यहां हम संतुलन में और समाधान में एक बड़े पैमाने पर उच्च संवेदनशीलता के साथ बाध्यकारी समानताएं निर्धारित करने के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत करते हैं । यह प्रतिलेखन कारक का मात्रात्मक विश्लेषण-डीएनए बाइंडिंग में सुधार करता है । विधि एक नियंत्रित वितरण प्रणाली में स्वचालित प्रतिदीप्ति anisotropy माप पर आधारित है ।
प्रतिलेखन फैक्टर के सटीक ठहराव (TF)-डीएनए बातचीत जीन अभिव्यक्ति के विनियमन को समझने के लिए आवश्यक है । महत्वपूर्ण सीमाओं से ग्रस्त मौजूदा दृष्टिकोण के बाद से, हम एक बड़े पैमाने पर उच्च संवेदनशीलता के साथ TF-डीएनए बाइंडिंग समानताएं का निर्धारण करने के लिए एक नई विधि विकसित की है । परख स्थापित प्रतिदीप्ति anisotropy (एफए) सिद्धांत पर निर्भर करता है, लेकिन महत्वपूर्ण तकनीकी सुधार का परिचय । सबसे पहले, हम एक एकल अच्छी तरह से TF और एक खुली agarose जेल मैट्रिक्स में एक फ्लोरोसेंट लेबल संदर्भ डीएनए में शामिल करके एक पूर्ण एफए प्रतिस्पर्धी अनुमापन वक्र उपाय । unlabel्ड डीएनए oligomer एक प्रतियोगी के रूप में शीर्ष पर भरी हुई है और, प्रसार के माध्यम से, एक spatio-लौकिक ढाल रूपों । जिसके परिणामस्वरूप एफए ढाल तो एक स्वनिर्धारित epifluorescence माइक्रोस्कोप सेटअप का उपयोग कर बाहर पढ़ा है । यह सुधार सेटअप बहुत एफए संकेत का पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ जाती है, दोनों कमजोर और मजबूत बाध्यकारी मज़बूती से quantified, यहां तक कि इसी तरह आणविक भार के अणुओं के लिए अनुमति देता है । इस फैशन में, हम एक बहु अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से एक अनुमापन वक्र उपाय कर सकते हैं, और एक फिटिंग प्रक्रिया के माध्यम से, हम दोनों निरपेक्ष पृथक्करण निरंतर (कश्मीरडी) और सक्रिय प्रोटीन एकाग्रता निकाल सकते हैं । एक दिया आम सहमति बाध्यकारी अनुक्रम के सभी एकल बिंदु उत्परिवर्तन वेरिएंट परीक्षण करके, हम एक TF के पूरे बंधन विशिष्ट परिदृश्य सर्वेक्षण कर सकते हैं, आमतौर पर एक ही थाली पर । जिसके परिणामस्वरूप स्थिति वजन मैट्रिक्स (PWMs) vivo TF अधिभोग में भविष्यवाणी में अंय तरीकों से व्युत्पंन उन मात । यहां, हम एक पारंपरिक स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और डेटा विश्लेषण पाइपलाइन पर हिप-एफए को लागू करने के लिए एक विस्तृत गाइड प्रस्तुत करते हैं ।
लेखन कारकों की केंद्रीय भूमिका को देखते हुए जीन विनियमन में (TFs), एक मात्रात्मक तरीके से अपने बाध्यकारी वरीयताओं का निर्धारण सर्वोपरि महत्व का है । Hippel द्वारा प्राथमिक अध्ययन धारणा है कि विनियामक TFs तेजी से डीएनए, ऐसी है कि उनके बाध्यकारी अच्छी तरह से ऊष्मा संतुलन द्वारा वर्णित है पहचान शुरू की, जबकि आरएनए पोलीमरेज़ की भर्ती के बहाव की घटनाओं प्रमोटर द्वारा नियंत्रित कर रहे है धीमी कैनेटीक्स1. vivo बाइंडिंग अध्ययनों में हाल ही में इस चित्र और अधिक जटिल2,3की संभावना है कि सुझाव है; फिर भी, इन सामांय मांयताओं अच्छा संनिकटन के रूप में सेवा और कई गणना दृष्टिकोण का समर्थन किया है सीआईएस नियामक तत्वों को खोजने और अनुक्रम से अभिव्यक्ति की भविष्यवाणी4,5,6। जबकि संतुलन बंधन इस प्रकार सफलतापूर्वक एक अवधारणा के रूप में कार्यरत किया गया है, TF-डीएनए बातचीत का निर्धारण करने के लिए मौजूदा तरीके बंधन विशिष्टता पर ध्यान केंद्रित है और आम तौर पर सीधे संतुलन पर बाध्यकारी समानताएं उपाय नहीं है । TF-डीएनए बाइंडिंग की व्यवस्थित माप एक काफी तकनीकी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है, और मौजूदा तरीकों कई अलग सीमाएं हैं ।
क्रोमेटिन immunoprecipitation गहरी अनुक्रमण (चिप-seq)7, vivo तकनीक में सबसे प्रचलित द्वारा पीछा किया, बाध्यकारी समानताएं या जीनोमिक टुकड़ों के भीतर बाध्यकारी साइटों की सटीक स्थानीयकरण की माप की अनुमति नहीं है । इन विट्रो में कई तरीकों, DNase पदचिह्न8सहित, electrophoretic गतिशीलता पारी (EMSA)9, सतह plasmon अनुनाद (SPR)10, और अतिसूक्ष्म thermophoresis11 के लिए बाध्यकारी समानताएं उपाय करने में सक्षम हैं, लेकिन वे अपेक्षाकृत कम प्रवाह कर रहे हैं । इसके विपरीत, प्रोटीन बाध्यकारी microarrays सहित उच्च प्रवाहतकनीक 12, एचटी-SELEX 13,14, और बैक्टीरियल एक-संकर (B1H)15 बाध्यकारी समानताएं को मापने के लिए सक्षम नहीं हैं और आम तौर पर पीढ़ी की उपज विशिष्ट बाध्यकारी दृश्यों, जो मुख्य रूप से कड़े चयन या धुलाई आवश्यक कदम के कारण है । अधिक हाल के घटनाक्रम गहरे अनुक्रमण आधारित हिट-फ्लिप16, SELEX-seq17, और microfluidics आधारित MITOMI18 या मुस्कुराओ-seq19, जो निरपेक्ष बाध्यकारी समानताएं के निष्कर्षण के लिए अनुमति शामिल हैं; हालांकि, वे लेबल TF और डीएनए के प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने पर भरोसा करते हैं । प्रतिदीप्ति संकेतों, इसलिए, कम प्रोटीन सांद्रता पर सीमित हो जाते है और कम KD मूल्यों (< ~ 10 एनएम) का निर्धारण करने में । इसके अलावा, इन तरीकों में TF-डीएनए बाध्यकारी पतली सतहों पर जगह लेता है, विशिष्ट बाध्यकारी और/या ऑटो-प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि है, जो यह मुश्किल कमजोर बाध्यकारी बढ़ाता है के साथ मुद्दों की स्थापना ।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम संतुलन में और समाधान में TF-डीएनए संबध परिदृश्य का निर्धारण करने के लिए एक नई विधि विकसित की है, जिसे हम उच्च प्रदर्शन प्रतिदीप्ति anisotropy (हिप-एफए)20कहा जाता है । तकनीक की स्थापना की प्रतिदीप्ति anisotropy (एफए)21 परख पर आधारित है, लेकिन उच्च संवेदनशीलता और बड़े पैमाने पर एक स्वनिर्धारित स्वचालित माइक्रोस्कोप और विश्लेषण सेटअप का उपयोग कर के साथ बाध्यकारी स्थिरांक को मापने के लिए संशोधित ।
एफए परख एक बाध्यकारी भागीदार के लिए (एक डीएनए oligomer की तरह) फ्लोरोसेंट लेबल प्रजातियों की बातचीत पर नज़र रखता है, इस मामले में एक TF, लेबल अणु के आणविक रोटेशन को मापने के द्वारा । TF के लिए बाध्य करने पर, अपने रोटेशन की गति उच्च hydrodynamic त्रिज्या और बंधे जटिल है, जो वृद्धि हुई एफए में परिणाम के आणविक वजन के कारण कम हो जाती है । बहुत मजबूत बाध्यकारी (KD < ~ 1 एनएम) का सटीक माप लेबल, संदर्भ डीएनए (सी < ~ 1 एनएम) के कम सांद्रता के उपयोग की आवश्यकता है । इस तरह के एक मानक microplate पाठक के रूप में एक वाणिज्यिक साधन के साथ प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । इसके अलावा, एक बड़े आकार अंतर (10-100) बंधे और असीम परिसरों के बीच आम तौर पर आवश्यक है, TF बाइंडिंग डोमेन और छोटे डीएनए oligomers, जो मोटे तौर पर समान आणविक भार की आम तौर पर कर रहे हैं के बीच बातचीत की माप प्रतिबंधित . अंत में, एक पूर्ण अनुमापन वक्र आम तौर पर तैयारी और कई कुओं की माप titrating प्रजातियों के लिए एक एकाग्रता श्रृंखला युक्त की आवश्यकता है ।
इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, हम एक widefield माइक्रोस्कोपी सेटअप का उपयोग करने के लिए उच्च का पता लगाने संवेदनशीलता को प्राप्त करने और एफए माप की अनुमति अलग z-एक भी अच्छी तरह से पदों । यह हमें समान आणविक वजन की प्रजातियों के बीच और उच्च समानताएं के साथ बाध्यकारी बातचीत पर नजर रखने के लिए सक्षम बनाता है । उच्च प्रवाह बहु में एफए अच्छी तरह से प्लेट प्रारूपों को मापने और एक अच्छी तरह से एक नियंत्रित वितरण प्रणाली का उपयोग कर में एक पूरी अनुमापन श्रृंखला बाहर ले द्वारा हासिल की है (चित्रा 1एक) । इसके अलावा, एक प्रतियोगी बाध्यकारी परख रोजगार के द्वारा, हम न केवल बाध्यकारी स्थिरांक निकालने लेकिन यह भी सक्रिय प्रोटीन की एकाग्रता । यह परख की एक महत्वपूर्ण विशेषता है, के बाद से ही व्यक्त TF अणुओं के एक हिस्से में प्रोटीन का खुलासा या गिरावट के कारण सक्रिय हैं । प्रायोगिक सेटअप XY-और Z-पीजो चरणों से सुसज्जित एक वाणिज्यिक epifluorescence माइक्रोस्कोप पर आधारित है । हम बाहरी लेजर उत्तेजना के साथ प्रणाली का उंनयन किया, तो एक EM के चिप पर दो उत्सर्जित रैखिक ध्रुवीकरण घटकों का पता लगाया-प्रकाश का पता लगाने के लिए उच्च क्वांटम क्षमता के साथ सीसीडी कैमरा (चित्रा 1बी और 1c) । प्रणाली एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) एक अति संवेदनशील संवेदक के लिए युग्मित उद्देश्य का उपयोग करता है और इस तरह अत्यधिक संवेदनशील एफए माप affords । प्रतिदीप्ति z-पोट रिकॉर्डिंग द्वारा, बाध्यकारी बातचीत ऑप्टिकल z-अक्ष के साथ मापा जा सकता है जब reactants के लिए एक विषम मैट्रिक्स का उपयोग कर । इन सभी संशोधनों को आसानी से एक मौजूदा प्रणाली पर लागू किया जा सकता है और लागत प्रभावी रहे हैं ।
हम एक प्रतियोगी बाध्यकारी परख जिसमें एक unlabeld डीएनए oligomer के बंधन संबंध फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए, जो एक संदर्भ के रूप में कार्य करता है की तुलना में मापा जाता है रोजगार । TF और संदर्भ डीएनए एक असुरक्षित agarose जेल मैट्रिक्स (ताकना आकार ~ 1 µm) है कि बाध्यकारी के लिए एक गैर बातचीत पर्यावरण का गठन में तय सांद्रता में शामिल कर रहे हैं । संदर्भ डीएनए Cy5 के साथ लेबल है । इस डाई के लिए अच्छी तरह से एफए अपने अपेक्षाकृत लंबे प्रतिदीप्ति जीवनकाल (~ 1ns) और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन दूर दिखाई स्पेक्ट्रम (कम ऑटो प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि) के कारण माप के लिए अनुकूल साबित हुआ । TF एकाग्रता Cy5-संदर्भ डीएनए पर दाढ़ अतिरिक्त में है, यह सुनिश्चित करना है कि सभी संदर्भ डीएनए प्रोटीन के लिए बाध्य है । अनलेबल्ड प्रतियोगी डीएनए का एक समाधान तो जेल की सतह पर जमा है और छिद्रित मैट्रिक्स के अंदर फैलाना, एक एकाग्रता ढाल सी की स्थापना (जेड, टी) कि zपर परिवर्तन फोकल विमान और समय टी की स्थिति (चित्रा 1अ, चित्रा 2ए-2c). Cy5 संदर्भ डीएनए के लिए बाध्य TF इस प्रकार स्थानीय रूप से प्रतियोगी डीएनए कि बंधन के लिए प्रतिस्पर्धा, Cy5-संदर्भ डीएनए एफएरेफरी(जेड, टी) (चित्रा 2बी के एक गतिशील रूप से बदल एफए के लिए अग्रणी के विभिन्न सांद्रता को उजागर है और 2c).
प्रतियोगी (जेड, टी) एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, हम अलग कुओं (अंशांकन कुओं) में गतिशील रूप से नील नदी नीला (नायब) एफएएनबी(जेड, टी) (चित्रा 2ए और 3) के एफए संकेत बदलने के उपाय । यह डाई डीएनए में intercalates और इस तरह प्रतिस्पर्धी डीएनए के लिए एक डीएनए संवेदक के रूप में कार्य करता है । इस नियंत्रित वितरण प्रणाली के साथ, विभिंन डीएनए के सैकड़ों के लिए दसियों-प्रोटीन बाध्यकारी समानताएं एक बहु के भीतर मापा जा सकता है अच्छी तरह से प्लेट (९६-या ३८४-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप) । माप तब क्रमिक रूप से TF से लेबल संदर्भ डीएनए के पूर्ण विस्थापन तक किया जाता है । हम लंबाई nके आम सहमति अनुक्रम के सभी 3 एन एकल आधार उत्परिवर्तनों के समानताएं को मापने के द्वारा एक दिए गए कारक के लिए बाध्यकारी विशिष्टता निर्धारित हिप-एफए प्रोटीन की कम मात्रा की आवश्यकता है (~ अनुमापन वक्र प्रति pmols) और कश्मीरडीएस के निर्धारण में कम परिवर्तनशीलता से पता चलता है [परिवर्तन (CV) < 20% के गुणांक], जबकि एक अपेक्षाकृत बड़े पैमाने पर माप की अनुमति । विधि मैन्युअल या पूरी तरह से एक रोबोट प्रणाली का उपयोग कर स्वचालित रूप से आयोजित किया जा सकता है, यहां तक कि कम सीवी (चित्रा 4, ऊपरी पैनल) में जिसके परिणामस्वरूप. पृथक्करण स्थिरांक ०.५ एनएम के लिए नीचे उच्च सटीकता के साथ मापा जाता है । अत्यंत उच्च समानताएं (KD < 500pM) के लिए, हम निम्न स्तर (< १०० एनएम) पर प्रतिस्पर्धी डीएनए सांद्रता को मापने में अशुद्धियों के कारण एक मानक प्रतिस्पर्धी अनुमापन (चित्रा 5) का उपयोग करते हैं ।
हिप-एफए लगभग किसी भी मानक, औंधा, epifluorescence फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर लागू किया जा सकता है, एक स्वचालित XY-चरण और एक पीजो z-अक्ष चरण की उपलब्धता प्रदान की है । ऑप्टिकल घटक एक लंबी दूरी के उद्देश्य के साथ सुसज्जित एक स्वचालित widefield सेटअप के आसपास बनाया गया था । व्यवहार में, परख अंय विशेषताओं के साथ उद्देश्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (विशेष रूप से काम कर रहे, दूरी और संख्यात्मक एपर्चर) । हालांकि, इस पैरामीटर ( z-स्लाइस, porosity और agarose जेल, आदिकी ऊंचाई के बीच दूरी) के अनुकूलन की आवश्यकता है । अन्य प्रकार के लेसरों या कैमरे का उपयोग भी संभव है. प्रोटोकॉल अनुभाग में संपूर्ण प्रायोगिक प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण का विस्तृत विवरण नीचे दिया गया है ।
हिप-एफए TF-डीएनए बातचीत के बंधन वरीयता परिदृश्य का निर्धारण करने के लिए एक व्यापक नई विधि है । यह उत्परिवर्तन डीएनए आकृति वेरिएंट के समानताएं बाध्यकारी उपाय सीधे, किसी भी अंतर्निहित धारणा है कि बंधन वरीयताओं को ऊपर के एक सेट में न्यूक्लियोटाइड घटना की आवृत्ति दहलीज bindings में प्रतिबिंबित से परहेज कर रहे हैं । माप स्थिरीकरण और यांत्रिक या बाध्यकारी प्रतिक्रिया के साथ रासायनिक हस्तक्षेप के बिना समाधान में जगह लेता है, approximating संतुलन की स्थिति के रूप में निकटता के रूप में संभव है । नियंत्रित वितरण प्रणाली एक अच्छी तरह के भीतर एक पूर्ण अनुमापन वक्र की माप परमिट और प्रवाह और विश्वसनीयता दोनों बढ़ जाती है, जबकि प्रोटीन की बचत । एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर और EM-एक उच्च प्रकाश संग्रह क्षमता के साथ सीसीडी कैमरा के साथ एक उद्देश्य का उपयोग अत्यधिक संवेदनशील फ्लोरोसेंट रोशनी का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । इसलिए, इस स्थापना के साथ, कम के रूप में छोटे एफए परिवर्तन के रूप में 10-15 सांसद सही पाया जा सकता है; व्यवहार में, इसका मतलब यह है कि किसी भी बाध्यकारी प्रतिक्रिया जिसके लिए बाध्यकारी के बाद जन वृद्धि कम है (के रूप में 2 के एक बड़े पैमाने पर अनुपात के रूप में कम) आसानी से पता चला है । यह आमतौर पर microplate पाठकों की तरह वाणिज्यिक प्रणालियों के साथ मामला नहीं है । अपनी उच्च संवेदनशीलता के कारण, हिप-एफए पृथक्करण स्थिरांक है कि picomolar रेंज में मज़बूती से मापा जा सकता है की सीमा फैली हुई है । बाध्यकारी ऊर्जा सही परिमाण के कई आदेशों पर निर्धारित कर रहे हैं ।
संशोधित PWMs की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, हम विश्लेषण के दो प्रकार के20प्रदर्शन किया । हम परीक्षण, विभाजन जीन नेटवर्क के पांच कारकों के लिए, कितनी अच्छी तरह अलग PWMs 21 फॉल्ट जीन के जीनोमिक क्षेत्रों में प्रायोगिक चिप seq प्रोफाइल की भविष्यवाणी कर सकते हैं । एक दूसरे परीक्षण के रूप में, हम एक अनुक्रम के लिए अभिव्यक्ति मॉडल4 कि बाध्यकारी वरीयता और भाग लेने वाले TFs के प्रोटीन एकाग्रता के आधार पर विभाजन बढ़ाने के अभिव्यक्ति पैटर्न भविष्यवाणी का इस्तेमाल किया । दोनों अभ्यास में, हमने पाया कि कम विशिष्ट हिप-एफए PWMs अधिक विशिष्ट पदचिह्न और B1H PWMs20से काफी बेहतर प्रदर्शन करते हैं ।
डी नोवो तरीकों के विपरीत, हिप-एफए एक दिया TF बाइंडिंग वरीयता के कुछ पूर्व ज्ञान की आवश्यकता है । हालांकि, आम सहमति दृश्यों कई TFs के लिए जाना जाता है, और कई मौजूदा तरीकों उंहें13,14,15आपूर्ति कर सकते हैं । यदि आवश्यक हो, तो सही इष्टतम बाइंडिंग अनुक्रम iteratively पाया जा सकता है ।
हम डीएनए संदर्भ oligomers फ्लोरोसेंट Cy5 और Bodipy-६५० के साथ लेबल का इस्तेमाल किया । इन रंगों के लिए बाध्य और असीम बला-संदर्भ डीएनए के anisotropy के बाद से एफए माप के लिए अच्छी तरह से प्रदर्शन करने के लिए साबित कर दिया है अलग परीक्षण रंजक के बीच सबसे बड़ा थे । यह एफए मूल्यों के लिए एक अधिकतम गतिशील सीमा सुनिश्चित करता है । आम तौर पर, एक प्रतिदीप्ति लाइफटाइम ≥ 1 एन एस के साथ किसी भी फ्लोरोसेंट डाई के लिए उपयुक्त होने की संभावना है, लेकिन पहले परीक्षण की जरूरत है । यदि संभव हो, तो प्रोटीन autofluorescence को कम करने के लिए निकट-IR रेंज में रंजक fluorescing का उपयोग करने की सलाह दी जाती है ।
प्रयोगात्मक प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण कदम अच्छी तरह से प्लेटों में जेल के pipetting है । गुड reproducibility जेल संस्करणों के रूप में संभव के रूप में वर्दी के लिए की आवश्यकता है । जेल ऊंचाई में परिवर्तन प्रतियोगी डीएनए oligomer के लिए diffusivity के परिवर्तन में अनुवाद कर रहे हैं, और इस प्रकार संबध के स्पष्ट परिवर्तन में जब डेटा का मूल्यांकन । यह एक तकनीकी प्रतिकृति में प्रसरण का मुख्य स्रोत है । एक इलेक्ट्रॉनिक प्लास्टिक या स्वचालन तकनीक का उपयोग reproducibility में सुधार । जेल के भीतर हवा के बुलबुले धीमी और सावधान pipetting से बचा जा सकता है । यह भी अनुमापन वेल्स के शीर्ष पर सभी प्रतियोगी समाधान के रूप में कम संभव के रूप में थोड़ा देरी के साथ जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है । सबसे अच्छा reproducibility के लिए, पूरी प्रक्रिया गर्मी मशीन के साथ एक pipetting रोबोट का उपयोग कर स्वचालित किया जा सकता है । स्वचालन के लिए प्रोटोकॉल स्थानांतरित करने के लिए एक महत्वपूर्ण हिस्सा है मशीन तापमान और गर्मी के समय के लिए आवश्यक अनुकूलन है । सुनिश्चित करें कि जेल की चिपचिपाहट के बीच एक इष्टतम संतुलन मिल (यानी, नहीं भी ठंडा) और प्रोटीन की स्थिरता (यानी, बहुत गर्म नहीं) । यह कुओं और उपयोग प्रोटीन की स्थिरता में जैल के वितरण की गति पर दोनों निर्भर करता है ।
हिप-एफए प्रतिस्पर्धी डीएनए oligomers के लिए एक नियंत्रित वितरण प्रणाली का उपयोग करता है । titrations curves का निर्माण करने के लिए, यह प्रतिस्पर्धी डीएनए एकाग्रता c (जेड, टी) प्रत्येक दी जेडजेल मैट्रिक्स और टाइम पॉइंट टीके भीतर स्थिति के लिए निर्धारित करने के लिए आवश्यक है यह एक महत्वपूर्ण कदम है, के बाद से कश्मीरडी एस के निर्धारण सीधे सी पर निर्भर करता है (जेड, टी)। अंशांकन डीएनए एकाग्रता के लिए एक संवेदक के रूप में एनबी डाई युक्त कुओं इस प्रयोजन के लिए उपयोग किया जाता है (चित्रा 1डी, चित्रा 2ए) । आमतौर पर, प्लेट प्रति एनबी युक्त 3-5 अंशांकन कुओं पर्याप्त हैं । किसी भी हिप-एफए प्रयोग के मूल्यांकन से पहले, एक नायब अंशांकन वक्र अलग सांद्रता पर किसी भी अनुक्रम के एक प्रतियोगी डीएनए के साथ agarose जेल में एक नायब भंग की एक पारंपरिक अनुमापन श्रृंखला प्रदर्शन द्वारा सेट अप के लिए निर्माण किया जाना चाहिए (चित्रा 3 a), जैसा चरण 8 में विस्तार से बताया गया है । बहुत मजबूत बंधन के मामले में (KD < ५०० pM), प्रतिस्पर्धी डीएनए की कम सांद्रता के निर्धारण के लिए इस्तेमाल एक्सट्रपलेशन सीमित हो जाता है, क्योंकि यह एक सीधा माप की तुलना में कम सटीक है । हालांकि, ऐसे कम कश्मीरडीएस के साथ TFs के लिए, हिप-एफए सेटअप एक agarose जेल मैट्रिक्स (चित्रा 5) के उपयोग के बिना बाध्यकारी बफर में एक पारंपरिक प्रतिस्पर्धी अनुमापन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक प्रतियोगी डीएनए के 12 विभिंन सांद्रता के साथ एक पूर्ण अनुमापन एक ९६-अच्छी तरह से थाली की एक पंक्ति में किया जा सकता है ।
नियंत्रण वितरण प्रणाली भी तेजी से TF-डीएनए बाध्यकारी कैनेटीक्स और स्थिर प्रोटीन की आवश्यकता है, हालांकि प्रसार के बाद agarose जेल गतिशील (हालांकि धीमी गति से) है । दोनों संपत्तियों का पालन सीधे कूल्हे से एफए सेटअप के साथ परीक्षण किया जा सकता है, समय के साथ, ब्याज की TFs के एफए जब उनके संबंधित फ्लोरोसेंट लेबल संदर्भ डीएनए के लिए बाध्य । हम कश्मीरपर और जांच कारकों के लिएदूर कश्मीर मापा और उंहें20सेकंड के लिए मिलीसेकंड के आदेश पर हो पाया, के अनुसार अंय30अध्ययन के साथ । यह पर्याप्त है कि माप सुनिश्चित करने के लिए तेजी से संतुलन में जगह ले रहा है । धीमी कैनेटीक्स के साथ अन्य बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं के मामले में, प्रतिस्पर्धी के diffusivity अपनी एकाग्रता को कम करने या जेल ताकना आकार को कम करने के द्वारा देखते किया जा सकता है । परीक्षण TFs के मामले में, जो सभी तेजी से टी (~ सेकंड), के बारे में 1-2 एच के एक कुल माप समय प्रत्येक माप में ऊष्मा संतुलन सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है ।
एक अंय संभावित प्रोटीन से संबंधित मुद्दे को प्रोटीन समुच्चय है कि एफए माप बदल सकता है के गठन है । विभिन्न additives (जैसे tensides) युक्त अन्य बफर स्थितियों का उपयोग समग्र गठन को रोका जा सकता है, यदि आवश्यक हो तो.
हम PWM के रैखिकता धारणा के तहत काम किया है; हालांकि, हिप-एफए आम सहमति अनुक्रम के सभी संभव डि-न्यूक्लियोटाइड उत्परिवर्तनों को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । अंत में, हिप-एफए बाध्यकारी बातचीत के अंय प्रकार के उपाय अनुकूलित किया जा सकता है । शर्त के लिए उपलब्ध है एक उपयुक्त संदर्भ प्रोटीन जो फ्लोरोसेंट लेबल किया जा सकता है से बंधे अणु है । नियंत्रित वितरण प्रणाली के साथ, एक एकाग्रता ढाल ligand के किसी भी प्रकार के लिए उत्पन्न किया जा सकता; इसलिए, प्रोटीन प्रोटीन और दवा प्रोटीन बातचीत इसी तरह उच्च निष्ठा और प्रवाह के साथ मापा जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम सीडीएनए क्लोन और गॉल लैब के सदस्यों के लिए जे म्यूलर धंयवाद, विशेष रूप से एस Bergelt में, बहुमूल्य सलाह और उत्साही चर्चा के लिए । यह काम SFB ६४६, जीनोम अभिव्यक्ति और रखरखाव में विनियामक नेटवर्क (मुख्य ंयायाधीश, पीईबी), एकीकृत प्रोटीन विज्ञान (U.G.) और मात्रात्मक विज्ञान ंयूनिख (M.S.) के लिए स्नातक स्कूल के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था । U.G. ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थन स्वीकार करता है (SFB ६४६, SFB १०६४, CIPSM, QBM), Bundesministerium फर Bildung und Forschung (BMBF: ebio-Innovationswettbewerb Systembiologie), और पीरु फाउंडेशन (अलेक्जेंडर वॉन पीरु, प्रोफेसर) ।
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
Nile Blue A | Sigma | N5632-25G | |
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS | Greiner | 655891 | 175 µm thick glass bottom |
384 Well Sensoplate, black | Greiner | 788896 | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-50G | |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Tween-20 | Sigma | P1379-1L | |
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Merck | 1.05099.1000 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.04873.1000 | |
Q-POD Element | Merck Millipore | ZMQSP0DE1 | |
Millipak 40 Gamma Gold Filter | Merck Millipore | MPGL04GK2 | |
Milli-Q Integral 3 Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ003WW | |
Quantum TIX | Merck Millipore | QTUMOTIX1 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
Mastercycler gradient | Eppendorf | Z316083 | |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.200 | |
Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP | Sarstedt | 72.737.002 | |
MICROSCOPY SETUP: | |||
Automated widefield microscope | LEICA | DMI6000 | |
Long distance objective | LEICA | HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry | |
638 nm line continuous diode laser | Omicron | PHOxX 638-40, 40mW | |
Back-illuminated EM-CCD Camera | Andor | iXon DV897 | |
Dichroic mirror | AHF | 640nm cut-off | |
Bandpass filter | AHF | ET bandpass 700/75 | |
Linear polarizer | Thorlabs | LPVISC050-MP2 | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | BS010 | |
Achromatic lens | Thorlabs | 200 mm focal length | |
Multimode optical fiber | Optronis | FVP600660710 | |
ROBOTIC SYSTEM: | |||
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper | Beckman Coulter | Biomek NXP | |
SOFTWARE: | |||
Programming language | National Instruments | Labview 9.0 | |
Script for the HiP-FA software available at | https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA |