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Biochemistry

प्रतिलेखन फैक्टर के उच्च संवेदनशीलता माप-प्रतिस्पर्धी अनुमापन द्वारा डीएनए बाध्यकारी समानताएं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

doi: 10.3791/58763 Published: February 7, 2019

Summary

यहां हम संतुलन में और समाधान में एक बड़े पैमाने पर उच्च संवेदनशीलता के साथ बाध्यकारी समानताएं निर्धारित करने के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत करते हैं । यह प्रतिलेखन कारक का मात्रात्मक विश्लेषण-डीएनए बाइंडिंग में सुधार करता है । विधि एक नियंत्रित वितरण प्रणाली में स्वचालित प्रतिदीप्ति anisotropy माप पर आधारित है ।

Abstract

प्रतिलेखन फैक्टर के सटीक ठहराव (TF)-डीएनए बातचीत जीन अभिव्यक्ति के विनियमन को समझने के लिए आवश्यक है । महत्वपूर्ण सीमाओं से ग्रस्त मौजूदा दृष्टिकोण के बाद से, हम एक बड़े पैमाने पर उच्च संवेदनशीलता के साथ TF-डीएनए बाइंडिंग समानताएं का निर्धारण करने के लिए एक नई विधि विकसित की है । परख स्थापित प्रतिदीप्ति anisotropy (एफए) सिद्धांत पर निर्भर करता है, लेकिन महत्वपूर्ण तकनीकी सुधार का परिचय । सबसे पहले, हम एक एकल अच्छी तरह से TF और एक खुली agarose जेल मैट्रिक्स में एक फ्लोरोसेंट लेबल संदर्भ डीएनए में शामिल करके एक पूर्ण एफए प्रतिस्पर्धी अनुमापन वक्र उपाय । unlabel्ड डीएनए oligomer एक प्रतियोगी के रूप में शीर्ष पर भरी हुई है और, प्रसार के माध्यम से, एक spatio-लौकिक ढाल रूपों । जिसके परिणामस्वरूप एफए ढाल तो एक स्वनिर्धारित epifluorescence माइक्रोस्कोप सेटअप का उपयोग कर बाहर पढ़ा है । यह सुधार सेटअप बहुत एफए संकेत का पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ जाती है, दोनों कमजोर और मजबूत बाध्यकारी मज़बूती से quantified, यहां तक कि इसी तरह आणविक भार के अणुओं के लिए अनुमति देता है । इस फैशन में, हम एक बहु अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से एक अनुमापन वक्र उपाय कर सकते हैं, और एक फिटिंग प्रक्रिया के माध्यम से, हम दोनों निरपेक्ष पृथक्करण निरंतर (कश्मीरडी) और सक्रिय प्रोटीन एकाग्रता निकाल सकते हैं । एक दिया आम सहमति बाध्यकारी अनुक्रम के सभी एकल बिंदु उत्परिवर्तन वेरिएंट परीक्षण करके, हम एक TF के पूरे बंधन विशिष्ट परिदृश्य सर्वेक्षण कर सकते हैं, आमतौर पर एक ही थाली पर । जिसके परिणामस्वरूप स्थिति वजन मैट्रिक्स (PWMs) vivo TF अधिभोग में भविष्यवाणी में अंय तरीकों से व्युत्पंन उन मात । यहां, हम एक पारंपरिक स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और डेटा विश्लेषण पाइपलाइन पर हिप-एफए को लागू करने के लिए एक विस्तृत गाइड प्रस्तुत करते हैं ।

Introduction

लेखन कारकों की केंद्रीय भूमिका को देखते हुए जीन विनियमन में (TFs), एक मात्रात्मक तरीके से अपने बाध्यकारी वरीयताओं का निर्धारण सर्वोपरि महत्व का है । Hippel द्वारा प्राथमिक अध्ययन धारणा है कि विनियामक TFs तेजी से डीएनए, ऐसी है कि उनके बाध्यकारी अच्छी तरह से ऊष्मा संतुलन द्वारा वर्णित है पहचान शुरू की, जबकि आरएनए पोलीमरेज़ की भर्ती के बहाव की घटनाओं प्रमोटर द्वारा नियंत्रित कर रहे है धीमी कैनेटीक्स1. vivo बाइंडिंग अध्ययनों में हाल ही में इस चित्र और अधिक जटिल2,3की संभावना है कि सुझाव है; फिर भी, इन सामांय मांयताओं अच्छा संनिकटन के रूप में सेवा और कई गणना दृष्टिकोण का समर्थन किया है सीआईएस नियामक तत्वों को खोजने और अनुक्रम से अभिव्यक्ति की भविष्यवाणी4,5,6। जबकि संतुलन बंधन इस प्रकार सफलतापूर्वक एक अवधारणा के रूप में कार्यरत किया गया है, TF-डीएनए बातचीत का निर्धारण करने के लिए मौजूदा तरीके बंधन विशिष्टता पर ध्यान केंद्रित है और आम तौर पर सीधे संतुलन पर बाध्यकारी समानताएं उपाय नहीं है । TF-डीएनए बाइंडिंग की व्यवस्थित माप एक काफी तकनीकी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है, और मौजूदा तरीकों कई अलग सीमाएं हैं ।

क्रोमेटिन immunoprecipitation गहरी अनुक्रमण (चिप-seq)7, vivo तकनीक में सबसे प्रचलित द्वारा पीछा किया, बाध्यकारी समानताएं या जीनोमिक टुकड़ों के भीतर बाध्यकारी साइटों की सटीक स्थानीयकरण की माप की अनुमति नहीं है । इन विट्रो में कई तरीकों, DNase पदचिह्न8सहित, electrophoretic गतिशीलता पारी (EMSA)9, सतह plasmon अनुनाद (SPR)10, और अतिसूक्ष्म thermophoresis11 के लिए बाध्यकारी समानताएं उपाय करने में सक्षम हैं, लेकिन वे अपेक्षाकृत कम प्रवाह कर रहे हैं । इसके विपरीत, प्रोटीन बाध्यकारी microarrays सहित उच्च प्रवाहतकनीक 12, एचटी-SELEX 13,14, और बैक्टीरियल एक-संकर (B1H)15 बाध्यकारी समानताएं को मापने के लिए सक्षम नहीं हैं और आम तौर पर पीढ़ी की उपज विशिष्ट बाध्यकारी दृश्यों, जो मुख्य रूप से कड़े चयन या धुलाई आवश्यक कदम के कारण है । अधिक हाल के घटनाक्रम गहरे अनुक्रमण आधारित हिट-फ्लिप16, SELEX-seq17, और microfluidics आधारित MITOMI18 या मुस्कुराओ-seq19, जो निरपेक्ष बाध्यकारी समानताएं के निष्कर्षण के लिए अनुमति शामिल हैं; हालांकि, वे लेबल TF और डीएनए के प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने पर भरोसा करते हैं । प्रतिदीप्ति संकेतों, इसलिए, कम प्रोटीन सांद्रता पर सीमित हो जाते है और कम KD मूल्यों (< ~ 10 एनएम) का निर्धारण करने में । इसके अलावा, इन तरीकों में TF-डीएनए बाध्यकारी पतली सतहों पर जगह लेता है, विशिष्ट बाध्यकारी और/या ऑटो-प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि है, जो यह मुश्किल कमजोर बाध्यकारी बढ़ाता है के साथ मुद्दों की स्थापना ।

इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम संतुलन में और समाधान में TF-डीएनए संबध परिदृश्य का निर्धारण करने के लिए एक नई विधि विकसित की है, जिसे हम उच्च प्रदर्शन प्रतिदीप्ति anisotropy (हिप-एफए)20कहा जाता है । तकनीक की स्थापना की प्रतिदीप्ति anisotropy (एफए)21 परख पर आधारित है, लेकिन उच्च संवेदनशीलता और बड़े पैमाने पर एक स्वनिर्धारित स्वचालित माइक्रोस्कोप और विश्लेषण सेटअप का उपयोग कर के साथ बाध्यकारी स्थिरांक को मापने के लिए संशोधित ।

एफए परख एक बाध्यकारी भागीदार के लिए (एक डीएनए oligomer की तरह) फ्लोरोसेंट लेबल प्रजातियों की बातचीत पर नज़र रखता है, इस मामले में एक TF, लेबल अणु के आणविक रोटेशन को मापने के द्वारा । TF के लिए बाध्य करने पर, अपने रोटेशन की गति उच्च hydrodynamic त्रिज्या और बंधे जटिल है, जो वृद्धि हुई एफए में परिणाम के आणविक वजन के कारण कम हो जाती है । बहुत मजबूत बाध्यकारी (KD < ~ 1 एनएम) का सटीक माप लेबल, संदर्भ डीएनए (सी < ~ 1 एनएम) के कम सांद्रता के उपयोग की आवश्यकता है । इस तरह के एक मानक microplate पाठक के रूप में एक वाणिज्यिक साधन के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । इसके अलावा, एक बड़े आकार अंतर (10-100) बंधे और असीम परिसरों के बीच आम तौर पर आवश्यक है, TF बाइंडिंग डोमेन और छोटे डीएनए oligomers, जो मोटे तौर पर समान आणविक भार की आम तौर पर कर रहे हैं के बीच बातचीत की माप प्रतिबंधित . अंत में, एक पूर्ण अनुमापन वक्र आम तौर पर तैयारी और कई कुओं की माप titrating प्रजातियों के लिए एक एकाग्रता श्रृंखला युक्त की आवश्यकता है ।

इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, हम एक widefield माइक्रोस्कोपी सेटअप का उपयोग करने के लिए उच्च का पता लगाने संवेदनशीलता को प्राप्त करने और एफए माप की अनुमति अलग z-एक भी अच्छी तरह से पदों । यह हमें समान आणविक वजन की प्रजातियों के बीच और उच्च समानताएं के साथ बाध्यकारी बातचीत पर नजर रखने के लिए सक्षम बनाता है । उच्च प्रवाह बहु में एफए अच्छी तरह से प्लेट प्रारूपों को मापने और एक अच्छी तरह से एक नियंत्रित वितरण प्रणाली का उपयोग कर में एक पूरी अनुमापन श्रृंखला बाहर ले द्वारा हासिल की है (चित्रा 1एक) । इसके अलावा, एक प्रतियोगी बाध्यकारी परख रोजगार के द्वारा, हम न केवल बाध्यकारी स्थिरांक निकालने लेकिन यह भी सक्रिय प्रोटीन की एकाग्रता । यह परख की एक महत्वपूर्ण विशेषता है, के बाद से ही व्यक्त TF अणुओं के एक हिस्से में प्रोटीन का खुलासा या गिरावट के कारण सक्रिय हैं । प्रायोगिक सेटअप XY-और Z-पीजो चरणों से सुसज्जित एक वाणिज्यिक epifluorescence माइक्रोस्कोप पर आधारित है । हम बाहरी लेजर उत्तेजना के साथ प्रणाली का उंनयन किया, तो एक EM के चिप पर दो उत्सर्जित रैखिक ध्रुवीकरण घटकों का पता लगाया-प्रकाश का पता लगाने के लिए उच्च क्वांटम क्षमता के साथ सीसीडी कैमरा (चित्रा 1बी और 1c) । प्रणाली एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) एक अति संवेदनशील संवेदक के लिए युग्मित उद्देश्य का उपयोग करता है और इस तरह अत्यधिक संवेदनशील एफए माप affords । प्रतिदीप्ति z-पोट रिकॉर्डिंग द्वारा, बाध्यकारी बातचीत ऑप्टिकल z-अक्ष के साथ मापा जा सकता है जब reactants के लिए एक विषम मैट्रिक्स का उपयोग कर । इन सभी संशोधनों को आसानी से एक मौजूदा प्रणाली पर लागू किया जा सकता है और लागत प्रभावी रहे हैं ।

हम एक प्रतियोगी बाध्यकारी परख जिसमें एक unlabeld डीएनए oligomer के बंधन संबंध फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए, जो एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है की तुलना में मापा जाता है रोजगार । TF और संदर्भ डीएनए एक असुरक्षित agarose जेल मैट्रिक्स (ताकना आकार ~ 1 µm) है कि बाध्यकारी के लिए एक गैर बातचीत पर्यावरण का गठन में तय सांद्रता में शामिल कर रहे हैं । संदर्भ डीएनए Cy5 के साथ लेबल है । इस डाई के लिए अच्छी तरह से एफए अपने अपेक्षाकृत लंबे प्रतिदीप्ति जीवनकाल (~ 1ns) और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन दूर दिखाई स्पेक्ट्रम (कम ऑटो प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि) के कारण माप के लिए अनुकूल साबित हुआ । TF एकाग्रता Cy5-संदर्भ डीएनए पर दाढ़ अतिरिक्त में है, यह सुनिश्चित करना है कि सभी संदर्भ डीएनए प्रोटीन के लिए बाध्य है । अनलेबल्ड प्रतियोगी डीएनए का एक समाधान तो जेल की सतह पर जमा है और छिद्रित मैट्रिक्स के अंदर फैलाना, एक एकाग्रता ढाल सी की स्थापना (जेड, टी) कि zपर परिवर्तन फोकल विमान और समय टी की स्थिति (चित्रा 1अ, चित्रा 2ए-2c). Cy5 संदर्भ डीएनए के लिए बाध्य TF इस प्रकार स्थानीय रूप से प्रतियोगी डीएनए कि बंधन के लिए प्रतिस्पर्धा, Cy5-संदर्भ डीएनए एफएरेफरी(जेड, टी) (चित्रा 2बी के एक गतिशील रूप से बदल एफए के लिए अग्रणी के विभिन्न सांद्रता को उजागर है और 2c).

प्रतियोगी (जेड, टी) एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, हम अलग कुओं (अंशांकन कुओं) में गतिशील रूप से नील नदी नीला (नायब) एफएएनबी(जेड, टी) (चित्रा 2ए और 3) के एफए संकेत बदलने के उपाय । यह डाई डीएनए में intercalates और इस तरह प्रतिस्पर्धी डीएनए के लिए एक डीएनए संवेदक के रूप में कार्य करता है । इस नियंत्रित वितरण प्रणाली के साथ, विभिंन डीएनए के सैकड़ों के लिए दसियों-प्रोटीन बाध्यकारी समानताएं एक बहु के भीतर मापा जा सकता है अच्छी तरह से प्लेट (९६-या ३८४-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप) । माप तब क्रमिक रूप से TF से लेबल संदर्भ डीएनए के पूर्ण विस्थापन तक किया जाता है । हम लंबाई nके आम सहमति अनुक्रम के सभी 3 एन एकल आधार उत्परिवर्तनों के समानताएं को मापने के द्वारा एक दिए गए कारक के लिए बाध्यकारी विशिष्टता निर्धारित हिप-एफए प्रोटीन की कम मात्रा की आवश्यकता है (~ अनुमापन वक्र प्रति pmols) और कश्मीरडीएस के निर्धारण में कम परिवर्तनशीलता से पता चलता है [परिवर्तन (CV) < 20% के गुणांक], जबकि एक अपेक्षाकृत बड़े पैमाने पर माप की अनुमति । विधि मैन्युअल या पूरी तरह से एक रोबोट प्रणाली का उपयोग कर स्वचालित रूप से आयोजित किया जा सकता है, यहां तक कि कम सीवी (चित्रा 4, ऊपरी पैनल) में जिसके परिणामस्वरूप. पृथक्करण स्थिरांक ०.५ एनएम के लिए नीचे उच्च सटीकता के साथ मापा जाता है । अत्यंत उच्च समानताएं (KD < 500pM) के लिए, हम निम्न स्तर (< १०० एनएम) पर प्रतिस्पर्धी डीएनए सांद्रता को मापने में अशुद्धियों के कारण एक मानक प्रतिस्पर्धी अनुमापन (चित्रा 5) का उपयोग करते हैं ।

हिप-एफए लगभग किसी भी मानक, औंधा, epifluorescence फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर लागू किया जा सकता है, एक स्वचालित XY-चरण और एक पीजो z-अक्ष चरण की उपलब्धता प्रदान की है । ऑप्टिकल घटक एक लंबी दूरी के उद्देश्य के साथ सुसज्जित एक स्वचालित widefield सेटअप के आसपास बनाया गया था । व्यवहार में, परख अंय विशेषताओं के साथ उद्देश्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (विशेष रूप से काम कर रहे, दूरी और संख्यात्मक एपर्चर) । हालांकि, इस पैरामीटर ( z-स्लाइस, porosity और agarose जेल, आदिकी ऊंचाई के बीच दूरी) के अनुकूलन की आवश्यकता है । अन्य प्रकार के लेसरों या कैमरे का उपयोग भी संभव है. प्रोटोकॉल अनुभाग में संपूर्ण प्रायोगिक प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण का विस्तृत विवरण नीचे दिया गया है ।

Protocol

1. ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी

  1. widefield लेजर रोशनी के लिए, एक सतत डायोड लेजर के ६३८ एनएम लाइन ध्यान केंद्रित (४० मेगावाट) बीम सफाई के लिए बहुपद्वति ऑप्टिकल फाइबर के एपर्चर पर । लेजर प्रकाश का ध्रुवीकरण सेट करने के लिए फाइबर के उत्पादन में एक रैखिक ध्रुवीकरण माउंट.
  2. एक dichroic मिरर (६४० एनएम कट-ऑफ) और एक bandpass फिल्टर (bandpass 700/75) के साथ उत्सर्जित प्रकाश के उत्तेजना घटक ब्लॉक ।
  3. प्रतिदीप्ति संकेत एक ध्रुवीकरण बीम अलगानेवाला है, जो अपने सीधा और समानांतर ध्रुवीय घटकों में उत्सर्जित प्रकाश विभाजन के माध्यम से गुजरती हैं । फिर, गैर ध्यान केंद्रित बीम (समानांतर घटक) और परिलक्षित बीम (सीधा घटक) एक पीठ की चिप पर २०० mm फोकल लंबाई के एक achromatic लेंस के साथ-प्रबुद्ध EM-कैमरा सीसीडी (1बी और 1c) । लेंस की ओर सीधा बीम की दिशा को समायोजित करने के लिए एक दर्पण का प्रयोग करें ।

2. डिजाइन और फ्लोरोसेंट-बला संदर्भ डीएनए Oligomer के परीक्षण

  1. संदर्भ डीएनए के मुख्य अनुक्रम का निर्धारण: विधि एक प्रतियोगी परख पर आधारित है कि एक प्रतिलेखन कारक और unlabel्ड प्रतियोगी डीएनए oligomer के बीच पृथक्करण स्थिरांक (KD2) उपाय है कि एक के साथ बाध्यकारी के लिए प्रतिस्पर्धा फ्लोरोसेंट डीएनए जिसका संबंध TF के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है लेबल (KD1) । DNase पदचिह्न या बैक्टीरियल 1-संकर जैसे अंय स्रोतों से प्राप्त आम सहमति अनुक्रम एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा कर सकते है5,15
    नोट: अंगूठे के एक नियम के रूप में, एक उपयुक्त संदर्भ डीएनए एक 3 से 7 गुना कम करने के लिए आम सहमति अनुक्रम की तुलना में TF बंधन संबध में कमी है ।
  2. हिप-एफए द्वारा माप पिछले कदम में व्युत्पंन आम सहमति अनुक्रम के 2-3 अस्थाई एकल उत्परिवर्तनों के एसD1। आम सहमति अनुक्रम है कि बाध्यकारी का पूरा नुकसान से बचने के लिए भी विशिष्ट नहीं है में पदों रूपांतरित करने की कोशिश करो ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि संदर्भ अनुक्रम ब्याज की प्रतिलेखन कारक से बंधे है (हम इस प्रोटोकॉल विशाल जीटी में इस्तेमाल किया), लेकिन नहीं भी दृढ़ता से, ताकि कमजोर प्रतियोगियों यह उच्च सांद्रता पर प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं ।
  3. मूल आकृति का विस्तार (आम तौर पर 8-12 आधार जोड़े) 16 आधार जोड़े या अधिक की लंबाई के लिए दोनों पक्षों में सममित पार्श्व अनुक्रम जोड़कर (उचित बाध्यकारी के लिए पक्ष श्रृंखला जोड़ें) । यदि आवश्यक हो (अब बाईडिंग डोमेन के लिए, उदाहरण के लिए), अब दृश्यों का उपयोग करें (अप करने के लिए ~ ५० लंबाई में आधार जोड़े हिप-एफए परख के साथ परीक्षण किया गया) ।
    चेतावनी: अस्थानिक बाइंडिंग साइटें बनाने के लिए अपेक्षा की जाती है कि कुर्सियां जोड़ने के लिए नहीं सावधान रहें । इस प्रक्रिया (जैसे, PySite22) की सुविधा के लिए उपलब्ध PWMs से बाइंडिंग साइट्स की भविष्यवाणी करने वाले गणना उपकरणों का उपयोग करें ।
  4. संदर्भ डीएनए, आदेश oligomers कि फ्लोरोसेंट या तो आगे या रिवर्स कतरा पर 3 ' या 5 ' अंत में लेबल रहे है लेबल के रूप में । का प्रयोग करें, उदाहरण के लिए Cy5, Bodipy-६५० या किसी अंय उपयुक्त डाई 10 µ एम की एकाग्रता में (१०० µ एम 10x स्टॉक) पानी में, और पतला stepwise के रूप में चरण ३.१ में वर्णित है ।
  5. ३३ mm पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच = ७.०), ९० mm NaCl, और आसुत पानी में ०.०१% गैर ईओण डिटर्जेंट जोड़कर 1x बाध्यकारी बफर के ५०० मिलीलीटर तैयार करें । भी 3x बाध्यकारी बफर, जो एक ही घटक है तिगुना सांद्रता को छोड़कर, तैयार करते हैं । यदि के रूप में 3x बाइंडिंग बफ़र का उपयोग कर स्टॉक समाधान 1x बाइंडिंग बफ़र के लिए, वॉल्यूम > ५०० mL तैयार; अंयथा, २५० मिलीलीटर तैयार करें ।
    नोट: यह रचना प्रतिलेखन कारक स्थिरता के लिए अनुकूलित और glutathione एस-ट्रांस्फ़्रेज़ (जीएसटी) dimerization को रोकने के लिए किया गया था ।
  6. माइक्रोस्कोप सेटअप चरण 1 में वर्णित के साथ माप बाइंडिंग बफर के २०० µ एल के एफए ०.८ एनएम एक गिलास नीचे माइक्रोस्कोपी ९६ में tf के विभिंन राशि की उपस्थिति में संदर्भ डीएनए लेबल-अच्छी तरह से प्लेट (5-6 कुओं के साथ अलग TF सांद्रता) TF एकाग्रता का उपयोग करने के लिए निर्धारित करें । TF की बढ़ती मात्रा के साथ एक अनुमापन श्रृंखला प्रदर्शन और परख एकाग्रता जिसके लिए वक्र एक पठार तक पहुंचता है के लिए चुनते हैं, डीएनए संदर्भ oligomer का पूरा बंधन का संकेत है ।
    नोट: इष्टतम tf एकाग्रता tf-डीएनए पृथक्करण स्थिरांक के मूल्यों पर निर्भर करता है । आम तौर पर, कम KDs कम सांद्रता की आवश्यकता होती है ।

3. Oligomer एनीलिंग

  1. के लिए लेबल संदर्भ डीएनए (पिछले चरण में निर्धारित अनुक्रम) का डीएनए oligomers को एनएन, मिश्रण एक 10 मिमी डाई के 7 µ एल-आगे एकल असहाय डीएनए समाधान और 7 µ के एक 10 mm एकाग्रता के एल लेबल रिवर्स १८६ µ एल में पानी की
  2. प्रतियोगी डीएनए दृश्यों के लिए, १०० mm समाधान के 20 µ एल मिश्रण (पानी में, निर्माता द्वारा प्रदान की) आगे एकल-असहाय डीएनए के १०० मिमी के साथ इसी रिवर्स एकल-असहाय डीएनए के 20 µ एल के साथ प्रत्येक व्यक्ति प्रतियोगी अनुक्रम के लिए मापा जा करने के लिए ।
  3. 3 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस के समाधान को गर्म करने और ०.१ K/s की दर से कम करने के लिए तापमान को कम करने के लिए एक मानक पीसीआर साइकिल चालक में अलग से एनीलिंग प्रदर्शन करें । यदि पीसीआर मशीन का इस्तेमाल किया है कि दर पर तापमान ढाल का समर्थन नहीं करता है, बस कम तापमान के साथ stepwise गर्मी है (परीक्षण के साथ 3 एस के ९९ चक्र थे-०.४ K प्रति चक्र) ।

4. जेल तैयारी

नोट: निम्नलिखित खंड जैल के दो अलग तरह की तैयारी बताते हैं: 1) अनुमापन कुओं प्रोटीन के साथ जैल होते हैं और संबंधित प्रतियोगी डीएनए दृश्यों के लिए कश्मीरडीएस निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, और 2) अंशांकन कुओं एनबी का उपयोग करने के लिए हर दिए गए समय बिंदु और अधिग्रहण ऊंचाई पर डीएनए एकाग्रता का निर्धारण । ध्यान एक ९६-खैर प्लेट में प्रयोग की तैयारी पर है, लेकिन एक ३८४ प्लेट प्रारूप के लिए इसी मात्रा भी संकेत दिया जाता है ।

  1. भंग ०.५% w/v कम पिघलने बिंदु agarose बाइंडिंग बफ़र में यह एक प्रयोगशाला माइक्रोवेव ओवन में उबलते द्वारा । पूर्ण विघटन के बाद, ddH2ओ के साथ मात्रा फिर से समायोजित करने के लिए संभव वाष्पीकरण के लिए क्षतिपूर्ति ।
    नोट: सुविधा के लिए, जैल के 10-20 10 मिलीलीटर aliquots का एक शेयर तैयार करें और उन्हें जरूरत पड़ने पर 75 डिग्री सेल्सियस पर पिघला दें । जेल स्टॉक्स आरटी में संग्रहित किया जा सकता है ।
    सावधानी: माइक्रोवेव ओवन में जेल समाधान के superheating से बचने के लिए सावधान रहें । बीच में झटकों के साथ लघु ताप समय अंतराल बेहतर कर रहे हैं ।
  2. अनुमापन और अंशांकन कुओं को तैयार करने के लिए, पहले २ १० एमएल जेल स्टॉक aliquots को मिलाकर ७५ डिग्री सेल्सियस पर पिघला ।
    1. प्रत्येक प्रतियोगी (n = प्रतियोगी अनुक्रम की संख्या) के लिए २४० µ l (20% उपरि सहित) का उपयोग करें ।
    2. एक समान तापमान और दोनों जैल के चिपचिपापन को सुनिश्चित करने के लिए एनबी अंशांकन के लिए जेल की एक ही मात्रा का उपयोग करें ।
    3. फिर ३५ डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान सेट और equilibrate करने के लिए तापमान के लिए प्रतीक्षा करें ।
  3. अनुमापन कुओं के लिए, जोड़ें १.४ एनएम (अंतिम एकाग्रता) संकर संदर्भ डीएनए (3 चरण में प्राप्त), TF प्रोटीन (अंतिम एकाग्रता सीTF = 20-60 एनएम, २.६ चरण में निर्धारित के रूप में), डीटीटी (०.२ mM), और बाइंडिंग बफर n x २०० µ l या n x 13 µ l की कुल मात्रा में एक ९६ -या ३८४-खैर प्लेट प्रारूप, क्रमशः (प्लस उपरि) । पलटने से अच्छी तरह से मिश्रण/मिलाते (भंवर नहीं है) ।
  4. धीरे से जोड़ें २०० µ एल अच्छी तरह से ९६ में अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप (13 µ एल/३८६ कुओं के लिए) जेल समाधान अनुमापन वेल्स वेल प्लेट में पिछले चरण में तैयार की ।
  5. अंशांकन कुओं के लिए, पहले कुओं के बाहर पिघल जेल के लिए 5 एनएम एनबी जोड़ने (कुल मात्रा में अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप के आधार पर इस्तेमाल किया और अंशांकन कुओं की संख्या पर निर्भर करता है; आमतौर पर 5-6 प्रति कुआं प्लेट पर्याप्त है) ।
  6. पिपेट २०० µ एल (13 µ एल के लिए ३८४-खैर प्लेट प्रारूप) एनबी युक्त जेल धीरे से अच्छी तरह से थाली के अनुमापन कुओं के भीतर और हवा के बुलबुले से बचने के लिए सुनिश्चित करें ।
    नोट: इलेक्ट्रॉनिक pipets या रोबोटिक का उपयोग reproducibility को काफी बढ़ाता है ।
  7. जेल आरटी में 10 मिनट के लिए जमना, और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक और 10 मिनट (यदि आवश्यक हो तो बाद में कांच से संघनित्र को हटा दें) । सजातीय जेल सतहों से बचने के लिए एक पूरी तरह से क्षैतिज सतह पर इन सभी चरणों का संचालन करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    नोट: प्रोटीन युक्त जैल आम तौर पर 4 डिग्री सेल्सियस से कम कई घंटे के लिए स्थिर हैं ।

5. प्रतियोगी डीएनए समाधान जोड़ना

नोट: निम्नलिखित समाधान अनुमापन शुरू करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए और अंशांकन और अनुमापन कुओं के शीर्ष पर एक साथ जोड़ रहे हैं ।

  1. annealed जोड़ें संदर्भ डीएनए और 3x बाध्यकारी बफर में प्रोटीन 3 गुना अधिक सांद्रता पर जेल स्टॉक aliquots से ।
    1. एक annealed प्रतियोगी डीएनए समाधान के ४० µ एल के साथ प्राप्त समाधान के 20 µ एल मिश्रण चरण 3 में प्राप्त की ।
    2. प्रत्येक अंशांकन के लिए अच्छी तरह से, annealed प्रतियोगी डीएनए के ४० µ एल के साथ 15 मिमी एनबी समाधान युक्त 3x बाध्यकारी बफर के 20 µ एल मिश्रण (एक ही लंबाई के किसी भी अनुक्रम उपयुक्त है) ।
      नोट: ३८४-well प्लेट्स के लिए, कुल में ६० µ l के बजाय 21 µ l का उपयोग करें ।
  2. वैकल्पिक रूप से, ३८० एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा प्लेट spectroscopically के विभिंन कुओं में जेल ऊंचाई के स्तर की एकरूपता की जांच, एक बहु अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग कर (अवशोषक मूल्यों जेल हाइट्स करने के लिए आनुपातिक हैं) ।
  3. मिश्रित प्रतियोगी डीएनए समाधान (annealed चरण 3 में) जैल के शीर्ष पर ५० µ l (7 µ l के लिए ३८४-well प्लेट स्वरूप) जोड़ें । इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल pipets या एक ९६-चैनल pipetting head का उपयोग कर, यदि उपलब्ध हो तो सभी प्रतिस्पर्धी समाधानों को एक साथ यथासंभव जोड़ने का प्रयास करें । प्रतियोगी समाधान के अलावा, माइक्रोस्कोप मंच पर थाली जगह और तुरंत माप शुरू (7 कदम).

6. छवि अधिग्रहण

  1. क्रमिक रूप से z-पोट की टाइंस श्रृंखला प्राप्त (उदाहरण के लिए, 12 विमानों का उपयोग करें और रोशनी समय के 100-300 ms) । छवियों को भी अच्छी तरह से सतह के पास लेने से बचें (< ~ १.४ µm के साथ इस्तेमाल किया प्लेटों के साथ) किसी भी ध्रुवीकरण पूर्वाग्रह को बाहर करने के लिए ।
  2. TF से लेबल संदर्भ डीएनए की पूरी अनबाइंडिंग जब तक माप के 10-25 चक्र प्रदर्शन । 1-2 h के बाद समापन बिंदु आमतौर पर पहुंच जाता है बाइंडिंग कैनेटीक्स और diffusivity प्रतिस्पर्धी डीएनए के आधार पर ।

7. कच्चे डेटा से एफए (जेड, टी) का निष्कर्षण

  1. एक बार एक अच्छी तरह से थाली, छवि की गई है कच्चे प्रतिदीप्ति छवियों से गणना समानांतर के लिए ब्याज की क्षेत्रों की औसत पिक्सेल मूल्यों (मैं=) और सीधा (i+) ध्रुवीकरण तीव्रता घटकों (1 चित्रासी) । यह स्वचालित रूप से हिप-एफए सॉफ्टवेयर23का उपयोग किया जा सकता है ।
    नोट: हिप-एफए सॉफ्टवेयर, एक अनुदेश मैनुअल, और एक परीक्षण डेटासेट23डाउनलोड किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, किसी भी अंय कस्टम का उपयोग करें-सॉफ्टवेयर लिखा निकालने के लिए मैं= और मैं+ और अनुमापन घटता के बहाव के विश्लेषण प्रदर्शन, के रूप में नीचे विस्तार से वर्णित है ।
  2. एक अच्छी तरह के लिए एफए की गणना । प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से, स्क्रिप्ट की गणना एफए (जेड, टी) प्रत्येक जेड में स्थिति और समय बिंदु टी के अनुसार:
    समीकरण 1:Equation 1
    जहां जी साधन जी कारक है कि सीधा चैनल की ओर किसी भी पूर्वाग्रह के लिए सही है ।
  3. ज्ञात anisotropy की एक फ्लोरोसेंट डाई युक्त किसी भी समाधान के एफए को मापने के द्वारा सूक्ष्म सेटअप के जी कारक का निर्धारण । संकेत के दो ध्रुवीकरण घटकों निकालें और फिर समीकरण 1 का उपयोग करें जी प्राप्त करने के लिए , समाधान के एफए जानने (g = १.१५ इस सेटअप में) ।

8. एफएएनबी से प्रतियोगी डीएनए एकाग्रता के निर्धारण के लिए अंशांकन वक्र

  1. एक आगे और रिवर्स संदर्भ oligomer के १२० µ एल (१०० mM स्टॉक एकाग्रता; प्रतियोगी अनुक्रम के रूप में एक ही लंबाई के साथ किसी भी यादृच्छिक अनुक्रम) और 3x (15 एनएम) से युक्त है, जबकि १२० µ एल के साथ मिश्रण का उपयोग किया जा सकता है ।
  2. कुल में 6 कमजोर पड़ने के साथ 1x बाइंडिंग बफर में 1:2 कमजोर पड़ने के साथ एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला तैयार करें । triplicates में नायब के 5 एनएम युक्त 1x बाइंडिंग बफर में ०.५% कम पिघल बिंदु agarose (T > ३५ ° c) जेल के २०० µ एल के साथ इन कमजोर पड़ने के ५० µ एल मिश्रण ।
  3. एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट में पिछले कदम में तैयार 6 समाधान में से प्रत्येक के २०० µ एल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए थाली की दुकान को पूरा जमाना सुनिश्चित करने के लिए, तो 1 आरटी पर ज । हिप-एफए सेटअप का उपयोग करके समाधानों के एफएएनबी उपाय ।
  4. एफएएनबी (जेड, टी) पिछले कदम के अनुसार निकालें और एक पहाड़ी समीकरण का उपयोग कर डेटा फिट:
    समीकरण 2:Equation 2
    जहां सीडीएनए डीएनए oligomer की एकाग्रता है; कश्मीर की एकाग्रता डीएनए oligomers पर बाध्यकारी स्थलों में से आधे पर कब्जा कर रहे हैं; एफएमैक्स एक सामान्यता लगातार है; और n पहाड़ी गुणांक है । कश्मीर, एफएमैक्स, और एन फिटिंग प्रक्रिया के दौरान मुक्त मापदंडों के रूप में सेट कर रहे हैं ।
  5. तीन हिप-एफए सॉफ्टवेयर में फिटिंग प्रक्रिया से प्राप्त मापदंडों (बाएं निचले पैनल में) दर्ज करें ।
  6. अंशांकन वक्र के संकल्प हर कुछ महीने या माइक्रोस्कोपी सेटअप में परिवर्तन करने के बाद दोहराएँ ।

9. प्रतियोगी डीएनए सांद्रता का निर्धारण

  1. एफएएनबी(जेड, टी ) माप (चित्रा 3) से सी (जेड, टी) निकालने के लिए हिप-एफए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । पहले पिछले अनुभाग में वर्णित के रूप में अंशांकन वक्र प्राप्त करें और सॉफ्टवेयर के लिए फिटिंग मापदंडों में प्रवेश (विवरण के लिए मैनुअल देखें) ।
  2. प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए स्वचालित रूप से सी < १०० एनएम के लिए ( z, t) एक्सट्रपलेशन (विवरण के लिए मैनुअल देखें) 3 समीकरण का उपयोग (चित्रा 3), जो एक agarose जेल मैट्रिक्स के भीतर प्रतियोगी डीएनए के आयामी प्रसार का वर्णन है, संभालने नि: शुल्क प्रसार ।
    समीकरण 3:Equation 3
    कहां सी0 प्रतियोगी डीएनए की प्रारंभिक एकाग्रता है; erf त्रुटि समारोह है; z की स्थिति है; D प्रतियोगी डीएनए के प्रसार गुणांक है; और टी0 माप का प्रारंभिक समय है । नि: शुल्क मापदंडों का इस्तेमाल सी0 और जेड/Equation 4

10. बहुत मजबूत डीएनए बाध्यकारी के लिए हिप-एफए के साथ पारंपरिक प्रतिस्पर्धी अनुमापन

  1. प्रश्नपत्र की सांद्रता में एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट (या ३८४ अच्छी प्लेट) की पंक्तियों में विभिंन प्रतियोगी डीएनए oligomers पतला: 0, १.२५, ३.५, 9, 19, ४५, ९०, १९०, ४२५, ९००, १९००, और ४००० एनएम । Cy5-लेबल संदर्भ डीएनए (1 एनएम) और TF (20-50 एनएम) एक स्थिर एकाग्रता में जोड़ें २०० µ एल की कुल मात्रा के साथ अच्छी तरह से बाध्यकारी बफर में (चित्रा 5) । ४० मिनट रुको जब तक ऊष्मा संतुलन हासिल की है और (हिप-एफए सेटअप के साथ) z-प्रत्येक अच्छी तरह से (कई छवियों को प्राप्त करने के लिए ढेर की गणना एफए मूल्यों औसत द्वारा परिवर्तनशीलता कम कर देता है) ।
  2. निर्माण संतुलन बाध्यकारी अनुमापन curves और उंहें 4 समीकरण के साथ फिट (चित्रा 5बी) । कश्मीरडीएस द्वारा निर्धारित पारंपरिक प्रतिस्पर्धी अनुमापन हिप द्वारा प्राप्त उन लोगों के समान हैं-एफए एक agarose जेल मैट्रिक्स का उपयोग कर20.

11. एफए अनुमापन curves की फिटिंग प्रक्रिया

  1. हिप-एफए सॉफ्टवेयर में प्रदर्शन व्यक्तिगत प्रतियोगी के लिए खंगाला अनुमापन curves एफए (जेड, टी) = एफ [सी (जेड, टी)] और नेत्रहीन डेटा गुणवत्ता की जांच (विवरण के लिए मैनुअल देखें) । यदि आवश्यक हो, तो चरण 10 में प्रतिस्पर्धी डीएनए सांद्रता के निर्धारण के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर्स को परिष्कृत करें ।
  2. प्रत्येक व्यक्ति अनुमापन वक्र स्वचालित रूप से समीकरण 4, जो प्रतिस्पर्धी अनुमापन24परख के लिए एक विश्लेषणात्मक समाधान देता है का उपयोग कर फिट बैठते हैं ।
    समीकरण 4:Equation 5
    साथ:Equation 6
    Equation 7
    Equation 8
    Equation 9
    जहां आरटी प्रोटीन एकाग्रता है; एलटी अनलेबल है और एलसेंट लेबल डीएनए एकाग्रता है; KD2 निर्धारित किया जा करने के लिए पृथक्करण स्थिरांक है; आरटी सक्रिय प्रोटीन की एकाग्रता है; और A और B सामांयीकरण पैरामीटर हैं ।

    पहले कश्मीरD1, जो अलग कश्मीरD2 मूल्यों के निर्धारण के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है निर्धारित करते हैं । कश्मीरD1 है आसानी से निर्धारित किया जा सकता है लेबल के अनुक्रम के रूप में डाई संदर्भ का चयन करके डीएनए के अनुक्रम को चुन कर (देखें मैनुअल) ।
  3. सॉफ्टवेयर में kD1 का मान दर्ज करें और प्लेट पर सभी प्रतिस्पर्धी डीएनए के लिए kD2 मान की गणना ।
    नोट: फिटिंग प्रक्रिया के मुक्त मापदंडों KD2, आरटी, ए, और बी हैं ।
  4. सॉफ्टवेयर में "निर्यात" बटन पर क्लिक करके पृथक्करण लगातार कश्मीरD2 और प्लेट के सभी व्यक्तिगत अनुमापन कुओं के लिए सक्रिय प्रोटीन आरटी की एकाग्रता का निर्यात करें ।

12. PWM निर्माण, प्रोटीन की विशिष्टता-डीएनए संपर्क, और छद्म मायने रखता है

पहले20वर्णित के रूप में ऑनलाइन उपकरण WebLogo ३.० (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) का उपयोग कर विभिंन PWMs के लिए अनुक्रम लोगो बनाएं ।

Representative Results

हम पर लागू हिप-एफए के खंड जीन नेटवर्क25,26, जो पूर्वकाल Drosophila भ्रूण के पीछे शरीर पैटर्न, मोटे तौर पर transcriptional विनियमन के माध्यम से उत्पंन करता है । इस नेटवर्क से, हम एक विस्तृत विश्लेषण (चित्रा 4) के लिए bZIP डोमेन TF विशाल (Gt) चुना है । पूर्ण लंबाई प्रतिलेखन कारकों के बाद से व्यक्त करने के लिए मुश्किल हैं और उनके डीएनए बंधन डोमेन (DBD)13के रूप में ज्यादातर एक ही बाध्यकारी वरीयताओं उपज, हम जीएसटी से जुड़े DBD इस्तेमाल किया और ई. कोलाई GST फ्यूजन प्रोटीन में निर्माण व्यक्त करने के लिए 20अकेले DBDs के रूप में एक ही परिणाम उद्धार ।

जीटी आम सहमति अनुक्रम (एकTTACGTAAसी) सबसे मजबूत बाध्यकारी अनुक्रम है कि हम निर्धारित के रूप में ऊपर वर्णित का प्रतिनिधित्व करता है । हम तो 10-मेर जीटी आम सहमति अनुक्रम के भीतर सभी संभव एकल बिंदु उत्परिवर्तन के बंधन ऊर्जा पर प्रभाव की जांच (30 की कुल), ' 5 और 3 ' समाप्त होता है पर अतिरिक्त आधारों द्वारा पार्श्व । हम मापा दो जिसकी जेल नमूने स्वचालन का उपयोग कर उत्पादित किया गया था प्रतिकृति, और एक अतिरिक्त की तुलना के लिए मैंयुअल रूप से उत्पादन की प्रतिकृति । कश्मीरडीएस ०.६ से लेकर > २००० एनएम के लिए गाते हुए क्रम में रूपांतरित दृश्यों के लिए, और हम भी एक "गैर बाध्यकारी" अनुक्रम (नहीं दिखाया डेटा के लिए बाध्यकारी की पूरी कमी की पुष्टि की) ।

TF-डीएनए बाइंडिंग विशिष्टता आमतौर पर एक स्थिति वजन मैट्रिक्स (PWM), जिसमें एक स्कोर बाध्यकारी आकृति में प्रत्येक स्थिति में प्रत्येक संभव न्यूक्लियोटाइड को सौंपा है का उपयोग कर मॉडलिंग कर रहे हैं । PWM मानता है कि प्रत्येक स्थिति स्वतंत्र रूप से शक्ति बाध्यकारी करने के लिए योगदान देता है और ज्यादातर मामलों में TF बाइंडिंग प्राथमिकताएं27के लिए एक पर्याप्त मॉडल का गठन । हम हमारे संबंध माप के आधार पर संशोधित PWMs की स्थापना की प्रक्रिया28,29 के बाद उत्पंन और दो उंहें पहले साहित्य में रिपोर्ट PWMs की तुलना में । पहली न्यूक्लियोटाइड आवृत्ति पर आधारित है डीएनए4,5, और दूसरी PWM द्वारा की पहचान की बंधन साइटों से गणना बैक्टीरियल एक संकर (B1H) चयन द्वारा प्राप्त किया गया था । 15

तीन के लिए PWMs की उच्च समानता प्रतिकृति (चित्रा 4, ऊपरी पैनल), नमूना मैन्युअल रूप से तैयार (3 दोहराने) के लिए सहित, हिप-एफए विधि के उच्च reproducibility को दर्शाता है. जबकि कूल्हे द्वारा प्राप्त PWMs-एफए अंय तरीकों के साथ प्राप्त PWMs के समान समग्र रहे है (4 चित्रा, निचले पैनल), वहां महत्वपूर्ण विचलन रहे हैं: 2 की स्थिति (काला तीर), कोर bZIP आकृति, उत्परिवर्तनों टी > (जी, सी, ए) के शुरू करने के लिए नेतृत्व हिप-एफए, जो B1H आकृति के अनुरूप है, लेकिन नहीं है कि DNase पदचिह्न के साथ प्राप्त है, जिसमें बाध्यकारी कुर्सियां (जी, ए) के लिए अपेक्षाकृत मजबूत रहता है के साथ संगत है द्वारा प्राप्त आकृति में बाध्यकारी का पूरा नुकसान । इसके विपरीत, 7 की स्थिति पर (ग्रे तीर), उत्परिवर्तन टी > सी क्या पहले मापा PWMs के आधार पर की उंमीद थी की तुलना में बहुत मजबूत बाध्यकारी होता है ।

अन्य विचलन subtler हैं लेकिन कोई कम महत्वपूर्ण नहीं है । कुल मिलाकर, हिप एफए PWM अन्य दो से कम विशिष्ट है, तथ्य यह है कि आम सहमति से कई उत्परिवर्तनों अभी भी मामूली मजबूत बंधन में परिणाम को दर्शाती है. यह सूचना सामग्री (आईसी) का उपयोग कर quantified जा सकता है । आईसी हिप-एफए मैट्रिक्स के लिए ११.५ बिट्स है (तीन दोहराने की औसत), आईसी की तुलना में = १३.४ बिट्स और १६.८ बिट्स के लिए DNase पदचिह्न और B1H मैट्रिक्स, क्रमशः । आम तौर पर (हालांकि सार्वभौमिक नहीं), हिप-एफए द्वारा प्राप्त PWMs अंय तरीकों से प्राप्त की तुलना में कम विशिष्ट हैं, पर आधारित 26 TFs20जांच की ।

Figure 1
चित्रा 1:हिप-एफए परख और प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध चित्रण। (क) एकल कुओं में titrating प्रतियोगी डीएनए के लिए जेल डिलिवरी प्रणाली. (ख) हिप-एफए माइक्रोस्कोपी सेटअप । एक EM-सीसीडी कैमरा पर प्रतिदीप्ति प्रकाश का पता लगाने के साथ अनुकूलित स्वचालित widefield माइक्रोस्कोप । (ग) के लिए समानांतर (लाल) और सीधा (हरा) ध्रुवीय घटकों का निर्धारण करते थे ब्याज के दो क्षेत्रों के साथ रॉ प्रतिदीप्ति छवि । (घ) एक ९६-अच्छी तरह से थाली के ठेठ लेआउट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : कच्चे एफए डेटा और खंगाला अनुमापन घटता । (क) विशिष्ट एफए (जेड, टी) एक अंशांकन अच्छी तरह से युक्त के लिए पथ । (ख, ग) एफए (जेड, टी) दो अनुमापन कुओं के लिए समय पथ एक मजबूत (ख) और अधिक उदारवादी (सी) डीएनए बाध्यकारी प्रतियोगी के लिए बाध्यकारी मापने । (डी, ई) इसी को खंगाला एफए अनुमापन माप और मजबूत के लिए फिट घटता (डी) और मध्यम (e) बाध्यकारी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्रतियोगी डीएनए सी (जेड, टी) नील नीली (एनबी) का उपयोग कर की एकाग्रता का निर्धारण । (क) 16 आधार जोड़े डीएनए oligomers के लिए एफए-एकाग्रता अंशांकन वक्र । एक पारंपरिक अनुमापन श्रृंखला में, एनबी agarose जेल में प्रतियोगी डीएनए के विभिंन सांद्रता के साथ एक साथ एंबेडेड है । डीएनए के लिए एनबी के संबध अनुक्रम-स्वतंत्र20; इसलिए, एक ही अंशांकन घटता एक ही लंबाई के विभिन्न डीएनए दृश्यों के लिए सी (जेड, टी) का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । (ख) एक मनमाना z ऊंचाई पर प्रतियोगी डीएनए समय प्रसार प्रोफ़ाइल पांच अंशांकन कुओं का उपयोग कर निर्धारित किया है । प्रत्येक माप चक्र के लिए, चार एनबी-युक्त कुओं की औसत फास सफेद डॉट्स के रूप में प्रदर्शित होते हैं । घटता समीकरण 3 (सफेद रेखा, रंग में व्यक्तिगत कुओं) और कम सांद्रता (सी < ~ १०० एनएम) पर सी (जेड, टी) का उपयोग कर फिट है extrapolated फिटिंग वक्र द्वारा निर्धारित किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : bZIP डोमेन परिवार TF विशाल (Gt) के बंधन विशिष्टता । हिप-एफए PWMs तीन की प्रतिकृति: दो स्वचालन का उपयोग कर तैयार है और एक मैंयुअल रूप से तैयार (ऊपरी पैनल) DNase पदचिह्न द्वारा उत्पंन PWMs के साथ तुलना कर रहे है और जीवाणु एक-संकर (B1H) चयन विधि (कम पैनल) । कुल मिलाकर, हिप-एफए बाध्यकारी रूपांकनों पिछले डेटा के साथ सहमत हैं, लेकिन यह भी महत्वपूर्ण अंतर दिखा, के रूप में काले और भूरे रंग के तीर के साथ प्रकाश डाला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : हिप-एफए के साथ पारंपरिक प्रतिस्पर्धी अनुमापन । (क) प्लेट डिजाइन 8 अलग प्रतियोगी एक ९६-अच्छी तरह से थाली की एक एकल पंक्ति में सीरियल बाइंडिंग बफ़र में पतला डीएनए से पता चलता है । एक एफए हीट मानचित्र अलग मनमाना बाध्यकारी शक्तियों के लिए दिखाया गया है । (ख) तीन प्रतियोगी के प्रतिस्पर्धी अनुमापन Bcd TF के विभिन्न समानताएं के साथ बाध्यकारी DNAs । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

हिप-एफए TF-डीएनए बातचीत के बंधन वरीयता परिदृश्य का निर्धारण करने के लिए एक व्यापक नई विधि है । यह उत्परिवर्तन डीएनए आकृति वेरिएंट के समानताएं बाध्यकारी उपाय सीधे, किसी भी अंतर्निहित धारणा है कि बंधन वरीयताओं को ऊपर के एक सेट में न्यूक्लियोटाइड घटना की आवृत्ति दहलीज bindings में प्रतिबिंबित से परहेज कर रहे हैं । माप स्थिरीकरण और यांत्रिक या बाध्यकारी प्रतिक्रिया के साथ रासायनिक हस्तक्षेप के बिना समाधान में जगह लेता है, approximating संतुलन की स्थिति के रूप में निकटता के रूप में संभव है । नियंत्रित वितरण प्रणाली एक अच्छी तरह के भीतर एक पूर्ण अनुमापन वक्र की माप परमिट और प्रवाह और विश्वसनीयता दोनों बढ़ जाती है, जबकि प्रोटीन की बचत । एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर और EM-एक उच्च प्रकाश संग्रह क्षमता के साथ सीसीडी कैमरा के साथ एक उद्देश्य का उपयोग अत्यधिक संवेदनशील फ्लोरोसेंट रोशनी का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । इसलिए, इस स्थापना के साथ, कम के रूप में छोटे एफए परिवर्तन के रूप में 10-15 सांसद सही पाया जा सकता है; व्यवहार में, इसका मतलब यह है कि किसी भी बाध्यकारी प्रतिक्रिया जिसके लिए बाध्यकारी के बाद जन वृद्धि कम है (के रूप में 2 के एक बड़े पैमाने पर अनुपात के रूप में कम) आसानी से पता चला है । यह आमतौर पर microplate पाठकों की तरह वाणिज्यिक प्रणालियों के साथ मामला नहीं है । अपनी उच्च संवेदनशीलता के कारण, हिप-एफए पृथक्करण स्थिरांक है कि picomolar रेंज में मज़बूती से मापा जा सकता है की सीमा फैली हुई है । बाध्यकारी ऊर्जा सही परिमाण के कई आदेशों पर निर्धारित कर रहे हैं ।

संशोधित PWMs की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, हम विश्लेषण के दो प्रकार के20प्रदर्शन किया । हम परीक्षण, विभाजन जीन नेटवर्क के पांच कारकों के लिए, कितनी अच्छी तरह अलग PWMs 21 फॉल्ट जीन के जीनोमिक क्षेत्रों में प्रायोगिक चिप seq प्रोफाइल की भविष्यवाणी कर सकते हैं । एक दूसरे परीक्षण के रूप में, हम एक अनुक्रम के लिए अभिव्यक्ति मॉडल4 कि बाध्यकारी वरीयता और भाग लेने वाले TFs के प्रोटीन एकाग्रता के आधार पर विभाजन बढ़ाने के अभिव्यक्ति पैटर्न भविष्यवाणी का इस्तेमाल किया । दोनों अभ्यास में, हमने पाया कि कम विशिष्ट हिप-एफए PWMs अधिक विशिष्ट पदचिह्न और B1H PWMs20से काफी बेहतर प्रदर्शन करते हैं ।

डी नोवो तरीकों के विपरीत, हिप-एफए एक दिया TF बाइंडिंग वरीयता के कुछ पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है । हालांकि, आम सहमति दृश्यों कई TFs के लिए जाना जाता है, और कई मौजूदा तरीकों उंहें13,14,15आपूर्ति कर सकते हैं । यदि आवश्यक हो, तो सही इष्टतम बाइंडिंग अनुक्रम iteratively पाया जा सकता है ।

हम डीएनए संदर्भ oligomers फ्लोरोसेंट Cy5 और Bodipy-६५० के साथ लेबल का इस्तेमाल किया । इन रंगों के लिए बाध्य और असीम बला-संदर्भ डीएनए के anisotropy के बाद से एफए माप के लिए अच्छी तरह से प्रदर्शन करने के लिए साबित कर दिया है अलग परीक्षण रंजक के बीच सबसे बड़ा थे । यह एफए मूल्यों के लिए एक अधिकतम गतिशील सीमा सुनिश्चित करता है । आम तौर पर, एक प्रतिदीप्ति लाइफटाइम ≥ 1 एन एस के साथ किसी भी फ्लोरोसेंट डाई के लिए उपयुक्त होने की संभावना है, लेकिन पहले परीक्षण की जरूरत है । यदि संभव हो, तो प्रोटीन autofluorescence को कम करने के लिए निकट-IR रेंज में रंजक fluorescing का उपयोग करने की सलाह दी जाती है ।

प्रयोगात्मक प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम अच्छी तरह से प्लेटों में जेल के pipetting है । गुड reproducibility जेल संस्करणों के रूप में संभव के रूप में वर्दी के लिए की आवश्यकता है । जेल ऊंचाई में परिवर्तन प्रतियोगी डीएनए oligomer के लिए diffusivity के परिवर्तन में अनुवाद कर रहे हैं, और इस प्रकार संबध के स्पष्ट परिवर्तन में जब डेटा का मूल्यांकन । यह एक तकनीकी प्रतिकृति में प्रसरण का मुख्य स्रोत है । एक इलेक्ट्रॉनिक प्लास्टिक या स्वचालन तकनीक का उपयोग reproducibility में सुधार । जेल के भीतर हवा के बुलबुले धीमी और सावधान pipetting से बचा जा सकता है । यह भी अनुमापन वेल्स के शीर्ष पर सभी प्रतियोगी समाधान के रूप में कम संभव के रूप में थोड़ा देरी के साथ जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है । सबसे अच्छा reproducibility के लिए, पूरी प्रक्रिया गर्मी मशीन के साथ एक pipetting रोबोट का उपयोग कर स्वचालित किया जा सकता है । स्वचालन के लिए प्रोटोकॉल स्थानांतरित करने के लिए एक महत्वपूर्ण हिस्सा है मशीन तापमान और गर्मी के समय के लिए आवश्यक अनुकूलन है । सुनिश्चित करें कि जेल की चिपचिपाहट के बीच एक इष्टतम संतुलन मिल (यानी, नहीं भी ठंडा) और प्रोटीन की स्थिरता (यानी, बहुत गर्म नहीं) । यह कुओं और उपयोग प्रोटीन की स्थिरता में जैल के वितरण की गति पर दोनों निर्भर करता है ।

हिप-एफए प्रतिस्पर्धी डीएनए oligomers के लिए एक नियंत्रित वितरण प्रणाली का उपयोग करता है । titrations curves का निर्माण करने के लिए, यह प्रतिस्पर्धी डीएनए एकाग्रता c (जेड, टी) प्रत्येक दी जेडजेल मैट्रिक्स और टाइम पॉइंट टीके भीतर स्थिति के लिए निर्धारित करने के लिए आवश्यक है यह एक महत्वपूर्ण कदम है, के बाद से कश्मीरडी एस के निर्धारण सीधे सी पर निर्भर करता है (जेड, टी)। अंशांकन डीएनए एकाग्रता के लिए एक संवेदक के रूप में एनबी डाई युक्त कुओं इस प्रयोजन के लिए उपयोग किया जाता है (चित्रा 1डी, चित्रा 2) । आमतौर पर, प्लेट प्रति एनबी युक्त 3-5 अंशांकन कुओं पर्याप्त हैं । किसी भी हिप-एफए प्रयोग के मूल्यांकन से पहले, एक नायब अंशांकन वक्र अलग सांद्रता पर किसी भी अनुक्रम के एक प्रतियोगी डीएनए के साथ agarose जेल में एक नायब भंग की एक पारंपरिक अनुमापन श्रृंखला प्रदर्शन द्वारा सेट अप के लिए निर्माण किया जाना चाहिए (चित्रा 3 a), जैसा चरण 8 में विस्तार से बताया गया है । बहुत मजबूत बंधन के मामले में (KD < ५०० pM), प्रतिस्पर्धी डीएनए की कम सांद्रता के निर्धारण के लिए इस्तेमाल एक्सट्रपलेशन सीमित हो जाता है, क्योंकि यह एक सीधा माप की तुलना में कम सटीक है । हालांकि, ऐसे कम कश्मीरडीएस के साथ TFs के लिए, हिप-एफए सेटअप एक agarose जेल मैट्रिक्स (चित्रा 5) के उपयोग के बिना बाध्यकारी बफर में एक पारंपरिक प्रतिस्पर्धी अनुमापन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक प्रतियोगी डीएनए के 12 विभिंन सांद्रता के साथ एक पूर्ण अनुमापन एक ९६-अच्छी तरह से थाली की एक पंक्ति में किया जा सकता है ।

नियंत्रण वितरण प्रणाली भी तेजी से TF-डीएनए बाध्यकारी कैनेटीक्स और स्थिर प्रोटीन की आवश्यकता है, हालांकि प्रसार के बाद agarose जेल गतिशील (हालांकि धीमी गति से) है । दोनों संपत्तियों का पालन सीधे कूल्हे से एफए सेटअप के साथ परीक्षण किया जा सकता है, समय के साथ, ब्याज की TFs के एफए जब उनके संबंधित फ्लोरोसेंट लेबल संदर्भ डीएनए के लिए बाध्य । हम कश्मीरपर और जांच कारकों के लिएदूर कश्मीर मापा और उंहें20सेकंड के लिए मिलीसेकंड के आदेश पर हो पाया, के अनुसार अंय30अध्ययन के साथ । यह पर्याप्त है कि माप सुनिश्चित करने के लिए तेजी से संतुलन में जगह ले रहा है । धीमी कैनेटीक्स के साथ अन्य बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं के मामले में, प्रतिस्पर्धी के diffusivity अपनी एकाग्रता को कम करने या जेल ताकना आकार को कम करने के द्वारा देखते किया जा सकता है । परीक्षण TFs के मामले में, जो सभी तेजी से टी (~ सेकंड), के बारे में 1-2 एच के एक कुल माप समय प्रत्येक माप में ऊष्मा संतुलन सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है ।

एक अंय संभावित प्रोटीन से संबंधित मुद्दे को प्रोटीन समुच्चय है कि एफए माप बदल सकता है के गठन है । विभिन्न additives (जैसे tensides) युक्त अन्य बफर स्थितियों का उपयोग समग्र गठन को रोका जा सकता है, यदि आवश्यक हो तो.

हम PWM के रैखिकता धारणा के तहत काम किया है; हालांकि, हिप-एफए आम सहमति अनुक्रम के सभी संभव डि-न्यूक्लियोटाइड उत्परिवर्तनों को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । अंत में, हिप-एफए बाध्यकारी बातचीत के अंय प्रकार के उपाय अनुकूलित किया जा सकता है । शर्त के लिए उपलब्ध है एक उपयुक्त संदर्भ प्रोटीन जो फ्लोरोसेंट लेबल किया जा सकता है से बंधे अणु है । नियंत्रित वितरण प्रणाली के साथ, एक एकाग्रता ढाल ligand के किसी भी प्रकार के लिए उत्पन्न किया जा सकता; इसलिए, प्रोटीन प्रोटीन और दवा प्रोटीन बातचीत इसी तरह उच्च निष्ठा और प्रवाह के साथ मापा जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई विरोध नहीं की घोषणा ।

Acknowledgments

हम सीडीएनए क्लोन और गॉल लैब के सदस्यों के लिए जे म्यूलर धंयवाद, विशेष रूप से एस Bergelt में, बहुमूल्य सलाह और उत्साही चर्चा के लिए । यह काम SFB ६४६, जीनोम अभिव्यक्ति और रखरखाव में विनियामक नेटवर्क (मुख्य ंयायाधीश, पीईबी), एकीकृत प्रोटीन विज्ञान (U.G.) और मात्रात्मक विज्ञान ंयूनिख (M.S.) के लिए स्नातक स्कूल के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था । U.G. ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थन स्वीकार करता है (SFB ६४६, SFB १०६४, CIPSM, QBM), Bundesministerium फर Bildung und Forschung (BMBF: ebio-Innovationswettbewerb Systembiologie), और पीरु फाउंडेशन (अलेक्जेंडर वॉन पीरु, प्रोफेसर) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA

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References

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प्रतिलेखन फैक्टर के उच्च संवेदनशीलता माप-प्रतिस्पर्धी अनुमापन द्वारा डीएनए बाध्यकारी समानताएं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग
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Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).More

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).

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