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Biochemistry

台湾绿蜂胶的提取与分析

doi: 10.3791/58743 Published: January 7, 2019

Summary

我们提出了一个协议, 使用乙醇作为溶剂提取和表征台湾绿色蜂胶, 具有抗菌活性。

Abstract

台湾绿色蜂胶富含前乳化类黄酮类化合物, 具有广泛的生物活性, 如抗氧化剂、抗菌药和抗癌类。台湾绿色蜂胶的生物活性化合物为丙二醇, 即 c、d、f 和 g。台湾绿色蜂胶中的蜂胶浓度因季节和地理位置而异。因此, 建立一个标准的、可重复的程序来确定台湾绿色蜂胶的质量是至关重要的。在这里, 我们提出了一个协议, 使用乙醇为基础的提取, 高效液相色谱, 和抗菌活性分析, 以表征台湾绿色蜂胶质量。该方法表明, 95% 和99.5% 乙醇提取物可实现台湾绿色蜂胶的最大干物质产量, 从而产生具有抗菌性能的最高浓度的丙氨酸。根据这些发现, 本协议被认为是确定台湾绿色蜂胶质量的可靠和可重复的。

Introduction

蜂胶是由蜜蜂品种阿皮斯·梅莱夫生产的一种天然树脂混合物。蜂胶自古以来就被广泛用于民间医药。最近的一项研究报告说, 蜂胶有利于预防微生物感染和炎症1。大量研究表明, 蜂胶中的主要生物活性化合物是黄酮类化合物、酚酸酯、婚前性p-香豆酸和二戊酸 2,3。通过高效液相色谱法 (hplc)4567, 测定了台湾绿蜂胶中10种婚前黄酮衍生物。其中最丰富的是丙二醇 c、d、f和 g 57。台湾绿色蜂胶具有相当大的生物效应, 与其高含量的丙氨酸8有关。

蜂胶中生物活性化合物的浓度因获得蜂胶的季节和地理位置而有很大差异。欧洲蜂胶主要含有黄酮类和酚酸 9.巴西蜂胶中的主要生物活性化合物是婚前的p-香豆酸, 如青蒿素 c10.一项研究表明, 该季节是决定台湾绿色蜂胶 11总丙氨酸含量的关键因素。台湾绿色蜂胶中的丙蛋白含量在夏季 (5月至7月) 最高, 在冬季最低。蜂胶的抗菌性能被广泛认为是生物活性的指标。一般来说, 从各地区采集的蜂胶样品具有类似的抗菌性能;例如, 它通常对几乎所有革兰氏阳性细菌有效, 对革兰氏阴性菌101213 具有有限的抗菌作用。结果表明, 蜂胶中黄酮类化合物之间的协同作用具有抗菌作用.同样, 据报道, 台湾绿色蜂胶对革兰氏阳性菌抗菌作用。此外, 一项研究还确定了在台湾绿色蜂胶8中, 丙氨酸相互作用的抗菌作用。

蜂胶中生物活性化合物的特性是困难的, 因为其化学成分可能因其来源而异。因此, 有必要建立一种可行的、可重复的方法来确定台湾绿色蜂胶的质量。然而, 台湾绿色蜂胶提取和随后的功能分析还没有建立标准程序。提出了几种不同应用有机和无机溶剂的蜂胶提取方法 16171819、20.由于蜂胶是一种亲脂性混合物, 研究表明, 有机萃取比无机萃取物的提取物好于无机萃取物8、1819.台湾绿色蜂胶中的总丙蛋白浓度及其抗菌性能是衡量台湾绿色蜂胶质量的关键指标。因此, 本研究的目的是提出一种利用乙醇作为溶剂提取和表征台湾绿色蜂胶抗菌性能的方案。

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Protocol

1. 乙醇提取化合物的制备

  1. 重量10克冷冻台湾绿色蜂胶, 这是从台湾蜂箱收集的 5月至7月, 并使用香料研磨机磨碎。确认整片台湾绿色蜂胶被磨成细粉, 没有任何大颗粒。
  2. 加入100毫升的各种浓度的乙醇 (60%, 70%, 80%, 95% 和 99.5%) 和水分离烧瓶, 并混合每个浓度的10克地面蜂胶。
  3. 在25°c 下孵化, 并在250转/分的温度下摇瓶48小时。
  4. 通过孔径为25μm 的滤纸过滤乙醇提取物。
  5. 用95% 乙醇用体积瓶将滤液重新合成到原来的体积 (100 毫升)。
  6. 将乙醇提取物存放在-20°c。
    注: 协议可以在此处暂停。

2. 高效液相色谱法乙醇提取物的制备

  1. 在40°c 下真空蒸发, 将乙醇提取物中的10毫升浓缩15分钟。
  2. 在45°c 下将干燥物质烤24小时。
  3. 用10% 的乙醇重新测定干物质。
  4. 使用孔径为0.45μm 的无菌注射器过滤器, 过滤1毫升乙醇提取物。
  5. 使用孔径为0.22μm 的无菌注射器过滤器对乙醇提取物进行再过滤。滤液收集, 可直接用高效液相色谱法进行分析。

3. 高效液相色谱法分析丙氨酸含量

  1. 丙氨酸标准曲线的建立
    1. 制备 8: 11.2 (v/v) 甲醇的流动相的 1 l: 水溶液。
    2. 用流动相溶液作为溶剂, 制备丙氨酸标准 (c、d、f 和 g) 浓度 (15.625 mgml、31.25 mgl、62.5 mg/ml 和 125 mgml) 的连续稀释剂。
    3. 将20μl 的丙氨酸标准浓度注入反相柱, 从低浓度依次注入高浓度。
    4. 将高效液相色谱柱设置为 30°c, 流速为 1 ml/min。
    5. 将紫外线探测器的波长设置为280纳米, 记录仪的时间设置为20分钟。
    6. 分析至少3倍的标准。
    7. 使用计算表软件绘制测量响应 (y 轴) 对浓度 (x 轴), 并使用方程和 r-平方值创建标准曲线。
  2. 分析乙醇提取物s
    1. 将从步骤2.5 中获得的乙醇提取物注入反相柱20μl。
    2. 将高效液相色谱柱设置为 30°c, 流速为 1 ml/min。
    3. 将紫外线探测器的波长设置为280纳米, 记录仪的时间设置为20分钟。
    4. 分析至少3倍的标准。
    5. 计算乙醇提取物中丙氨酸的浓度, 使用从步骤3.1.7 得到的标准曲线的方程, 该曲线使用每个丙氨酸的峰值面积。

4. 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分析

注: 微稀释法用于评价台湾绿蜂胶中乙醇提取的丙氨酸的抗菌效果。

  1. 测试生物的制备
    1. 解冻细菌菌株,金黄色葡萄球菌大肠杆菌,然后分别在三叶草大豆肉汤和营养液中培养, 在37°c 下, 24小时。
    2. 使用色粒豆汤和大肠杆菌使用两代营养肉汤的金黄色葡萄球菌通道, 然后通过计算琼脂板上的单个菌落来计算菌落形成单位。
  2. 乙醇提取物的制备抗菌活性测试
    1. 在40°c 下真空蒸发, 将步骤1.5 中提取的乙醇提取物浓缩15分钟。
    2. 将干物质与二甲基亚硫酸盐 (dmso) 重新组成, 并将提取物的浓度调整为 12.8 mg/ml。
    3. 使用肉汤对乙醇提取物进行连续稀释 (浓度: 5、10、20、40、80、160、320和640微克/毫升)。
  3. 最低抑制浓度测试
    1. 将0.156 至 64μg/l 的稀释乙醇提取物加入96孔板。
    2. 使用肉汤, 将体积调整为 100μl, 并在所有稀释中保持5% 的 dmso。
    3. 将100μl 的细菌培养 (1 x10 6/) 接种到96孔板中。
    4. 在37°c 条件下培养含有不同浓度乙醇提取物的培养物48小时。
    5. 根据浊度分析细菌的生长情况, 并在590纳米的情况下使用光学密度 (微板读取器) 来确定最小抑制浓度 (mic)。
  4. 最小杀菌浓度测试结果
    1. 从 mic 试验的每口井中接种10μl 的液体培养, 在琼脂板上没有生长。
    2. 在37°c 下孵化24小时。
    3. 通过确定没有可见细菌生长的最低浓度来确定杀菌活性。完全消除细胞生长的浓度被认为是最低限度的细菌浓度 (mbc)。

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Representative Results

乙醇提取的积极代表性数据见表 1。台湾绿蜂胶的干物质产量与乙醇的浓度呈正相关。95% 和99.5% 乙醇提取物的干物质产量最高。以水为萃取溶剂, 台湾绿色蜂胶的干物质产率最低。这些结果表明, 乙醇等有机溶剂在台湾绿色蜂胶提取中表现最佳。使用高效液相色谱法 (图 1a) 识别和量化标准丙氨酸 c、d、f 和 g 的信号。用单独的丙氨酸标准和高效液相色谱法 (图 1b) 对乙醇提取物中的丙氨酸信号进行了表征。通常情况下, 台湾绿色蜂胶中的丙氨酸 (c、d、f、g) 浓度与提取过程中的乙醇浓度呈正相关 (表 1)。台湾绿色蜂胶中的丙氨酸产量最高, 产于95% 和99.5% 的乙醇提取物中。

关于乙醇提取物抗菌效果的积极代表性数据见表 2。对乙醇提取物中金黄色葡萄球菌大肠杆菌的抗菌活性进行了研究。金黄色葡萄球菌乙醇提取物的平均 mic 和 mbc 分别为10-20μgml 和 20μgml (表 2)。水提取物对金黄色葡萄球菌没有抗菌作用 (表 2)。乙醇或水提取物均未观察到对大肠杆菌的抗菌作用 (表 2)。

Figure 1
图 1: 台湾绿色蜂胶中的丙氨酸鉴定.这些面板显示了 (a) 丙氨酸的标准和 (b) 使用高效液相色谱法测量台湾绿色蜂胶中的丙氨酸。这一数字已从 chen等人开始修改。8.请点击此处查看此图的较大版本.

溶剂 * 产量 (%) 丙氨酸 (c + d + f + g)
(mg/ml)
99.5% etoh 6675±0.5a* * 36.7±0.80a
95% etoh 66.25±0.50a 37.55±1.29 a
80% etoh 64.75±0.96b 34.25±0.71b
70% etoh 63.25±0.96c 31.53±0.31c
60% etoh 599.00±1.41d 29.34±1.59d
7.00±0.82e nd * * *

表 1: 用各种溶剂提取的台湾绿色蜂胶干物质产率 (%) 和丙氨酸含量 (mg/ml).* 用100毫升溶剂提取10克蜂胶, 最后将提取物重组为100毫升。* * 这些值是标准偏差 (sd) 的平均值±。a-e柱内没有共同上标的方法有显著差异 (p < 0.05)。nd = 未检测到。此表已从 chen等人处修改。8

提取 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌
mic (μgml) mbc (μgml) mic (μgml)
99.5% etoh 10 20 & gt;640
95% etoh 10 20 & gt;640
80% etoh 20 20 & gt;640
70% etoh 10 20 & gt;640
60% etoh 20 20 & gt;640
nd nd nd

表2:mic 和 mbc (μg/ml) 的各种提取物金黄色葡萄球菌大肠杆菌.此表已从 chen等人处修改。8

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Discussion

一项研究报告说, 使用不同浓度的乙醇进行浸渍可用于巴西蜂胶提取17;然而, 这一过程是耗时的17。从巴西蜂胶17中提取酚类生物活性化合物 (如酚类化合物) 至少需要10天。另外, 乙醇萃取结合加热在 37°c, 50°c, 或 70°c 30分钟, 已被建议提取巴西蜂胶19,21,22.根据乙醇19的含量, 测定巴西蜂胶中的生物活性化合物的提取是有差异的。由于巴西蜂胶和台湾绿色蜂胶的化学成分不同, 蜂胶中生物活性化合物的提取效率可能会有所不同。在这里, 我们提供了一个可靠和可重复的协议提取台湾绿色蜂胶。台湾绿色蜂胶中的生物活性化合物可以在2天内收获, 使用乙醇作为溶剂。一个类似的发现也支持这里提出的协议, 并确定台湾绿色蜂胶中的丙氨酸 (c, d, f 和 g) 可以提取95% 乙醇与3天提取23。另一项研究表明, 95% 的乙醇与21小时的提取相结合, 能够从台湾绿色蜂胶24 中收获富含的前列腺素。然而, 在21小时乙醇提取后, 丙氨酸的确切浓度必须得到验证。研究人员提出, 加热过程可以提高巴西蜂胶19、2122 的提取效率。必须研究台湾绿色蜂胶中的蜂胶是否可以通过加热提取。

台湾绿蜂胶中的乙醇提取物对革兰氏阳性病原体有抗菌作用。由于蜂胶具有疏水性, 研究表明, 乙醇等有机溶剂是蜂胶萃取8161718、19的合适溶剂. 20岁。研究还表明, 乙醇浓度的增加会导致更多的生物活性化合物提取8171820。在本方案中, 台湾绿色蜂胶的最大干物质产率分布在95% 和99.5% 的乙醇提取物中, 以及最高浓度的丙氨酸和抗菌活性中。

本协议是为利用乙醇提取台湾绿色蜂胶设计的, 并根据丙氨酸的含量进行了质量评价。然而, 台湾绿色蜂胶中某些不溶于乙醇的生物活性化合物不能用本方案进行适当的分离。

与现有方法相比, 该方法最关键的方面是, 相对于其他研究 1723 中提出的方法, 该方法节省了时间。此外, 台湾绿色蜂胶的95% 和99.5% 乙醇提取物表现出高浓度的丙氨酸和抗菌活性。

该方法可直接用于表征台湾绿色蜂胶中其他未知的乙醇可溶性生物活性化合物。此外, 含有丙氨酸的乙醇提取物可用于测定其他生物活性。

关键的实验程序之一是确保台湾绿色蜂胶在研磨过程中的均匀性 (协议步骤 1.1)。台湾绿色蜂胶的研磨不当, 会导致干物质产量和丙氨酸含量低。重要的是要使用适当的研磨设备, 如香料研磨机, 组织磨床, 或均质机, 并注意蜂胶成为一个细粉, 没有任何大颗粒后, 研磨。

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Disclosures

提交人没有什么可申报的。

Acknowledgments

这份手稿是由华莱士学术编辑编辑。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ethanol Sigma-Aldrich E7023
Whatman no. 4 filter paper Sigma-Aldrich WHA1004125
methanol Sigma-Aldrich 34860
reverse phase RP-18 column Phenomenex Inc. 00G-0234-E0
Staphylococcus aureus ATCC BCRC 10780
Escherichia coli ATCC BCRC 10675
tryptic soy broth Sigma-Aldrich 22092
nutrient broth Sigma-Aldrich 70122
dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650
spice grinder Waring WSG60K
microplate Reader Molecular Devices EMAX PLUS
HPLC system Agilent 1200 Series
vacuum evaporation BÜCHI Rotavapor R-215

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Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).More

Chen, C. T., Chien, Y. H., Yu, Y. H., Chen, Y. W. Extraction and Analysis of Taiwanese Green Propolis. J. Vis. Exp. (143), e58743, doi:10.3791/58743 (2019).

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