Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-094 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | |
Ultracentrifuge | Sorval | WX Ultra Series | Th-641 Rotor |
Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit | Perkin Elmer | NEK050001KT | |
CEM-SS cells | NIH Aids reagent program | 776 | |
Roswell Park Memorial Institute Medium | Gibco | 31870-025 | |
CoStar® TC treated multiple well plates | Corning | CLS3513-50EA | |
Benchtop centrifuge: Heraus™ Multifuge™ X3 FR | Thermo Scientific | 75004536 | |
TX-1000 Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003017 | |
Microcentrifuge: 5424R | Eppendorf | 5404000060 | |
Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit) | Qiagen | 69504 | |
Nuclease free H2O | Ambion | AM9937 | |
Cutsmart buffer | New England Biolabs (part of DpnI enzyme) | R0176S | |
DpnI restriction enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
Oligonucleotides for qPCR | MWG Eurofins | N/A | HPSF purification |
TaqMan PCR Universal Mastermix | Thermo | 4304437 | |
LoBind Eppendorf® tubes | Eppendorf | 30108078 | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 1000 μL | Fisher Scientific | TF-000-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 200 μL | Fisher Scientific | TF-200-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 20 μL | Fisher Scientific | TF-20-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 10 μL | Fisher Scientific | TF-10-R-S | |
PCR clean hood | LabCaire | Model PCR-62 | |
DynaMag™2-magnet | Thermo | 12321D | |
Streptavidin MagneSphere® paramagnetic particles | Promega | Z5481 | |
Casein | Thermo Scientific | 37582 | |
End over end rotator, Revolver™ 360° | Labnet | H5600 | |
Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Hydrochloric Acid | Sigma | H1758-100ML | |
EDTA disodium salt dihydrate | Electran (VWR) | 443885J | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Dri-Block® Analog Block Heater | Techne | UY-36620-13 | |
PCR tubes and domed caps | Thermo Scientific | AB0266 | |
PCR machine | Eppendorf | Mastercycler® series | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202M | |
40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000 | Sigma | P1458-25ML | |
Betaine solution, 5M | Sigma | B0300-1VL | |
Gel loading buffer II (formamide buffer) | Thermo Scientific | AM8546G | |
Precast 6% TBE urea gels | Invitrogen | EC6865BOX | |
Mini cell electrophoresis system | Invitrogen, Novex | XCell SureLock™ | |
Tris/Borate/EDTA solution (10x) | Fisher Scientific | 10031223 | |
Needle 21 G x1 1/2 | VWR | 613-2022 | |
SYBR Gold nucleic acid stain (10000x) | Life Technologies | S11494 | |
Dark Reader DR46B transilluminator | Fisher Scientific | NC9800797 | |
Ammonium acetate | Merck | 101116 | |
SDS solution 20% (w/v) | Biorad | 161-0418 | |
Centrifuge tube filter | Appleton Woods | BC591 | |
Filter Glass Fibre Gf/D 10mm | Whatman (VWR) | 512-0427 | |
polyadenylic acid (polyA) RNA | Sigma | 10108626001 | |
Glycogen, molecular biology grade | Thermo Scientific | R0561 | |
Isopropanol (2-propanol) | Fisher Scientific | 15809665 | |
Ethanol, molecular biology grade | Fisher Scientific | 10041814 | |
Accuprime™ Supermix I (DNA polymerase premix) | Life Technologies | 12342-010 | |
NEBNext® Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2) | New England Biolabs | E7335S; E7500S | |
Tapestation D1000 Screentape High sensitivity | Agilent Technologies | 5067- 5584 | |
Tapestation D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067- 5585 | |
2200 Tapestation – automated gel electrophoresis system | Agilent Technologies | G2965AA | |
Agencourt® AMPure® beads XP | Beckman Coulter | A63880 | |
Qubit™ dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
Qubit™ 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Topo™ TA cloning Kit | Invitrogen | 450071 | |
Sequencing platform: MiSeq System | Illumina | ||
Experiment Manager (Sample sheet software) | Illumina | Note: Use TruSeq LT as a template | |
Miseq™ Reagent kit V3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Sequencing hub: Basespace | Illumina | https://basespace.illumina.com | |
Ligase A: Thermostable 5’ App DNA/RNA ligase | NEB | M0319S | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
Ligase B: T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
Ligase C: CircLigase | Epicentre | CL4111K | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |