Her presenterer vi en ny metode for å bestemme bindende slektskap i likevekt og løsning med høy følsomhet i stor skala. Dette forbedrer kvantitativ analyse av transkripsjon faktor-DNA binding. Metoden er basert på automatiserte fluorescens anisotropy mål i en kontrollert leveringssystem.
Nøyaktig kvantifisering av transkripsjon faktor (TF)-DNA interaksjoner er avgjørende for å forstå regulering av genuttrykk. Siden eksisterende tilnærminger lider av betydelige begrensninger, har vi utviklet en ny metode for å bestemme TF-DNA bindende slektskap med høy følsomhet i stor skala. Analysen baserer seg på etablerte fluorescens anisotropy (FA) prinsippet, men introduserer viktige tekniske forbedringer. Først måler vi en full FA konkurransedyktig titrering kurve i en enkelt brønn ved å innlemme TF og en fluorescently merket referanse DNA i en porøs agarose gel matrise. Umerkede DNA oligomer lastes på toppen som en konkurrent, og gjennom diffusjon, danner spatio-temporale gradering. Resulterende FA graderingen leses bruker en tilpasset epifluorescence mikroskop oppsett. Forbedret installasjonen øker sterkt følsomheten av FA, slik at både svake og sterke binding til kvantifiseres pålitelig, selv for molekyler av lignende molekylvekt. På denne måten, vi kan måle en titrering kurve per brønn av en flere godt plate, og gjennom en passende prosedyre, vi kan trekke ut både absolutt dissosiasjon konstant (KD) og aktiv protein konsentrasjon. Ved å teste alle ett-punkts mutasjon varianter av en gitt konsensus bindende sekvens, kan vi kartlegge hele bindende spesifisitet landskapet en TF, vanligvis på en enkelt plate. De resulterende posisjon vekt matriser (PWMs) utkonkurrere de som stammer fra andre metoder forutse i vivo TF innkvartering. Her presenterer vi en detaljert guide for å implementere HiP-FA på konvensjonelle automatisert fluorescerende mikroskop og data analyse rørledningen.
Gitt den sentrale rollen av transkripsjonsfaktorer (TFs) i genet regulering, bestemme bindende innstillinger i en kvantitativ måte er av avgjørende betydning. Banebrytende studier av von Hippel introduserte ideen om at regulatoriske TFs raskt gjenkjenne DNA, slik at deres bindende er godt beskrevet av termodynamisk likevekt, mens nedstrøms hendelsene i rekruttering RNA polymerase selskapet styres av tregere kinetics1. I vivo bindende studier tyder på at dette bildet er trolig mer komplekse2,3; Likevel, disse generelle forutsetninger som god tilnærmelser og har støttet mange computational tilnærminger for å finne cis-regulatoriske elementer og forutsi uttrykk sekvenser4,5,6. Mens likevekt bindende har dermed vært vellykket ansatt som et konsept, gjeldende metoder for å bestemme TF-DNA interaksjoner fokus på bindende spesifisitet og vanligvis ikke direkte mål bindende slektskap på likevekt. Systematisk måling av TF-DNA binding representerer en stor teknisk utfordring, og de eksisterende metodene har flere ulike begrensninger.
Chromatin immunoprecipitation etterfulgt av dype sekvensering (ChIP-seq)7, det mest utbredt i vivo teknikken, tillater ikke måling av bindende slektskap eller den nøyaktige lokaliseringen av bindende områder i genomisk fragmenter. Flere i vitro metoder, inkludert DNase footprinting8, electrophoretic mobilitet Skift (EMSA)9, overflate plasmon resonans (SPR)10og Mikroskala thermophoresis11 er kjøpedyktig mål bindende slektskap, men de er relativt lav overføringshastighet. Omvendt, høy gjennomstrømning teknikker inkludert protein bindende microarrays12, HT-SELEX13,14og bakteriell ett-hybrid (B1H)15 er ikke kunne måle bindende slektskap og vanligvis gir altfor bestemt bindingen sekvenser, som er hovedsakelig på grunn av strenge utvalget eller vaske trinnene nødvendig. Nyere utvikling omfatter dyp sekvensering basert treff VEND16, SELEX-seq17, og microfluidics-baserte MITOMI18 eller smil-Seq19, som gir mulighet for utvinning av absolutt bindende slektskap; men avhengige de måle fluorescens intensiteter av merket TF og DNA. Fluorescens signaler, derfor bli begrenset i lav protein konsentrasjoner og ved lave KD verdier (< ~ 10 nM). Videre finner TF-DNA bindingen i disse metodene sted på tynn overflater, øke problemene med uspesifikke bindende og/eller auto-fluorescens bakgrunn, som gjør det vanskelig å tallfeste nøyaktig svak bindende.
For å løse disse begrensningene, har vi utviklet en ny metode for å fastslå TF-DNA affinitet landskap i likevekt og løsning, som vi kalte høytytende fluorescens anisotropy (HiP-FA)20. Teknikken er basert på etablerte fluorescens anisotropy (FA) analysen21 , men endret for å måle bindende konstanter med høy følsomhet og store bruker tilpasset automatisert mikroskop og analyse oppsett.
FA analysen overvåker samspillet av fluorescently merket arter (som en DNA oligomer) til en bindende partner, i dette tilfellet en TF, ved å måle molekylær rotasjon av merket molekylet. Ved binding til TF reduseres roterende hastigheten på grunn av høyere etter radius og molekylvekt av bundet komplekset, som resulterer i økt FA. Nøyaktig måling av veldig sterke bindende (KD < ~ 1 nM) krever bruk av lave konsentrasjoner av merket, referanse DNA (c < ~ 1 nM). Dette er vanskelig å oppnå med en kommersiell instrument som en standard microplate leseren. I tillegg er en stor størrelse forskjell (10-100 brett) mellom bundne og ubundne komplekser vanligvis nødvendig, forbyr måling av samspillet mellom TF bindende domener og kort DNA oligomers, som vanligvis er av omtrent like molekylvekt . Til slutt, en full titrering kurve normalt krever forberedelse og måling av flere brønner som inneholder en konsentrasjon serie for den titrating arten.
For å løse disse problemene, bruker vi en widefield mikroskopi oppsett, endret for å oppnå høy oppdagelsen følsomhet og tillate FA målinger på ulike z-posisjoner i en enkelt brønn. Dette gjør det mulig for oss å bindingen interaksjoner mellom arter av lignende molekylvekt og med høy slektskap. Høyere gjennomstrømning oppnås ved å måle FA i flere godt plate formater og gjennomføre en hele titrering serie i ett godt med en kontrollert levering system (figur 1en). Videre ved å ansette en konkurransedyktig bindende analysen, pakker vi ikke bare bindende konstanter, men også konsentrasjonen av aktive protein. Dette er en viktig funksjon i analysen, siden bare en del av uttrykt TF molekylene er aktive på grunn av protein misfolding eller degradering. Eksperimentell oppsettet er basert på kommersielle epifluorescence mikroskop utstyrt med XY og Z piezo stadier. Vi oppgradert systemet med eksterne laser eksitasjon, så oppdaget to slippes ut linear polarisasjon komponenter på chip til et EM-CCD kamera med høy quantum effektivitet for lys gjenkjenning (figur 1b og 1 c). Systemet bruker en høy numeriske blenderåpning (NA) målsetting koplet til en ultra-følsom sensor og dermed gir svært følsom FA målinger. Ved fluorescens z-stabler, kan bindende interaksjoner måles langs optisk z-aksen når du bruker en heterogen matrise for reaktantene. Alle disse endringene kan gjennomføres lett på et eksisterende system og er kostnadseffektiv.
Vi bruker en konkurransedyktig bindende analysen som forpliktende tilhørighet til en umerket DNA oligomer måles i forhold til fluorescently merket DNA, som fungerer som en referanse. TF og referanse DNA er innlemmet i fast konsentrasjoner i en porøs agarose gel matrise (pore størrelse ~ 1 µm) som utgjør en ikke-samspill miljø for bindingen. Referansen DNA er merket med Cy5. Dette fargestoffet viste seg for å være godt egnet for FA målinger på grunn av dens relativt lang fluorescens levetid (~ 1ns) og fluorescens utslipp i den langt rødt av det synlige spekteret (lav auto-fluorescens bakgrunn). TF konsentrasjonen er i molar overkant over Cy5-referanse DNA, sikre at alle referanse DNA er bundet til protein. En løsning av umerkede konkurrent DNA settes da inn på gel overflaten og diffunderer inne porøse matrise, etablere en konsentrasjon gradient c (z, t) som endrer over z-posisjonen til fokalplanet og tiden t (figur 1, figur 2a-2 c). TF bundet til Cy5-referanse DNA er dermed lokalt utsatt for ulike konsentrasjoner av konkurrenten DNA som konkurrerer til innbinding, fører til en dynamisk endre FA på Cy5-referanse DNA FAREF(z, t) (figur 2b og 2 c).
For å bestemme konkurrent konsentrasjon c(z,t), vi måle i egen brønner (kalibrering wells) dynamisk endre FA signal til Nilen blå (NB) FANB(z, t) (figur 2en og 3). Dette fargestoffet setter tiden inn DNA, og fungerer dermed som en DNA-sensor for konkurrenten DNA. Med denne kontrollert levering system, kan titalls til hundrevis av forskjellige DNA-protein bindende interesseområder måles i en multi godt plate (96 – eller 384-godt plate format). Måling utføres deretter sekvensielt til fullstendig forskyvning av merket referansen DNA fra TF. Vi bestemt bindende spesifisiteten for en gitt faktor ved å måle slektskap av alle 3 N single-base mutasjoner av konsensus sekvensen lengden N. HiP-FA krever lave mengder protein (~ pmols per titrering kurve) og viser lav variasjon i fastsettelse av KDs [koeffisient av variant (CV) < 20%], samtidig som mål i relativt stor skala. Metoden kan utføres manuelt eller fullt automatisert ved hjelp av en robot-system, noe som resulterer i lavere CVs (Figur 4, øvre panel). Dissosiasjon konstanter måles med høy nøyaktighet ned 0,5 nM. For ekstremt høy slektskap (KD < 500 pM), vi bruker en standard konkurransedyktig titrering (figur 5) på grunn av unøyaktigheter måle konkurrent DNA konsentrasjoner på lavt nivå (< 100 nM).
HiP-FA kan være implementert på nesten alle standard, invertert, epifluorescence fluorescerende mikroskop, gitt tilgjengeligheten av et automatisert XY-Stadium og en piezo z scene. Optisk komponenter ble bygget rundt en automatisert widefield oppsett utstyrt med en langdistanse målsetting. I praksis kan analysen tilpasses til mål med andre egenskaper (i bestemt arbeider, avstand og numeriske blenderåpning). Dette krever imidlertid optimalisere parametrene (avstander mellom z-skiver, porøsitet og høyde av agarose gel, etc.). Bruk av andre typer lasere eller kameraet er også mulig. En detaljert beskrivelse av hele eksperimentelle prosedyren og dataanalyse er gitt nedenfor i delen protokollen.
HiP-FA er en omfattende ny metode for å bestemme bindende preferanse landskapet TF-DNA samhandlinger. Det måler bindende slektskap mutational DNA motiv varianter direkte, unngå alle underliggende antakelsen om at bindingen innstillinger gjenspeiles i frekvensen av nukleotid forekomst i en rekke ovenfor-terskel bindemidler. Måling foregår i løsningen uten immobilisering og mekanisk eller kjemikalie innblanding bindende reaksjonen, tilnærmet forhold så tett som mulig. Kontrollert levering systemet tillater måling av en full titrering kurve i ett godt og øker både ytelse og pålitelighet under lagring protein. Med et mål med en høy numeriske blenderåpning og EM-CCD kamera med høy lys samling effektivitet tillater svært følsom fluorescerende lys oppdagelsen. Derfor med dette oppsettet endres liten FA så lavt som 10-15 mP kan oppdages nøyaktig; i praksis betyr dette at noen binding reaksjon som øker etter binding er minimal (så lavt som et forhold mellom 2) er lett oppdaget. Dette er vanligvis ikke tilfelle med kommersielle systemer som microplate lesere. På grunn av dens høy følsomhet utvider HiP-FA utvalget av dissosiasjon konstanter som kan måles pålitelig i picomolar området. Binding energier fastsettes nøyaktig over flere størrelsesordener.
For å vurdere kvaliteten av reviderte PWMs, utført vi to typer analyse20. Vi testet for fem faktorer av segmentering genet network, hvor godt forskjellige PWMs kan forutsi eksperimentelle ChIP-seq profiler i genomisk regioner i 21 segmentering gener. Som en andre test brukte vi et sekvensuttrykk-modell4 som spår uttrykk mønstre av segmentering enhancers basert på bindingen preferanse og protein konsentrasjonen av deltakende TFs. I begge øvelsene vi fant at mindre spesifikk HiP-FA PWMs utføre betydelig bedre enn mer spesifikke footprinting og B1H PWMs20.
I motsetning til de novo metoder krever HiP-FA noen forkunnskaper i en gitt TF bindende preferanse. Men konsensus sekvenser er kjent for mange TFs, og mange eksisterende metoder kan levere dem13,14,15. Hvis nødvendig, finner den sanne optimale bindende sekvensen iterativt.
Vi brukte DNA referanse oligomers fluorescently merket med Cy5 og Bodipy-650. Disse fargestoffer har vist seg for å utføre godt for FA målinger siden anisotropy av bundne og ubundne merket referanse DNA var den største blant de forskjellige testet fargestoffer. Dette sikrer dynamiske avstanden for FA verdiene. Generelt noen fluorescerende farge med en fluorescens levetid ≥ 1 ns trolig være egnet men må bli testet først. Hvis mulig, er det anbefales å bruke fargestoffer fluorescing i området nær-IR for å minimere protein autofluorescence.
Det viktigste trinnet i den eksperimentelle prosedyren er pipettering av gel i godt platene. God reproduserbarhet krever gel volumene være som uniform som mulig. Endringer i gel høyde er oversatt til endringer av diffusivity for det konkurransedyktige DNA oligomer og dermed tilsynelatende endringer av affinitet når du vurderer dataene. Dette er den viktigste kilden til variansen i en teknisk gjenskape. Bruk av en elektronisk Pipetter eller automatisering teknikker forbedrer reproduserbarhet. Luftbobler i gel kan unngås ved sakte og forsiktig pipettering. Det er også viktig å legge til alle konkurrerende løsninger på titrering brønnene med som liten forsinkelse som mulig. For beste reproduserbarhet, kan hele prosessen automatisert benytter en pipettering robot med varme inkubatorer. En viktig del for overføring protokollen til automatisering er nødvendig optimalisering av inkubator temperatur og inkubasjon times. Sørg for å finne den optimale balansen mellom viskositeten av gel (dvs., ikke for kaldt) og stabiliteten på proteiner (dvs. ikke for varmt). Denne avhenger både på dispensering hastigheten på geléer i brønner og stabilitet av protein brukes.
HiP-FA gjør bruk av en kontrollert leveringssystem for konkurrent DNA oligomers. For å konstruere titrations kurvene, er det nødvendig å bestemme konkurrent DNA konsentrasjon c(z,t) for hver gitt z-plasser innenfor gel matrise og tid punkt t. Dette er et kritisk steg, siden fastsettelse av KDs direkte avhengig c(z,t). Kalibrering brønner som inneholder NB fargestoff som en sensor for DNA konsentrasjon brukes til dette formålet (figur 1d, figur 2en). Vanligvis er 3-5 kalibrering brønner som inneholder NB per plate tilstrekkelig. Før du evaluerer noen HiP-FA eksperimentet, en NB kalibreringskurven skal være konstruert for oppsettet ved å utføre en konvensjonell titrering rekke NB oppløst i agarose gel med en konkurrent DNA av en sekvens i ulike konsentrasjoner (Figur 3 en), som forklart i detalj i trinn 8. Veldig sterk Bindow (KD < 500 pM), den ekstrapolering brukt bestemmelse av lave konsentrasjoner konkurrent DNA blir begrense, siden det er mindre nøyaktig enn en direkte måling. Men for TFs med slike lave KDs, kan HiP-Aktivaoppsett brukes til å utføre en konvensjonell konkurransedyktig titrering bindende buffer uten bruk av en agarose gel matrise (figur 5). For eksempel kan en full titrering med 12 ulike konsentrasjoner av konkurrent DNA utføres i en enkeltrad i en 96-brønns plate.
Kontrollert levering systemet krever også rask TF-DNA bindende kinetics og stabil proteiner, siden spredningen om agarose gel er dynamiske (selv om sakte). Begge eiendommene kan testes direkte med HiP-FA oppsettet av følgende, over tid, FA av TFs rundt når bundet til de respektive fluorescently merket referanse DNA. Vi målt KON og Kav priser for de undersøkte faktorene og fant dem å være på IPv6 sekunder20, i samsvar med andre studier30. Dette er tilstrekkelig raskt slik at målinger finne sted i likevekt. Når det gjelder andre bindende reaksjoner med tregere kinetikk stilles diffusivity for konkurrenten ved å senke sin konsentrasjon eller redusere gel porestørrelse. Når det gjelder de testet TFs, som alle har rask Tav (~ sekunder), gangen totale måling av ca 1-2 h er tilstrekkelig for å sikre termodynamisk likevekt på hver måling.
Et annet potensielt problem med relatert til protein er dannelsen av protein Sammendrag som kan endre FA målinger. Bruk av andre buffer betingelser som inneholder forskjellige tilsetningsstoffer (som tensides) kan hindre samlet formasjon, om nødvendig.
Vi har jobbet under forutsetning av linearitet av PWM; men kan HIP-FA skaleres for å inkludere alle mulige di-nukleotid mutasjoner av konsensus sekvensen. Til slutt, HiP-FA kan tilpasses å måle andre typer bindende interaksjoner. Forutsetningen er å ha tilgjengelig et passende referanse molekyl bundet av proteinet som kan merkes fluorescently. Med kontrollert levering system, kan en konsentrasjon gradient genereres for alle slags ligand; Derfor kan protein-protein og narkotika-protein interaksjoner måles med tilsvarende Hi-Fi og gjennomstrømning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker J. Müller for cDNA kloner og medlemmer av Gallia lab, spesielt S. Bergelt, verdifulle råd og dristig diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av SFB 646, regulatoriske nettverk i genomet uttrykk og vedlikehold (C.J., P.B.), Center for integrert Protein Science (UG) og Graduate School for kvantitative biovitenskap München (M.S.). UG anerkjenner støtte ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: ebio – Innovationswettbewerb Systembiologie), og Humboldt-Foundation (Alexander von Humboldt, Professorat).
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
Nile Blue A | Sigma | N5632-25G | |
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS | Greiner | 655891 | 175 µm thick glass bottom |
384 Well Sensoplate, black | Greiner | 788896 | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-50G | |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Tween-20 | Sigma | P1379-1L | |
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Merck | 1.05099.1000 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.04873.1000 | |
Q-POD Element | Merck Millipore | ZMQSP0DE1 | |
Millipak 40 Gamma Gold Filter | Merck Millipore | MPGL04GK2 | |
Milli-Q Integral 3 Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ003WW | |
Quantum TIX | Merck Millipore | QTUMOTIX1 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
Mastercycler gradient | Eppendorf | Z316083 | |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.200 | |
Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP | Sarstedt | 72.737.002 | |
MICROSCOPY SETUP: | |||
Automated widefield microscope | LEICA | DMI6000 | |
Long distance objective | LEICA | HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry | |
638 nm line continuous diode laser | Omicron | PHOxX 638-40, 40mW | |
Back-illuminated EM-CCD Camera | Andor | iXon DV897 | |
Dichroic mirror | AHF | 640nm cut-off | |
Bandpass filter | AHF | ET bandpass 700/75 | |
Linear polarizer | Thorlabs | LPVISC050-MP2 | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | BS010 | |
Achromatic lens | Thorlabs | 200 mm focal length | |
Multimode optical fiber | Optronis | FVP600660710 | |
ROBOTIC SYSTEM: | |||
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper | Beckman Coulter | Biomek NXP | |
SOFTWARE: | |||
Programming language | National Instruments | Labview 9.0 | |
Script for the HiP-FA software available at | https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA |