Hier präsentieren wir einen Tiefe Sequenzierung Ansatz, der eine objektive Bestimmung der im Entstehen begriffenen 3′-Termini sowie mutagenen Profile der einzelsträngigen DNA-Moleküle enthält. Die Hauptanwendung ist die Charakterisierung der im Entstehen begriffenen retrovirale ergänzende DNAs (cDNAs), die Zwischenprodukte, die während des Prozesses der retroviralen reversen Transkription generiert.
Überwachung von Nukleinsäure-Zwischenprodukte während der Replikation des Virus gibt Einblicke in die Wirkungen und Wirkmechanismen von antiviralen Substanzen und Host Zellproteinen auf virale DNA-Synthese. Hier gehen wir auf das Fehlen eines Zell-basierte, reichweitenstarken und hochauflösende Assays, die retrovirale reversen Transkription Zwischenprodukte im physiologischen Rahmen einer Virusinfektion zu definieren vermag. Das beschriebene Verfahren erfasst die 3′-Termini, der im Entstehen begriffenen komplementäre DNA (cDNA) Moleküle in HIV-1 infizierten Zellen mit Einzel-Nukleotid-Auflösung. Das Protokoll beinhaltet Ernte der ganzen Zelle DNA, gezielte Anreicherung der viralen DNA über Hybrid Capture, Adapter Ligation, Größe Fraktionierung von Gel Reinigung, PCR-Amplifikation, Tiefe Sequenzierung und Datenanalyse. Ein wichtiger Schritt ist die effiziente und unvoreingenommene Ligatur der Adapter Moleküle, 3′-DNA Termini zu öffnen. Anwendung des beschriebenen Verfahrens bestimmt die Fülle der umgekehrte Abschriften jeder bestimmten Länge in einer Probe. Darüber hinaus Informationen über die (interne) Sequenz Variation in umgekehrter Transkripte und damit jede möglichen Mutationen. Der Test eignet sich im Allgemeinen für alle Fragen rund um DNA-3′-Erweiterung, unter der Voraussetzung, dass die Vorlage-Sequenz bekannt ist.
Um zu sezieren und zu verstehen, dass die virale Replikation vollständig, zunehmend Techniken verfeinert, die Replikation zu erfassen sind Zwischenprodukte erforderlich. Insbesondere kann die genaue Definition der viralen Nukleinsäure-Arten im Rahmen der infizierten Zellen liefern neue Erkenntnisse, da viele virale Replikationsmechanismen bisher wurde in isolierten in Vitro Reaktionen untersucht. Ein Paradebeispiel ist der Prozess der reversen Transkription in Retroviren, wie humane Immundefizienz-Virus (HIV-1) 1. Die verschiedenen Schritte der reversen Transkription HIV-1, bei denen das virale Enzym Reverse Transkriptase (RT) die einsträngige RNA-Genom in doppelsträngige DNA kopiert wurden in erster Linie im Primer Extension Assays mit gereinigten Proteinen und Nukleinsäuren Säuren,1,2,3,4,5. Während grundlegende Prinzipien hergestellt wurden, solche Tests nicht zu übernehmen alle virale und zelluläre Komponenten und nicht unbedingt biologisch relevante Zusammensetzungen der beteiligten Faktoren. Daher haben wir eine leistungsstarke Technik, die Spektren der reversen Transkription Zwischenprodukten mit ihren exakten cDNA 3′-Termini (d. h. Ermittlung ihrer genauen Längen) und Nukleotidsequenzen im Zusammenhang mit Infektionen des Lebens bestimmen entwickelt Zellen-6. Sammlung von Daten aus Zeit Kurs Experimente genutzt werden, um das Profil der Transkripte unter verschiedenen Bedingungen, wie z. B. das Vorhandensein von antiviralen Moleküle oder Proteine, die Einfluss auf die Effizienz und Processivity der DNA-Synthese zu vergleichen und Akkumulation. Dies ermöglicht ein genaueres Verständnis des natürlichen Erreger Lebenszyklus, die oft die Basis für gezielte Drug Design und erfolgreiche therapeutische Intervention.
HIV-1 reverse Transkription umfasst eine Reihe von aufeinander folgenden Veranstaltungen initiiert durch Tempern eine tRNA-Grundierung, die genomische RNA-Vorlage, welche dann durch RT, ein kurzen einzelsträngigen cDNA-Protokoll namens eine Minus-Strang stark-Stop zu produzieren verlängert wird (-Sss) (siehe ( Abbildung 1). Anschließend wird die cDNA – Sss vom 5′-Long Terminal wiederholen (LTR), die 3′ LTR der genomischen RNA, wo es glüht und dient als Grundierung für anhaltende RT Dehnung von Minus vermittelte DNA Strang übertragen (siehe Bewertungen auf reverse Transkription1 , 2 , 3 , ( 4). diese ersten Strang zählt die Bandbreitenbegrenzung Schritte der reversen Transkription; Daher ist die cDNA – Sss bekannt zu akkumulieren. Die Grundkonstruktion für Workflow und Bibliothek der reversen Transkription Produkte in infizierten Zellen zu erfassen ist in Abbildung 2adargestellt. Die spezifische Primer und Analyse, die Einstellungen, die in das Protokoll verwendet und in Tabelle 1 aufgeführten Zielen alle früh reverse Transkription cDNA Zwischenprodukte im Längenbereich von 23 bis ~ 650 nt, das 180-182-nt – Sss-DNA enthält. Jedoch werden geeignete geringfügige Anpassungen der Strategie ermöglichen Anwendung nicht nur spät reversen Transkription Produkte, aber auch andere Viren und Systeme, wo ist das Ziel, 3′-OH enthaltende DNA-enden zu erkennen. Wichtige Einschränkungen berücksichtigen umfassen die Länge des PCR-Produktes in der Bibliothek; insbesondere werden Vorlagen, in denen der Abstand zwischen den Adapter auf der offenen 3′-Terminus und die vorgelagerten Grundierung Website überschreiten ~ 1000 NT, wahrscheinlich weniger effizient sequenziert werden, potentiell Einführung technische Vorurteile während Bibliothek Vorbereitung (irreführend, siehe Diskussion für mehr Details und Anpassung Vorschläge).
Bisher konzentrierten gemeldeten Techniken für die systematische Ermittlung der 3′-Termini der Nukleinsäure-Stränge auf RNA, nicht DNA-Moleküle. Ein Beispiel ist 3′ Rennen (schnelle Verstärkung der cDNA enden)7, die stützt sich auf die Polyadenylation der mRNA. Darüber hinaus wurden Adapter Ligatur-basierte Strategien beschäftigen RNA Ligases entwickelt, die RLM-Rennen (RNA-Ligase-vermittelten)8 oder Spitze (Ligatur-basierte Amplifikation der cDNA enden)9einbezogen. Es ist wichtig zu betonen, dass die Ligatur-basierte Erweiterungen empfindlich auf jede Bias durch die Ligatur Reaktion selbst eingeführt werden. Z. B. möglicherweise Ligatur je nach einer bestimmten Nukleotid in der 3′-Position, die Sequenz, total Molekül Länge oder lokale Struktur mehr oder weniger effizient. Solche Präferenzen Ligase führen zu unvollständigen Erfassung von Molekülen und falsche Angaben in der Anzeige, die wir und andere9,10beobachtet haben. Um während der Adapter zusätzlich Schritte im Protokoll beschriebenen Ligatur Voreingenommenheit zu minimieren, wir eine Reihe von Ligatur Strategien getestet und fand die Verwendung von T4 DNA-Ligase mit einer Haarnadel einzelsträngigen DNA-Adapter (wie von Kwok Et al.beschrieben. 11) das einzige Verfahren mit in der Nähe von quantitativen Ligatur, die nicht signifikante Unterschiede in der Ligatur Effizienz mit einem speziell ausgewählten Steuerelement Oligonukleotide6Beurteilung geführt hat. Die Wahl dieser Ligatur-Strategie ist daher ein wesentliches Merkmal für den Erfolg dieses Protokolls.
Bis heute, Überwachung der HIV-1-RT-Progression in infizierten Zellen in erster Linie erreicht wurde durch die Messung der reversen Transkription Produkte verschiedener Länge mit quantitativen PCR (qPCR) mit Primer-Sonden-Sets, die eindeutig kürzer oder länger zu messen (frühe und spät, beziehungsweise) cDNA Produkte12,13,14. Während dieser Ansatz qPCR intrinsischen Effizienz des Prozesses reverse Transkription in zellulären Systemen zu bestimmen ist, ist die Ausgabe der relativ geringen Auflösung ohne Reihenfolge Informationen abgeleitet wird. Unser neue Ansatz, basierend auf optimierten Adapter Ligation, PCR-vermittelten Bibliothek Generation und Tiefe Sequenzierung Adressen die Technologielücke und bietet die Möglichkeit, reverse Transkription während HIV-1 Infektion quantitativ und bei Einzel-Nukleotid zu überwachen Auflösung.
Wir haben den Nutzen dieser Methode in einer Studie, die unterschieden zwischen zwei vorgeschlagenen Modelle für die Kapazität des Faktors HIV-1 Einschränkung APOBEC3G (Apolipoprotein B mRNA editing Enzym katalytische Polypeptid-wie 3 G) zu stören illustriert, mit der Produktion von viralen reverse Transkripte6.
Die Verfügbarkeit für die schnelle, zuverlässige und kostengünstige Tiefe Sequenzierung revolutioniert hat viele Aspekte auf dem Gebiet der Life Sciences, großen Tiefe Sequenzierung-basierte Analysen ermöglicht. Eine verbleibende Herausforderung liegt in der innovativen Gestaltung und Erstellung des Vertreters Sequenzierung Bibliotheken. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um entstehende virale cDNA Molekülen, speziell die Zwischenprodukte des HIV-1 reverse Transkription Prozesses zu erfassen.
Der wichtigste Schritt in dieser Strategie ist die Unterbindung eines Adapters offen 3′-Termini in einer quantitativen und unvoreingenommene Weise. Wirkungsgrade von grundsätzlich zwischen zwei SsDNA Termini, beide inter- und intramolekulare, untersucht und für verschiedene Anwendungen11,26,27,28,29optimiert wurden. Die Möglichkeit zur Nutzung eines Haarnadel-Adapters mit T4 DNA-Ligase unter den in Schritt 3.3 beschriebenen Bedingungen ist das Ergebnis der empirischen Optimierung in dem wir verschiedene Ligases, Adaptern und Reagenzien für die Unterbindung der synthetischen Oligonukleotiden vertreten ausgewertet HIV-1 Sequenzen (Tabelle 2) (Daten nicht gezeigt). In dieser in-Vitro -Test-Reaktionen bestätigt wir, dass die T4-DNA-Ligase Ligatur der Haarnadel-Adapter vermittelt, wie von Kwok Et al.beschrieben. 11, hat eine sehr geringe Vorspannung und in der Nähe von vollständigen Unterbindung der Akzeptor Moleküle erreicht, wenn der Adapter im Überschuss eingesetzt wird. Die Ligatur-Effizienz war unberührt durch die Zugabe von Nukleotidsequenz, die den Adapter für die Multiplex-Primer-System in Einklang zu bringen (siehe Abbildung 4). Im Vergleich dazu fanden wir, dass eine thermostabile 5′ DNA/RNA-Ligase (“Ligase A”, siehe Tabelle der Materialien für genaue Ligases im Vergleich hier), das ist ein veränderter RNA Ligase, die teilweise entwickelt wurde, Ligation Effizienz mit SsDNA als den Akzeptor zu verbessern 27, war in der Tat viel effektiver Ligation zwei SsDNA Moleküle als RNA-Ligase (“Ligase B”), aber eine deutliche Tendenz mit starke Unterschiede in der Effizienz der Ligatur sogar zwischen Oligonukleotide mit einzelnen Basislänge unterschieden [Tabelle 2 hatte ; HTP con Mitte G (a) und (b)]. Darüber hinaus fanden wir nur eine minimale Verzerrung in Reaktionen mit “Ligase C” kombiniert mit einem Adapter tragen eine randomisierte 5′-Termini (eine Strategie verwendet, um bekannte Nukleotid-Bias “Ligase c” versetzen; siehe z. B. Ding Et Al. 30). aber das “Ligase C”-vermittelte intermolekulare Verbindlichkeiten waren unvollständig, Rendern dem T4 DNA-Ligase-System die bessere Wahl.
Mehrstufig Qualitätskontrolle im Laufe des Protokolls und die Aufnahme von positiven und negativen Kontrollen ermöglichen die Erkennung potenzieller Probleme vor Assay Fortsetzung und Orientierungshilfen für die Problembehandlung Bemühungen. Die qPCR Quantifizierungen in Schritten 2.2.2 und 2.3.12 sicherstellen, dass die Menge an input-Material ausreicht. Typische cDNA Kopie Zahlen im Bereich von 200 µL Elution (aus Schritt 2.1) von etwa 10.000 bis 300.000 pro Mikroliter. Der Hybrid-Capture-Schritt kann dazu führen, dass einige Verlust von HIV-1-Allgemeine cDNA Menge aber sollte eine starke Anreicherung von bestimmten HIV-1 cDNA führen, über zelluläre DNA, die mit entsprechenden Grundierungen genomischen DNA vor und nach Anreicherung durch Quantifizierung bestimmt werden kann qPCR oder DNA-Konzentration zu messen. Wiederhergestellte HIV-1 cDNA nach die Hybrid capture Schritte sollte mindestens 10 % des Eingangs. Low Ausgangsmaterial kann sonst erklären, dass eine erfolgreiche Oligonukleotid-positiv-Kontrolle (siehe Punkt 3.3.2) aber nur begrenzte liest in den Proben erreicht. Niedrige lesen Sie zahlen insgesamt auch Überschätzung der Bibliothek Konzentration aufgrund des Vorhandenseins von irrelevanten DNA-Arten ohne MiSeq Adapter erklärt werden könnte. Dies ergäbe sich niedrige Cluster Dichte und kann durch Bestimmung der Konzentration von HIV-1 Sequenzen in der Bibliothek von qPCR neben den Gesamtbetrag der DNA durch fluorometrischen Assays verbessert werden. Aufgrund der hochsensiblen Natur der Methode sollte besondere Vorsicht geboten, auch Low-Level-Kontamination, sowohl von anderen Proben (insbesondere durch die hohe Konzentration Kontrolle Oligonukleotid Bestände) sowie von Laborgeräten zu vermeiden. Arbeiten in einer UV-Sterilisation PCR-Workstation ist in dieser Hinsicht vorteilhaft. Die automatisierte Gelelektrophorese der endgültigen Bibliothek (Schritt 6.1.2) ist eine weitere Maßnahme der Qualitätskontrolle. Nukleinsäure-liegt Größe in der Regel beobachtet zwischen 150 bis 500 nt. Primer, die in die optionale Steuerung erkannt werden können, nach der PCR und vor Reinigung (siehe Hinweis im Schritt 5.2) jetzt nicht vorhanden sein sollte. In einem repräsentativen Ergebnis die Probe Intensitätskurve hat eine Spitze rund 160 bis 170 nt und eine zweite schärfer Spitze rund 320 bis 350 nt. Dies spiegelt wahrscheinlich die oft gesehen höheren Fülle in relativ kurz (1 bis 20 nt Einsatzlänge) reverse Transkripte und in voller Länge stark-Stop (180 bis 182 nt Einsatzlänge) (Abbildung 3b).
Während die vorgestellten Protokoll und ausgewählten Primer spezifisch für frühe HIV-1 reverse Transkription Konstrukte sind, ist die Methode generell für jede Studie mit dem Ziel, offene 3′-Termini der DNA zu bestimmen. Die wichtigsten Modifikationen in anderen Zusammenhängen werden die Methode für Hybrid Capture und die Grundierung-Design-Strategie sein. Z. B. wenn das Ziel ist es zu spät HIV-1-Transkripte angepasst werden, eine größere Anzahl von verschiedenen aufzeichnende biotinylierte Oligonukleotide Glühen über die gesamte Länge der cDNA wäre ratsam und wird wahrscheinlich den Verlust in der Hybrid-Capture-Schritt abnehmen. Wie in der Einleitung erwähnt, ist es wichtig, Grenzen zu berücksichtigen, wenn den Bereich entwerfen, über die 3′-Termini erkannt werden, um unterschiedliche Quellen der Befangenheit zu vermeiden. Zunächst möglicherweise eine Vorspannung in die PCR-Reaktionen wenn die Vorlagen mit dem Adapter von stark unterschiedlicher Länge sind. Zweitens die Sequenzierung Plattform hier verwendet (z.B. MiSeq) hat eine bevorzugte einfügen Längenbereich für optimale clustering und deutlich kürzere und längere Produkte dürfen nicht mit der gleichen Effizienz sequenziert werden. Teilweise kann dies rechnerisch, wie durch die Berechnung eines Korrekturfaktors für lineare Länge Bias berücksichtigt werden (siehe Abbildung 4, untere Grafik). Jedoch wenn die Region wo die 3′-Termini mapping erwünscht ist lang ist (> 1000 nt), ist es ratsamer, die Reaktionen mit den aufgespaltenen Transkripte aufgeteilt und mehrere upstream Primer verwenden, um 3′-Termini in Abschnitten zu beurteilen.
Das Auswertungsprogramm geschrieben wurde intern für den spezifischen Zweck der Analyse der beiden letzten Nukleotid der HIV-1 Sequenz angrenzend an die feste Adapter-Sequenz sowie die base Variation der alle Basen, Mutationen zu identifizieren. Die einzelnen Schritte umfassen Folgendes: Erstens sind die Adapter-Sequenzen getrimmt, mit dem Fastx-0.0.13 Toolkit; dann werden alle Sequenzen, die dupliziert werden (d.h. identische Sequenzen einschließlich des Barcodes) entfernt. Alle übrigen einzigartige Lesevorgänge werden dann auf die HIV-1 Sequenz mit Fliege (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) mit der maximalen Missverhältnis auf drei Basen festgelegt ausgerichtet. Die Vorlage-Sequenz besteht aus den ersten 635 nt von HIV-1 cDNA (NL4.3 Stamm), umfasst die Sss – Sequenz und der erste Strang Transfer Produkt bis zu der Polypurine Strecke (U5-R-U3-PPT; siehe Abbildung 1). Dabei sind nur die mitgelieferte Software und Vorlagen direkt geeignet, wenn die Methode für die gleiche Anwendung (Erkennung von frühen reverse Transkriptionen von HIV-1-NL4.3) verwendet wird. Anpassungen müssen für andere Zielsequenzen erfolgen. Die Positionen der 3′-Termini für jede Leseoperation wurden durch die Position auf der Achse bestimmt. Base Anrufe für jede Position werden aufgezeichnet und Mutationsraten aus die Gesamtabdeckung der jeder Basis, die variiert, wie Lesevorgänge unterschiedlich lang sind und lange Einsätze nicht vollständig durch die 125-Base Sequenzierung in Read2 abgedeckt werden können, berechnet werden.
Abschließend möchte ich sagen, glauben wir das beschriebene Verfahren zu einem wertvollen Werkzeug für viele Arten von Studien. Offensichtliche Anwendungen umfassen Untersuchungen von Mechanismen, die Hemmung der reversen Transkription durch antiretrovirale Medikamente oder zellulären Einschränkung Faktoren. Allerdings sollte nur relativ geringfügige Anpassungen notwendig sein, passen Sie das System auf 3′-Termini mapping innerhalb von anderen einzelsträngiger DNA virale Zwischenprodukte, die beispielsweise in Parvovirus Replikation vorhanden sind. Darüber hinaus bieten das Prinzip der Methode, vor allem seine optimierte Ligatur Schritt, ein zentraler Bestandteil der Vorbereitung von Bibliotheksentwurf zur Charakterisierung der 3′-DNA-Erweiterungen, einschließlich Dehnungen katalysiert durch zelluläre doppelsträngige DNA Polymerasen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren erkennen die Unterstützung von Mitgliedern der Malim-Labor, Luis Apolonia, Jernej Ule und Rebecca Oakey. Die Autoren danken Matt Arno in die Kings College London genomische Centre und Debbie Hughes am University College London (UCL), Institut für Neurologie nächste Generation Sequencing Facility, um Hilfe mit MiSeq Sequenzierung ausgeführt wird. Die Arbeit wurde von der UK Medical Research Council (G1000196 und Herr/M001199/1, M.M.), vom Wellcome Trust (106223/Z/14/Z, M.M.), der Europäischen Kommission siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung unterstützt keine. PIIF-GA-2012-329679 (, D.P.) und der Department of Health über eine National Institutes for Health Research umfassende Biomedical Research Center Award an Guy es and St. Thomas’ NHS Foundation Trust in Partnerschaft mit Kings College London des Königs College Hospital NHS Foundation Trust.
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco | 31966-021 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15150-122 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
HeraCell Vios 250i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030966 | |
Laminar flow hood – CAS BioMAT2 | Wolflabs | CAS001-C2R-1800 | |
10mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
TrypLE™ Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme | Gibco | 12605-010 | |
OptiMEM® (Minimal Essential Medium) | Gibco | 31985-047 | |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | NIH Aids reagent program | 114 | |
Polyethylenimine (PEI) – MW:25000 | PolySciences Inc | 23966-2 | dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7 |
RQ1- Rnase free Dnase | Promega | M6101 | |
Filter 0.22 μm | Triple Red Limited | FPE404025 | |
15 mL polypropylene tubes | Corning | CLS430791 | |
Sucrose | Calbiochem | 573113 | |
Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-094 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | |
Ultracentrifuge | Sorval | WX Ultra Series | Th-641 Rotor |
Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit | Perkin Elmer | NEK050001KT | |
CEM-SS cells | NIH Aids reagent program | 776 | |
Roswell Park Memorial Institute Medium | Gibco | 31870-025 | |
CoStar® TC treated multiple well plates | Corning | CLS3513-50EA | |
Benchtop centrifuge: Heraus™ Multifuge™ X3 FR | Thermo Scientific | 75004536 | |
TX-1000 Swinging Bucket Rotor | Thermo Scientific | 75003017 | |
Microcentrifuge: 5424R | Eppendorf | 5404000060 | |
Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit) | Qiagen | 69504 | |
Nuclease free H2O | Ambion | AM9937 | |
Cutsmart buffer | New England Biolabs (part of DpnI enzyme) | R0176S | |
DpnI restriction enzyme | New England Biolabs | R0176S | |
Oligonucleotides for qPCR | MWG Eurofins | N/A | HPSF purification |
TaqMan PCR Universal Mastermix | Thermo | 4304437 | |
LoBind Eppendorf® tubes | Eppendorf | 30108078 | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 1000 μL | Fisher Scientific | TF-000-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 200 μL | Fisher Scientific | TF-200-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 20 μL | Fisher Scientific | TF-20-R-S | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 10 μL | Fisher Scientific | TF-10-R-S | |
PCR clean hood | LabCaire | Model PCR-62 | |
DynaMag™2-magnet | Thermo | 12321D | |
Streptavidin MagneSphere® paramagnetic particles | Promega | Z5481 | |
Casein | Thermo Scientific | 37582 | |
End over end rotator, Revolver™ 360° | Labnet | H5600 | |
Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Hydrochloric Acid | Sigma | H1758-100ML | |
EDTA disodium salt dihydrate | Electran (VWR) | 443885J | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Dri-Block® Analog Block Heater | Techne | UY-36620-13 | |
PCR tubes and domed caps | Thermo Scientific | AB0266 | |
PCR machine | Eppendorf | Mastercycler® series | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202M | |
40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000 | Sigma | P1458-25ML | |
Betaine solution, 5M | Sigma | B0300-1VL | |
Gel loading buffer II (formamide buffer) | Thermo Scientific | AM8546G | |
Precast 6% TBE urea gels | Invitrogen | EC6865BOX | |
Mini cell electrophoresis system | Invitrogen, Novex | XCell SureLock™ | |
Tris/Borate/EDTA solution (10x) | Fisher Scientific | 10031223 | |
Needle 21 G x1 1/2 | VWR | 613-2022 | |
SYBR Gold nucleic acid stain (10000x) | Life Technologies | S11494 | |
Dark Reader DR46B transilluminator | Fisher Scientific | NC9800797 | |
Ammonium acetate | Merck | 101116 | |
SDS solution 20% (w/v) | Biorad | 161-0418 | |
Centrifuge tube filter | Appleton Woods | BC591 | |
Filter Glass Fibre Gf/D 10mm | Whatman (VWR) | 512-0427 | |
polyadenylic acid (polyA) RNA | Sigma | 10108626001 | |
Glycogen, molecular biology grade | Thermo Scientific | R0561 | |
Isopropanol (2-propanol) | Fisher Scientific | 15809665 | |
Ethanol, molecular biology grade | Fisher Scientific | 10041814 | |
Accuprime™ Supermix I (DNA polymerase premix) | Life Technologies | 12342-010 | |
NEBNext® Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2) | New England Biolabs | E7335S; E7500S | |
Tapestation D1000 Screentape High sensitivity | Agilent Technologies | 5067- 5584 | |
Tapestation D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067- 5585 | |
2200 Tapestation – automated gel electrophoresis system | Agilent Technologies | G2965AA | |
Agencourt® AMPure® beads XP | Beckman Coulter | A63880 | |
Qubit™ dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
Qubit™ 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Topo™ TA cloning Kit | Invitrogen | 450071 | |
Sequencing platform: MiSeq System | Illumina | ||
Experiment Manager (Sample sheet software) | Illumina | Note: Use TruSeq LT as a template | |
Miseq™ Reagent kit V3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Sequencing hub: Basespace | Illumina | https://basespace.illumina.com | |
Ligase A: Thermostable 5’ App DNA/RNA ligase | NEB | M0319S | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
Ligase B: T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
Ligase C: CircLigase | Epicentre | CL4111K | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |