여기 우리는 초기 3′-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.
바이러스 복제 중 핵 산 중간체의 모니터링 바이러스 DNA 합성에 효과 항 바이러스 화합물 및 호스트 세포 단백질의 행동의 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 여기 우리가 정의 retroviral 반전 녹음 방송 중간체 생리의 컨텍스트 내에서 바이러스 감염의 수 있는 세포 기반, 높은-범위, 그리고 고해상도 분석 결과의 부족을 해결 합니다. 설명된 방법은 3′-테르미니 단일 뉴클레오티드 해상도 에이즈-1 감염 된 세포 내에서 초기 보완 DNA (cDNA) 분자의 캡처. 프로토콜 전체 세포 DNA, 바이러스 성 DNA 통해 하이브리드 캡처, 어댑터 결 찰, 젤 정화, PCR 증폭, 깊은 시퀀싱 및 데이터 분석에 의해 크기 분류의 대상된 농축의 수확을 포함 한다. 중요 한 단계 3′-DNA 테르미니 열 접합 기 분자의 효율적이 고 공평한 결 찰 이다. 설명된 방식 주어진된 샘플에 각 특정 길이의 역 증명서의 풍부를 결정합니다. 그것은 또한 어떤 잠재적인 돌연변이 역 증명서 및 그로 인하여 (내부) 시퀀스 변화에 대 한 정보를 제공합니다. 일반적으로, 분석 결과 DNA 3′-확장, 관련 된 모든 질문에 대 한 적합 한 서식 파일 시퀀스 알려져 있다 합니다.
해 부하 고 바이러스 복제 완전히, 점점 더 세련 된 복제 캡처 기술을 이해 중간체가 필요 합니다. 특히, 감염 된 세포의 컨텍스트 내에서 바이러스 성 핵 산 종의 정확한 정의 날짜 필요가 많은 바이러스 성 복제 메커니즘 새로운 통찰력을, 제공할 수 있습니다 되었습니다 고립 생체 외에서 반응 검사. 대표적인 예는 레트로 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 1 (hiv-1) 등에서 반전 녹음 방송 과정입니다. 에이즈-1 반전 녹음 방송, 동안 바이러스 성 효소 역전사 (RT) 복사 단일 가닥 RNA 게놈 이중 가닥 DNA의 다양 한 단계 순화 된 단백질으로 뇌관 확장 분석 실험에서 주로 공부 하 고 핵 되었습니다. 산1,2,3,,45. 기본 원리는 설치 되었다, 하는 동안 이러한 분석 모든 바이러스 및 세포질 구성 요소를 포함 하지 않습니다 그리고 관련된 요인의 생물학 관련 stoichiometries 반영 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 우리는 그들의 정확한 cDNA 3′-테르미니 (즉, 그들의 정확한 길이 결정)와 생활의 감염의 맥락에서 뉴클레오티드 순서 반전 녹음 방송 중간체의 스펙트럼을 결정 하는 강력한 기술 설계 셀6. 시간 과정 실험 항 바이러스 분자 또는 단백질, 효율성 및 processivity DNA 합성에 영향을 미칠 수의 존재 등 다양 한 조건 하에서 증명서의 프로 파일을 비교에 이용 될 수 있다에서 데이터 수집 및 축적입니다. 이것은 종종 대상된 약물 설계 및 성공적인 치료 적 개입에 대 한 기초 자연 병원 체 라이프 사이클의 더 상세한 이해가 있습니다.
일련의 다음 빼기 가닥 강한 정지 라는 짧은 단일 가닥 cDNA 녹취 록을 생산 하는 RT에 의해 확장 된 게놈 RNA 서식 파일에 tRNA 뇌관의 어 닐 링에 의해 시작 하는 연속 이벤트를 구성 하는 V-1 반전 녹음 방송 (-sss) (참조 그림 1)입니다. 그 후,-sss cDNA에서에서 전송 됩니다 5′-긴 단말기 반복 (LTR)는 3′-LTR 게놈 RNA, 그것 anneals와 역할 계속된 RT에 대 한 입문서 중재 마이너스의 신장으로 가닥 DNA의 (반전 녹음 방송1 리뷰 보기 , 2 , 3 , 4).이 첫 번째 가닥 전송 반전 녹음 방송;의 속도 제한 단계 중 하나입니다 따라서,-sss cDNA 축적으로 알려져 있다. 감염 된 세포에 반전 녹음 방송 제품을 잡으려고 기본 워크플로 및 라이브러리 디자인 그림 2a에 설명 되어. 특정 뇌관 및 분석 프로토콜에 사용 되 고 표 1 에 나열 된 설정을 대상으로 모두 일찍 반전 전사 cDNA 중간체 23에서 ~ 650의 길이 범위 내에서 nt, 180-182 nt sss DNA를 포함 됩니다. 그러나, 전략에 적절 한 부 적응 하면 후반 반전 녹음 방송 제품 뿐만 아니라 다른 바이러스 및 시스템, 응용 프로그램 목표 3′-OH 포함 DNA 끝을 감지 하는 있습니다. 고려해 야 할 중요 한 제한 포함 최종 PCR 제품의 길이 범위 도서관; 특히, 서식 파일에는 오픈 3′-말단에 어댑터와 업스트림 뇌관 사이트 사이 거리 초과 ~ 1000 nt 것입니다 가능성이 덜 효율적으로 시퀀싱 할 잠재적으로 라이브러리 준비 (동안 기술 편견 오해 소개 자세한 내용 및 적응 제안에 대 한 토론 참조).
이전 3′-테르미니 핵 산 물가의 체계적인 측정 보고 기법 RNA, DNA, 분자에 집중 했다. 하나의 예제 3′ 레이스 (cDNA 끝의 급속 한 확대)7, mRNA의 polyadenylation에 의존 하는. 또한, 어댑터 결 찰 기반 전략 RNA ligases 고용 개발 되었다, RLM-레이스 (RNA 리가 중재 경주)8 또는 레이스 (cDNA 끝의 결 찰 기반 확대)9는 포함. 그것은 결 찰 기반 확대는 어떤 바이어스도 자체 결 찰 반응에 의해 도입에 민감한 강조 하는 것이 중요입니다. 예를 들어 결 찰 3′ 위치, 순서, 총 분자 길이, 또는 로컬 구조체에 특정 염기에 따라 더 효율적일 수 있습니다. 리가 환경 설정 같은 분자와 우리와 다른9,10관찰 판독에 허위 진술의 불완전 한 캡처 이어질. 여기에 설명 된 프로토콜의 어댑터 추가 단계 동안 결 찰 바이어스를 최소화 하기 위해 우리는 결 찰 전략의 수를 테스트 하 고 T4 DNA 리가 머리 핀 단일 가닥 DNA 접합 기의 사용을 발견 (곽 외에 의해 설명된대로. 11) 유일한 프로시저를 결 찰 효율 제어 oligonucleotides6특별히 선택 된 세트와 함께 평가 하는 때에 큰 차이가 발생 하지 않았다 양적 결 찰에 가까운 것. 이 결 찰 전략의 선택은, 그러므로,이 프로토콜의 성공에 주요 기능.
날짜 하려면, 감염 된 세포에 있는 에이즈-1 RT 진행의 모니터링 주로 성취 되어 고유 하 게 측정 하는 짧은 지 또는 긴지를 뇌관 프로브 세트를 사용 하 여 양이 많은 PCR (정량)와 다양 한 길이의 반전 녹음 방송 제품을 측정 하 여 (초기와 늦게, 각각) cDNA 제품12,,1314. 이 정량 접근은 셀룰러 시스템에서 반전 녹음 방송 과정의 본질적인 효율성을 결정 하는 적절 한, 출력 시퀀스 정보 없이 파생 되 고 상대적으로 낮은 해상도입니다. 우리의 새로운 접근, 기술 격차 최적화 된 어댑터 결 찰, PCR 중재 라이브러리 생성 및 깊은 시퀀싱 주소에 기반 하 고 양적 및 단일 뉴클레오티드에 에이즈-1 감염 시 반전 녹음 방송 모니터링 하는 기회 제공 해상도입니다.
우리 두 제안 된 모델에 대 한 HIV-1 제한 요소 APOBEC3G의 용량 (apolipoprotein B mRNA 편집 효소 촉매 polypeptide 같은 3 세대) 방해 하 사이 구별 하는 연구에서이 메서드의 유틸리티 설명가지고 바이러스 역 사본6의 생산입니다.
빠르고, 안정적이 고 비용 효율적인 딥 시퀀싱의 가용성 시퀀싱 기반 분석에 훌륭한 깊이 허용 하는 생명 과학의 분야에서 여러 측면을 혁명 있다. 나머지 도전 시퀀싱 라이브러리는 혁신적인 디자인 및 대표의 창조에 있다. 여기는 초기 바이러스 성 cDNA 분자, 특히 에이즈-1 반전 녹음 방송 과정의 중간체를 잡으려고 프로토콜에 설명 합니다.
이 전략에서 가장 중요 한 단계 양적이 고 공평한 방법으로 한 어댑터는 오픈 3′-테르미니에의 결 찰입니다. 두 ssDNA 테르미니 사이 ligations의 효율성, 둘 다 간-및 intramolecular, 조사 및 다양 한 애플 리 케이 션11,26,27,,2829에 대 한 최적화 되었습니다. 3.3 단계에 설명 된 조건에서 T4 DNA 리가와 머리 핀 어댑터를 사용 하 여의 선택은 우리가 다른 ligases, 어댑터 및 대표 하는 합성 oligonucleotides의 결 찰에 대 한 시 약을 평가 하는 경험적 최적화의 결과 에이즈-1 시퀀스 (표 2) (데이터 표시 되지 않음). 이러한 생체 외에서 시험 반응에서 우리 확인 T4 DNA 리가 머리 핀 접합 기의 결 찰 중재 곽 외에 설명 된 대로. 11, 매우 낮은 바이어스를가 하 고 초과에서 어댑터를 사용할 때 수락자 분자의 완전 한 결 찰 근처 달성 한다. 결 찰 효율은 멀티플렉스 뇌관 시스템에 대 한 호환 되는 어댑터를 렌더링을 뉴클레오티드 순서의 추가 의해 영향을 받는 ( 그림 4참조). 비교에서는, 우리가 발견 한 내 5′ DNA/RNA 리가 (“A 리가” 참조 테이블의 자료 여기에 비해 정확한 ligases), 인 한 조작된 RNA 리가 일부 개발 된 ssDNA 수락자로 결 찰 효율 개선 27, RNA 리가 (이 하 “리가 B”) 하지만 단일 기본 길이 차이 [표 2 oligonucleotides 사이 결 찰 효율에 강한 차이와 중요 한 바이어스를 했다 보다 두 ssDNA 분자 ligating에서 실제로 더 효과적 이었습니다. ; HTP G (a)와 (b) 중반 죄수]. 또한, 우리 발견만 최소한의 편견 반응에는 무작위로 5′-테르미니 들고 어댑터와 함께 “리가 C” (전략 “리가 C”의 알려진된 뉴클레오티드 바이어스를 오프셋 하는 데 사용; 딩 외예를 참조 하십시오. 그러나 30)., “리가 C”-중재 intermolecular ligations 완료, 렌더링 T4 DNA 리가 시스템 우수한 선택 했다.
프로토콜의 과정 및 긍정적이 고 부정적인 컨트롤의 포함 몇 가지 품질 관리 단계 분석 결과 계속 하기 전에 잠재적인 문제 탐지에 대 한 허용 하 고 노력을 해결 하기 위한 지침을 제공. 2.2.2 및 2.3.12 단계에서 정량 quantifications 입력된 자료의 양이 충분 한지 확인 합니다. 전형적인 cDNA에서 약 10, 000에 300, 000 µ L 당 200 µ L (단계 2.1)에서 차입 범위에 복사 번호. 하이브리드 캡처 단계 전체 에이즈-1의 일부 손실 될 수 있습니다 cDNA 수량을 농축 하 여 전후 genomic DNA를 정할 적절 한 뇌관을 사용 하 여 결정 될 수 있는 세포 DNA에 특정 HIV-1 cDNA의 강한 농축 초래 한다 하지만 정량 Pcr 또는 총 DNA 농도 측정 하 여. 복구 된 HIV-1 cDNA 하이브리드 캡처 단계 후 입력의 적어도 10% 되어야 합니다. 낮은 시작 물자 그렇지 않으면 성공적인 oligonucleotide 긍정적인 통제를 설명할 수 있습니다 (단계 3.3.2 참조) 읽기 샘플에서 달성만 국한. 낮은 읽기 전체 숫자 또한 MiSeq 어댑터 없이 없는 DNA의 존재로 인해 라이브러리 농도의 과대평가 의해 설명 될 수 있었다. 이 낮은 클러스터 밀도 귀 착될 것입니다 그리고 fluorometric 분석 실험에 의해 DNA 총계 뿐만 아니라 정량 하 여 라이브러리에 있는 에이즈-1 시퀀스의 농도 결정 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 방법의 매우 민감한 성격 때문에 특별 한 주의 낮은 수준의 오염 뿐만 아니라 실험실 장비에서 (특히에서 높은 농도 제어 oligonucleotide 주식) 다른 샘플에서 둘 다 피하기 위하여 취해야 한다. UV 살 균 PCR 워크스테이션에서이 점에서 유리 하다. 마지막 도서관 (6.1.2 단계)의 자동화 된 젤 전기 이동 법은 더 품질 관리 조치 이다. 일반적으로 관찰 하는 핵 산 크기 범위는 150 ~ 500 nt. 뇌관 PCR 후 고 정화 (단계 5.2에서에서 참고) 수 결 석 하기 전에 선택적 컨트롤에서 검출 될 수 있는 사이입니다. 대표적인 결과 샘플 강도 곡선 피크는 약 160에서 170 nt와 두 번째 선명 피크 약 320 ~ 350 nt. 이 가능성이 상대적으로 짧은 (1 ~ 20 nt 삽입 길이) 역방향 성적표와 전체 길이 강한 정지 (180 182 nt 삽입 길이)에서 자주 본 더 높은 풍부를 반영 한다 (그림 3b).
제시 프로토콜 및 선택 된 뇌관은 초기 HIV-1 반전 녹음 방송 구조에 대 한 특정, 방법은 오픈 3′-테르미니 DNA의 결정을 목표로 모든 연구에 일반적으로 적용 됩니다. 다른 컨텍스트에서 필요한 주요 수정 하이브리드 캡처 및 뇌관 디자인 전략에 대 한 방법 있을 것입니다. 예를 들어 대상이 늦은 HIV-1 성적 증명서에 적응 될 경우, 많은 수는 cDNA의 길이 어 닐 링 하는 다른 캡처 biotinylated oligonucleotides의 권장 것 그리고 하이브리드 캡처 단계에서 손실 가능성이 줄어듭니다. 소개에서 설명 했 듯이, 그것은 한계는 3′-테르미니 바이어스의 다른 소스를 피하기 위해 감지 하는 범위를 설계할 때 고려 하는 것이 중요. 첫째, 있을 수 있습니다 편견 PCR 반응에는 어댑터와 템플릿은 훨씬 다양 한 길이의 경우입니다. 둘째, 시퀀싱 플랫폼 여기 사용 (예: MiSeq)는 최적의 클러스터링 원하는 삽입 길이 범위 고 훨씬 짧고 긴 제품 수 있습니다 하지 시퀀싱 할 같은 효율으로. 부분에서,이 계산, 선형 길이 바이어스에 대 한 수정 계수를 계산 하 여 이루어졌다 해결할 수 있습니다 ( 그림 4, 하단 그래프 참조). 그러나, 3′-테르미니 매핑을 원하는의 영역이 긴 경우 (> 1000 nt), 그것은 더 합자 녹취 록과 함께 반응 고 여러 업스트림 뇌관을 사용 하 여 3′-테르미니 섹션에서 평가 하는 것이 좋습니다.
분석 프로그램 자체 고정된 어댑터 시퀀스에 인접 한 HIV-1 시퀀스의 마지막 뉴클레오티드 모두는 물론 모든 돌연변이 식별 하기 위해 모든 기지의 기본 변화 분석의 특정 목적을 위해 작성 되었습니다. 다음을 구성 하는 개별 단계: 첫째, 어댑터 시퀀스 fastx 0.0.13 툴킷;를 사용 하 여 손질은 다음, (의미는 바코드를 포함 하 여 동일한 시퀀스) 중복 되는 모든 시퀀스는 제거 됩니다. 모든 나머지 독특한 읽기 다음 Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)를 사용 하 여 3 개의 기초에서 설정 최대 불일치와 에이즈-1 시퀀스에 정렬 됩니다. 서식 파일 시퀀스의 첫 번째 635 구성 에이즈-1 cDNA (NL4.3 스트레인)-sss 시퀀스 및 polypurine 트랙 (U5-R-U3-PPT; 그림 1참조)까지 첫 번째 가닥 전송 제품의 nt. 따라서, 제공 된 소프트웨어 및 서식 파일 (V-1NL4.3의 초기 역 증명서의 감지) 같은 응용 프로그램에 대 한 메서드를 사용 하는 경우 직접 적당만 하다. 다른 대상 시퀀스에 대 한 만들 수 조정 해야한다. 3′-테르미니 각 읽기에 대 한의 위치 맞춤에 위치에 의해 결정 되었다. 각 위치에 대 한 기본 호출 기록 하 고 돌연변이 속도 변화, 읽기는 서로 다른 길이의 긴 삽입 하지 적용 될 수 있습니다 완전히 Read2에 125 기반 시퀀싱으로 각 베이스의 전체 범위에서 계산 됩니다.
결론, 설명된 방법 연구의 많은 유형 위한 유용한 도구가 될 믿습니다. 확실 한 응용 프로그램 기본 투여 약물 또는 셀룰러 제한 요소를 통해 반전 녹음 방송 억제 메커니즘의 조사를 포함 합니다. 그러나,만 비교적 작은 조정 3′-테르미니 다른 단일 가닥 DNA 바이러스 중간체, parvovirus 복제에서 예를 들어, 나타나는 내 매핑 시스템에 맞게 해야 한다. 또한, 방법, 특히 그것의 최적화 된 결 찰 단계, 원칙 elongations 세포 이중 가닥 DNA에 의해 촉매를 포함 하 여 모든 3′-DNA 확장 특성에 대 한 라이브러리 준비 디자인의 핵심 부분을 제공할 수 있습니다. polymerases입니다.
The authors have nothing to disclose.
저자 인정 말림 실험실, 루이스 아폴로, Jernej Ule, 그리고 레 베 카 Oakey의 구성원에서 지원 합니다. 저자는 왕의 대학 런던 게놈 센터에서 매트 Arno와 데 비 휴즈 대학 대학 런던 (UCL)에 감사, 연구소 시설에 대 한 신경과 다음 세대 시퀀싱, MiSeq 시퀀싱에 대 한 실행 됩니다. 일 부여 계약 영국 의료 연구 위원회 (G1000196와 미스터/M001199/1 mm은), Wellcome 신뢰 (106223/Z/14/Z mm은 하), 유럽 위원회의 일곱 번째 기구 프로그램 (FP7 2007-2013 년)에 의해 지원 되었다 아니. PIIF-가-2012-329679 (D.P.), 하와는 보건 통해 남자와 세인트 토마스 ‘ NHS 재단 건강 연구 종합 메디컬 연구 센터 수상 국립 보건원 왕의 대학 런던 그리고 임금의 협력에 대 한 신뢰 대학 병원 NHS 기초 신망입니다.
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Gibco | 31966-021 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15150-122 | |
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HeraCell Vios 250i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030966 | |
Laminar flow hood – CAS BioMAT2 | Wolflabs | CAS001-C2R-1800 | |
10mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
TrypLE™ Express (1x), Stable Trypsin Replacement Enzyme | Gibco | 12605-010 | |
OptiMEM® (Minimal Essential Medium) | Gibco | 31985-047 | |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | NIH Aids reagent program | 114 | |
Polyethylenimine (PEI) – MW:25000 | PolySciences Inc | 23966-2 | dissolved at 1mg/ml and adjusted to pH7 |
RQ1- Rnase free Dnase | Promega | M6101 | |
Filter 0.22 μm | Triple Red Limited | FPE404025 | |
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Sucrose | Calbiochem | 573113 | |
Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 14190-094 | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | |
Ultracentrifuge | Sorval | WX Ultra Series | Th-641 Rotor |
Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit | Perkin Elmer | NEK050001KT | |
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Roswell Park Memorial Institute Medium | Gibco | 31870-025 | |
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Benchtop centrifuge: Heraus™ Multifuge™ X3 FR | Thermo Scientific | 75004536 | |
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Oligonucleotides for qPCR | MWG Eurofins | N/A | HPSF purification |
TaqMan PCR Universal Mastermix | Thermo | 4304437 | |
LoBind Eppendorf® tubes | Eppendorf | 30108078 | |
Axygen™ aerosol filter pipette tips, 1000 μL | Fisher Scientific | TF-000-R-S | |
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PCR clean hood | LabCaire | Model PCR-62 | |
DynaMag™2-magnet | Thermo | 12321D | |
Streptavidin MagneSphere® paramagnetic particles | Promega | Z5481 | |
Casein | Thermo Scientific | 37582 | |
End over end rotator, Revolver™ 360° | Labnet | H5600 | |
Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
Hydrochloric Acid | Sigma | H1758-100ML | |
EDTA disodium salt dihydrate | Electran (VWR) | 443885J | |
Sodium Chloride | Sigma | S3014 | |
Dri-Block® Analog Block Heater | Techne | UY-36620-13 | |
PCR tubes and domed caps | Thermo Scientific | AB0266 | |
PCR machine | Eppendorf | Mastercycler® series | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202M | |
40% Polyethylene glycol solution (PEG) in H2O, MW: 8000 | Sigma | P1458-25ML | |
Betaine solution, 5M | Sigma | B0300-1VL | |
Gel loading buffer II (formamide buffer) | Thermo Scientific | AM8546G | |
Precast 6% TBE urea gels | Invitrogen | EC6865BOX | |
Mini cell electrophoresis system | Invitrogen, Novex | XCell SureLock™ | |
Tris/Borate/EDTA solution (10x) | Fisher Scientific | 10031223 | |
Needle 21 G x1 1/2 | VWR | 613-2022 | |
SYBR Gold nucleic acid stain (10000x) | Life Technologies | S11494 | |
Dark Reader DR46B transilluminator | Fisher Scientific | NC9800797 | |
Ammonium acetate | Merck | 101116 | |
SDS solution 20% (w/v) | Biorad | 161-0418 | |
Centrifuge tube filter | Appleton Woods | BC591 | |
Filter Glass Fibre Gf/D 10mm | Whatman (VWR) | 512-0427 | |
polyadenylic acid (polyA) RNA | Sigma | 10108626001 | |
Glycogen, molecular biology grade | Thermo Scientific | R0561 | |
Isopropanol (2-propanol) | Fisher Scientific | 15809665 | |
Ethanol, molecular biology grade | Fisher Scientific | 10041814 | |
Accuprime™ Supermix I (DNA polymerase premix) | Life Technologies | 12342-010 | |
NEBNext® Multiplex Oligo for Illumina (Index Primer Set 1 and 2) | New England Biolabs | E7335S; E7500S | |
Tapestation D1000 Screentape High sensitivity | Agilent Technologies | 5067- 5584 | |
Tapestation D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067- 5585 | |
2200 Tapestation – automated gel electrophoresis system | Agilent Technologies | G2965AA | |
Agencourt® AMPure® beads XP | Beckman Coulter | A63880 | |
Qubit™ dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
Qubit™ 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
Topo™ TA cloning Kit | Invitrogen | 450071 | |
Sequencing platform: MiSeq System | Illumina | ||
Experiment Manager (Sample sheet software) | Illumina | Note: Use TruSeq LT as a template | |
Miseq™ Reagent kit V3 (150 cycle) | Illumina | MS-102-3001 | |
Sequencing hub: Basespace | Illumina | https://basespace.illumina.com | |
Ligase A: Thermostable 5’ App DNA/RNA ligase | NEB | M0319S | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
Ligase B: T4 RNA ligase 1 | NEB | M0204 | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |
Ligase C: CircLigase | Epicentre | CL4111K | Not used in this protocol, but tested in optimization process with results described in the discussion. |