Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

doi: 10.3791/58763 Published: February 7, 2019

Summary

Her presenterer vi en ny metode for å bestemme bindende slektskap i likevekt og løsning med høy følsomhet i stor skala. Dette forbedrer kvantitativ analyse av transkripsjon faktor-DNA binding. Metoden er basert på automatiserte fluorescens anisotropy mål i en kontrollert leveringssystem.

Abstract

Nøyaktig kvantifisering av transkripsjon faktor (TF)-DNA interaksjoner er avgjørende for å forstå regulering av genuttrykk. Siden eksisterende tilnærminger lider av betydelige begrensninger, har vi utviklet en ny metode for å bestemme TF-DNA bindende slektskap med høy følsomhet i stor skala. Analysen baserer seg på etablerte fluorescens anisotropy (FA) prinsippet, men introduserer viktige tekniske forbedringer. Først måler vi en full FA konkurransedyktig titrering kurve i en enkelt brønn ved å innlemme TF og en fluorescently merket referanse DNA i en porøs agarose gel matrise. Umerkede DNA oligomer lastes på toppen som en konkurrent, og gjennom diffusjon, danner spatio-temporale gradering. Resulterende FA graderingen leses bruker en tilpasset epifluorescence mikroskop oppsett. Forbedret installasjonen øker sterkt følsomheten av FA, slik at både svake og sterke binding til kvantifiseres pålitelig, selv for molekyler av lignende molekylvekt. På denne måten, vi kan måle en titrering kurve per brønn av en flere godt plate, og gjennom en passende prosedyre, vi kan trekke ut både absolutt dissosiasjon konstant (KD) og aktiv protein konsentrasjon. Ved å teste alle ett-punkts mutasjon varianter av en gitt konsensus bindende sekvens, kan vi kartlegge hele bindende spesifisitet landskapet en TF, vanligvis på en enkelt plate. De resulterende posisjon vekt matriser (PWMs) utkonkurrere de som stammer fra andre metoder forutse i vivo TF innkvartering. Her presenterer vi en detaljert guide for å implementere HiP-FA på konvensjonelle automatisert fluorescerende mikroskop og data analyse rørledningen.

Introduction

Gitt den sentrale rollen av transkripsjonsfaktorer (TFs) i genet regulering, bestemme bindende innstillinger i en kvantitativ måte er av avgjørende betydning. Banebrytende studier av von Hippel introduserte ideen om at regulatoriske TFs raskt gjenkjenne DNA, slik at deres bindende er godt beskrevet av termodynamisk likevekt, mens nedstrøms hendelsene i rekruttering RNA polymerase selskapet styres av tregere kinetics1. I vivo bindende studier tyder på at dette bildet er trolig mer komplekse2,3; Likevel, disse generelle forutsetninger som god tilnærmelser og har støttet mange computational tilnærminger for å finne cis-regulatoriske elementer og forutsi uttrykk sekvenser4,5,6. Mens likevekt bindende har dermed vært vellykket ansatt som et konsept, gjeldende metoder for å bestemme TF-DNA interaksjoner fokus på bindende spesifisitet og vanligvis ikke direkte mål bindende slektskap på likevekt. Systematisk måling av TF-DNA binding representerer en stor teknisk utfordring, og de eksisterende metodene har flere ulike begrensninger.

Chromatin immunoprecipitation etterfulgt av dype sekvensering (ChIP-seq)7, det mest utbredt i vivo teknikken, tillater ikke måling av bindende slektskap eller den nøyaktige lokaliseringen av bindende områder i genomisk fragmenter. Flere i vitro metoder, inkludert DNase footprinting8, electrophoretic mobilitet Skift (EMSA)9, overflate plasmon resonans (SPR)10og Mikroskala thermophoresis11 er kjøpedyktig mål bindende slektskap, men de er relativt lav overføringshastighet. Omvendt, høy gjennomstrømning teknikker inkludert protein bindende microarrays12, HT-SELEX13,14og bakteriell ett-hybrid (B1H)15 er ikke kunne måle bindende slektskap og vanligvis gir altfor bestemt bindingen sekvenser, som er hovedsakelig på grunn av strenge utvalget eller vaske trinnene nødvendig. Nyere utvikling omfatter dyp sekvensering basert treff VEND16, SELEX-seq17, og microfluidics-baserte MITOMI18 eller smil-Seq19, som gir mulighet for utvinning av absolutt bindende slektskap; men avhengige de måle fluorescens intensiteter av merket TF og DNA. Fluorescens signaler, derfor bli begrenset i lav protein konsentrasjoner og ved lave KD verdier (< ~ 10 nM). Videre finner TF-DNA bindingen i disse metodene sted på tynn overflater, øke problemene med uspesifikke bindende og/eller auto-fluorescens bakgrunn, som gjør det vanskelig å tallfeste nøyaktig svak bindende.

For å løse disse begrensningene, har vi utviklet en ny metode for å fastslå TF-DNA affinitet landskap i likevekt og løsning, som vi kalte høytytende fluorescens anisotropy (HiP-FA)20. Teknikken er basert på etablerte fluorescens anisotropy (FA) analysen21 , men endret for å måle bindende konstanter med høy følsomhet og store bruker tilpasset automatisert mikroskop og analyse oppsett.

FA analysen overvåker samspillet av fluorescently merket arter (som en DNA oligomer) til en bindende partner, i dette tilfellet en TF, ved å måle molekylær rotasjon av merket molekylet. Ved binding til TF reduseres roterende hastigheten på grunn av høyere etter radius og molekylvekt av bundet komplekset, som resulterer i økt FA. Nøyaktig måling av veldig sterke bindende (KD < ~ 1 nM) krever bruk av lave konsentrasjoner av merket, referanse DNA (c < ~ 1 nM). Dette er vanskelig å oppnå med en kommersiell instrument som en standard microplate leseren. I tillegg er en stor størrelse forskjell (10-100 brett) mellom bundne og ubundne komplekser vanligvis nødvendig, forbyr måling av samspillet mellom TF bindende domener og kort DNA oligomers, som vanligvis er av omtrent like molekylvekt . Til slutt, en full titrering kurve normalt krever forberedelse og måling av flere brønner som inneholder en konsentrasjon serie for den titrating arten.

For å løse disse problemene, bruker vi en widefield mikroskopi oppsett, endret for å oppnå høy oppdagelsen følsomhet og tillate FA målinger på ulike z-posisjoner i en enkelt brønn. Dette gjør det mulig for oss å bindingen interaksjoner mellom arter av lignende molekylvekt og med høy slektskap. Høyere gjennomstrømning oppnås ved å måle FA i flere godt plate formater og gjennomføre en hele titrering serie i ett godt med en kontrollert levering system (figur 1en). Videre ved å ansette en konkurransedyktig bindende analysen, pakker vi ikke bare bindende konstanter, men også konsentrasjonen av aktive protein. Dette er en viktig funksjon i analysen, siden bare en del av uttrykt TF molekylene er aktive på grunn av protein misfolding eller degradering. Eksperimentell oppsettet er basert på kommersielle epifluorescence mikroskop utstyrt med XY og Z piezo stadier. Vi oppgradert systemet med eksterne laser eksitasjon, så oppdaget to slippes ut linear polarisasjon komponenter på chip til et EM-CCD kamera med høy quantum effektivitet for lys gjenkjenning (figur 1b og 1 c). Systemet bruker en høy numeriske blenderåpning (NA) målsetting koplet til en ultra-følsom sensor og dermed gir svært følsom FA målinger. Ved fluorescens z-stabler, kan bindende interaksjoner måles langs optisk z-aksen når du bruker en heterogen matrise for reaktantene. Alle disse endringene kan gjennomføres lett på et eksisterende system og er kostnadseffektiv.

Vi bruker en konkurransedyktig bindende analysen som forpliktende tilhørighet til en umerket DNA oligomer måles i forhold til fluorescently merket DNA, som fungerer som en referanse. TF og referanse DNA er innlemmet i fast konsentrasjoner i en porøs agarose gel matrise (pore størrelse ~ 1 µm) som utgjør en ikke-samspill miljø for bindingen. Referansen DNA er merket med Cy5. Dette fargestoffet viste seg for å være godt egnet for FA målinger på grunn av dens relativt lang fluorescens levetid (~ 1ns) og fluorescens utslipp i den langt rødt av det synlige spekteret (lav auto-fluorescens bakgrunn). TF konsentrasjonen er i molar overkant over Cy5-referanse DNA, sikre at alle referanse DNA er bundet til protein. En løsning av umerkede konkurrent DNA settes da inn på gel overflaten og diffunderer inne porøse matrise, etablere en konsentrasjon gradient c (z, t) som endrer over z-posisjonen til fokalplanet og tiden t (figur 1, figur 2a-2 c). TF bundet til Cy5-referanse DNA er dermed lokalt utsatt for ulike konsentrasjoner av konkurrenten DNA som konkurrerer til innbinding, fører til en dynamisk endre FA på Cy5-referanse DNA FAREF(z, t) (figur 2b og 2 c).

For å bestemme konkurrent konsentrasjon c(z,t), vi måle i egen brønner (kalibrering wells) dynamisk endre FA signal til Nilen blå (NB) FANB(z, t) (figur 2en og 3). Dette fargestoffet setter tiden inn DNA, og fungerer dermed som en DNA-sensor for konkurrenten DNA. Med denne kontrollert levering system, kan titalls til hundrevis av forskjellige DNA-protein bindende interesseområder måles i en multi godt plate (96 - eller 384-godt plate format). Måling utføres deretter sekvensielt til fullstendig forskyvning av merket referansen DNA fra TF. Vi bestemt bindende spesifisiteten for en gitt faktor ved å måle slektskap av alle 3 N single-base mutasjoner av konsensus sekvensen lengden N. HiP-FA krever lave mengder protein (~ pmols per titrering kurve) og viser lav variasjon i fastsettelse av KDs [koeffisient av variant (CV) < 20%], samtidig som mål i relativt stor skala. Metoden kan utføres manuelt eller fullt automatisert ved hjelp av en robot-system, noe som resulterer i lavere CVs (Figur 4, øvre panel). Dissosiasjon konstanter måles med høy nøyaktighet ned 0,5 nM. For ekstremt høy slektskap (KD < 500 pM), vi bruker en standard konkurransedyktig titrering (figur 5) på grunn av unøyaktigheter måle konkurrent DNA konsentrasjoner på lavt nivå (< 100 nM).

HiP-FA kan være implementert på nesten alle standard, invertert, epifluorescence fluorescerende mikroskop, gitt tilgjengeligheten av et automatisert XY-Stadium og en piezo z scene. Optisk komponenter ble bygget rundt en automatisert widefield oppsett utstyrt med en langdistanse målsetting. I praksis kan analysen tilpasses til mål med andre egenskaper (i bestemt arbeider, avstand og numeriske blenderåpning). Dette krever imidlertid optimalisere parametrene (avstander mellom z-skiver, porøsitet og høyde av agarose gel, etc.). Bruk av andre typer lasere eller kameraet er også mulig. En detaljert beskrivelse av hele eksperimentelle prosedyren og dataanalyse er gitt nedenfor i delen protokollen.

Protocol

1. polarisering mikroskopi

  1. For widefield laser lys, fokusere en 638 nm linje av en kontinuerlig diode laser (40 mW) på åpningen av multimode optisk fiber for strålen opprydding. Montere en lineær polarisatoren på utgangen av fiber for å angi polarisering av laserlys.
  2. Blokkere komponenten eksitasjon slippes ut lyset med en dichroic speil (640 nm cut-off) og et båndpassfilter (Båndpassdesign 700/75).
  3. La fluorescens signalet passerer gjennom et polariserende strålen splitter, som deler slippes ut lyset i vinkelrett og parallelle polarisert komponentene. Deretter fokus ikke-gjenspeilet strålen (parallell komponent) og reflektert strålen (vinkelrett komponent) med en achromatic linsen på 200 mm brennvidde på brikken av en rygg-opplyst EM-CCD kamera (figur 1b og 1 c). Bruk et speil for å justere retning vinkelrett strålen mot linsen.

2. Utform og Testing av fluorescerende-merkede referanse DNA Oligomer

  1. Bestemme rekkefølgen kjernen referansen DNA: metoden er basert på en konkurransedyktig analysen som måler dissosiasjon konstant (KD2) mellom en transkripsjon faktor og umerkede konkurrent DNA oligomer som konkurrerer til innbinding med en fluorescently merket DNA som affinitet til TF fungerer som en referanser (KD1). Konsensus sekvensen fra andre kilder som DNase footprinting eller bakteriell 1-hybrid kan tjene som en start punkt5,15.
    Merk: som en tommelfingerregel, en passende referanse DNA har en 3 7-fold nedgang i forpliktende tilhørighet til TF forhold til konsensus sekvensen.
  2. Mål av HiP-FA KD1s av 2-3 foreløpig enkelt mutasjoner av konsensus sekvensen avledet i forrige trinn. Prøv å mutere stillinger i konsensus sekvens som ikke er for spesifikke å unngå fullstendig tap av bindingen.
    Merk: Det er viktig at referanse sekvensen er bundet av transkripsjon faktoren av interesse (vi brukte i denne protokollen gigantiske Gt), men ikke for sterkt, slik at svakere konkurrenter kan utkonkurrere den i høy konsentrasjoner.
  3. Utvide kjernen motivet (8-12 base parene generelt) til en lengde av 16 base parene eller mer ved å legge symmetrisk flankert rekkefølgen på begge sider (Legg til side kjeder til riktig bindende). Om nødvendig (lenger an domener, for eksempel), bruk lengre sekvenser (til ~ 50 base parene i lengde ble testet med HiP-FA analysen).
    FORSIKTIG: Vær forsiktig med å legge til som er forventet å skape ektopisk bindende. Bruk beregningsorientert verktøy som spår bindende områder fra tilgjengelig PWMs å lette denne prosessen (f.eks PySite22).
  4. Som merket referanse DNA, ordre oligomers fluorescently merket på enten videresende eller reversere strand på 3 eller 5' slutten. Bruk, for eksempel Cy5, Bodipy-650 eller noen andre passende fargestoff i en konsentrasjon av 10 µM (100 µM 10 x stock) i vann, og fortynne gradvis som beskrevet i trinn 3.1.
  5. Forberede 500 mL 1 x bindende bufferen ved å legge til 33 mM kalium fosfatbuffer (pH = 7.0), 90 mM NaCl, og 0,01% ikke-ioniske vaskemiddel i destillert vann. Også forberede 3 x bindende buffer, som inneholder de samme komponentene, bortsett fra i tredelt konsentrasjoner. Hvis bruker 3 x bindende bufferen som lager løsning for 1 x bindende buffer, forberede volumer > 500 mL; ellers forberede 250 mL.
    Merk: Denne sammensetningen var optimalisert for transkripsjon faktor stabilitet og hindre glutation S-transferase (GST) dimerization.
  6. Mål med mikroskopi oppsett beskrives i trinn 1 FA av 200 µL bindende bufferen som inneholder 0,8 nM merket referanse DNA i nærvær av annen mengde TF i et glass bunn mikroskopi 96-brønns plate (5-6 brønner med ulike TF konsentrasjoner) til bestemme TF konsentrasjonen bruke. Utføre en titrering serie med økende mengder TF og velger for analysen konsentrasjonen som kurven når et platå, indikerer komplett binding av DNA referanse oligomer.
    Merk: Den optimale TF konsentrasjonen, avhenger av verdiene av TF-DNA dissosiasjon konstanter. Vanligvis krever lavere KDs lave konsentrasjoner.

3. oligomer Annealing

  1. For å anneal DNA oligomers av merket referansen DNA (sekvens i forrige trinn), bland 7 µL av en 10 mM fargestoff-merket frem én-strandet DNA løsning og 7 µL av en 10 mM konsentrasjon av sin umerkede omvendt supplement i 186 µL av vann.
  2. Konkurrent DNA-sekvenser, blande 20 µL av 100 mM løsninger (i vann, levert av produsenten) frem én-strandet DNA med 20 µL 100 mm tilsvarende omvendt single-strandet DNA for hver individuelle konkurrent som skal måles.
  3. Utføre annealing separat i en standard PCR cycler ved å varme opp løsningene til 70 ° C til 3 min og redusere temperaturen å RT med en hastighet på 0,1 K/s. Hvis PCR maskinen brukes ikke støtter temperatur forløpninger med denne hastigheten, bare gjøre gradvis incubations med minkende temperaturer (testet var 99 sykluser av 3 s-0.4 K per syklus).

4. gel forberedelse

Merk: Følgende del forklarer utarbeidelse av to forskjellige typer gels: 1) de titrering inneholder gels med protein og brukes til å fastsette KDs for respektive konkurrent DNA-sekvenser, og 2) kalibrering brønnene gjøre bruk av NB til bestemme DNA konsentrasjonen på hver tid punkt og oppkjøp høyde. Fokuset er på utarbeidelsen av eksperimentet i en 96-brønns plate, men de tilhørende volumene for et 384-vel plate format er også indikert.

  1. Oppløse 0,5% w/v lavt Smeltepunkt agarose i bindingen bufferen ved å koke den i et laboratorium mikrobølgeovn. Etter fullført oppløsning, kan du justere volumet igjen med ddH2O å kompensere for mulig fordampning.
    Merk: For enkelhets skyld, forberede et lager av 10-20 10 mL dele geléer og smelter dem 75° C når de trengs. Gel aksjer kan lagres på RT.
    FORSIKTIG: Vær forsiktig å unngå superheating av gel løsningen i mikrobølgeovnen. Kort oppvarming tidspunkter med skjelvende i mellom er å foretrekke.
  2. For å forberede titrering og kalibrering, først smelte to 10 mL gel lager dele på 75 ° C risting.
    1. Bruke 240 µL (inkludert 20% overhead) for hver konkurrent (n = antall konkurrent sekvenser).
    2. Bruk samme volum av gel for NB kalibrering godt for å sikre en like temperatur og viskositet av både gels.
    3. Deretter setter temperaturen til 35 ° C og vent til temperaturen å equilibrate.
  3. Titrering brønner, legger du til 1,4 nM (siste konsentrasjon) hybridiserte referanse DNA (innhentet i trinn 3), TF protein (siste konsentrasjon CTF = 20-60 nM, som bestemmes i trinn 2.6), DTT (0.2 mM) og bindende bufre i et totalt volum på n x 200 µL eller n x 13 µL i en 96 - eller 384-vel plate format, henholdsvis (pluss kostnader). Mix grundig ved å invertere/riste (gjør ikke vortex).
  4. Sakte legge 200 µL per brønn i 96-brønnen plate format (13 µL/vel 386 brønner) gel løsningen forberedt i forrige trinn i titrering brønnene godt platen.
  5. Kalibrering brønner, først legge 5 nM NB til smeltet gel utenfor brønnene (totalt volum avhengig av godt plate-formatet som er brukt og antall kalibrering brønner, vanligvis 5-6 per godt platen er nok).
  6. Pipetter 200 µL (13 µL for 384-vel plate-format) av NB som inneholder gel sakte innen titrering brønnene av godt plate og sørg for å unngå luftbobler.
    Merk: Bruk av elektroniske Pipetter for flergangsbruk eller robotikk øker reproduserbarhet.
  7. La gel stivne for 10 min på RT og en annen 10 min på 4 ° C (Fjern kondens fra glass etterpå om nødvendig). Sørg for å utføre alle disse trinnene på en helt horisontal overflate å unngå ikke-homogen gel overflater.
    Merk: Protein inneholder geléer er vanligvis stabile i flere timer på 4 ° C.

5. legge til konkurrent DNA løsningen

Merk: Følgende løsninger bør være forberedt før titrering og legges på toppen av brønnene kalibrering og titrering samtidig.

  1. Legg til de glødet merket referanse DNA og protein i 3 x bindende buffer på 3 ganger høyere konsentrasjoner enn gel lager dele.
    1. Mix 20 µL av innhentet løsningen med 40 µL av hver herdet konkurrent DNA løsning oppnås i trinn 3.
    2. Hver kalibrering Vel, blande 20 µL av 3 x bindende bufferen som inneholder 15 mM NB løsning med 40 µL glødet konkurrent DNA (en sekvens med samme lengde er passende).
      Merk: For de 384-vel platene bruk 21 µL stedet for 60 µL totalt.
  2. Eventuelt sjekk homogenitet av gel høyde i forskjellige brønnene av platen tyske ved å måle absorbans ved 380 nm, bruker en multi godt plate reader (absorbansen verdiene er proporsjonal med gel høyder).
  3. Legge til 50 µL (7 µL for 384-vel plate-format) av blandet konkurrent DNA løsninger (herdet i trinn 3) over geléer. Prøv å legge alle konkurrerende løsninger som samtidig som mulig ved hjelp av elektronisk Pipetter for flergangsbruk eller en 96-kanals pipettering hodet, hvis tilgjengelig. Etter konkurrerende løsninger, Plasser platen på mikroskopet scenen og starte målingene umiddelbart (trinn 7).

6. bildeopptak

  1. Sekvensielt erverve ganger rekke z-stakker (f.eks bruk 12 fly og 100-300 ms belysning tid). Unngå å ta bilder for nær til godt overflaten (< ~1.4 µm med plater brukt her) å utelukke skjevheter polarisering.
  2. Utføre 10-25 sykluser av målinger til fullstendig frigiving av merket referanse DNA fra TF. Sluttpunktet er vanligvis nådd etter 1-2 h, avhengig av binding kinetics og diffusivity for konkurrenten DNA.

7. utvinning av FA(z,t) fra rådata

  1. Når en frisk plate har blitt avbildet, beregne fra rå fluorescens bilder gjennomsnittlig bildepunktverdiene regioner av interesse for parallelt (jeg=) og vinkelrett (jeg+) polarisert intensitet komponenter (figur 1c). Dette gjøres automatisk med HiP-FA programvare23.
    Merk: Programvare hofte-FA, en bruksanvisning og test dataset kan være dataoverførte23. Alternativt bruke en annen tilpasset skrevet programvare å trekke I= og jeg+ og utføre nedstrøms analyse av titrering kurver, som beskrevet i detalj nedenfor.
  2. Beregne FA for hver brønn. For hver brønn, skriptet beregner FA(z,t) på hver z-posisjon og tid peker t slik:
    Formel 1:Equation 1
    Hvor er G instrumentet G-faktor som retter for skjevheter mot vinkelrett kanalen.
  3. Bestemme G-faktoren av mikroskopi ved å måle de av alle løsninger som inneholder en fluorescerende farge av kjente anisotropy. To polarisering komponentene av signalet og deretter bruker Formel 1 hente G, vite FA løsningen (G = 1.15 i dette oppsettet).

8. kalibreringskurven for fastsettelse av konkurrent DNA konsentrasjonen fra FANB

  1. Anneal 120 µL av hver revers referansen oligomer (100 mM lager konsentrasjon, en tilfeldig sekvens med samme lengde som konkurrent sekvens kan brukes) og bland med 120 µL av 3 x bindende bufferen som inneholder NB (15 nM).
  2. Forberede en fortynning serie med 1:2 fortynninger i 1 x bindende buffer med 6 fortynninger totalt. Mix 50 µL av disse fortynninger med 200 µL av 0,5% lavt Smeltepunkt agarose (T > 35 ° C) gel i 1 x bindende bufferen som inneholder 5 nM i NB i triplicates.
  3. Legg til 200 µL av hver av de 6 løsningene i forrige trinn i en 96-brønns plate og lagre platen 1t på 4 ° C å sikre fullstendig gelation, deretter 1 h på RT. mål FANB løsninger ved hjelp av HiP-Aktivaoppsett.
  4. Ekstra FANB (z, t) i henhold til forrige trinn og tilpasse dataene med en Hill ligning:
    Ligning 2:Equation 2
    Hvor CDNA er konsentrasjonen av DNA oligomer; k konsentrasjonen av DNA oligomers på hvor halvparten av bindende nettsteder er opptatt; FAmax er en normalisering konstant; n er Hill koeffisient. k, FAMaks, og n er satt som gratis parametere under montering prosedyren.
  5. Angi tre parameterne fra passende prosedyren HiP-FA programvaren (i venstre nedre panel).
  6. Gjenta fastsettelse av kalibreringskurven hver månedene eller etter endringer i mikroskopi oppsettet.

9. fastsettelse av konkurrent DNA konsentrasjoner

  1. Bruk programvare hofte-FA for å ekstra c (z, t) fra FANB(z, t) målinger (Figur 3). Først få kalibreringskurven som beskrevet i forrige del og angir passende parameterne til programvaren (se manual for detaljer).
  2. Bruk programmet til å automatisk ekstrapolere c(z,t) c < 100 nM (se bruksanvisningen for detaljer) bruke formel 3 (Figur 3b), som beskriver endimensjonal spredningen av konkurrenten DNA innenfor agarose gel matrise, forutsatt at Gratis spredning.
    Formel 3:Equation 3
    Hvor C0 er første konsentrasjonen av konkurrenten DNA; ERF er feilfunksjonen; z er posisjonen. D er diffusjon koeffisient konkurrenten DNA; t0 er starttidspunktet for målingene. Gratis parameterne som brukes er C0 og z /Equation 4.

10. konvensjonelle konkurransedyktig titrering med HIP-FA for sterkt DNA Binding

  1. Serielt fortynne annen konkurrent DNA oligomers i radene i en 96-brønns plate (eller 384-vel plate) på konsentrasjonen av: 0, 1,25, 3.5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900 og 4000 nM. Legg til Cy5-merket referanse DNA (1 nM) og TF (20-50 nM) i en konstant konsentrasjon, med et totalt volum på 200 µL per brønn i bindingen buffer (figur 5en). Vent 40 min til termodynamisk likevekt er oppnådd og kjøpe (med HiP-Aktivaoppsett) z-stabler for hver brønn (å anskaffe flere bilder per brønn reduserer variasjon ved å beregne de beregnede FA verdiene).
  2. Konstruere likevekt bindende titrering kurvene og passer dem med ligningen 4 (figur 5b). KDs bestemmes av konvensjonelle konkurransedyktig titrering er identiske med de innhentet av HIP-FA bruker en agarose gel matrix20.

11. montering prosedyren av FA titrering kurver

  1. Vise i programvare hofte-FA rekonstruert titrering kurvene for individuelle konkurrent sekvensene FA(z,t) = f[c(z,t)] og visuelt datakvaliteten (se manual for detaljer). Om nødvendig avgrense parameterne som brukes til fastsettelse av konkurrent DNA konsentrasjonen i trinn 10.
  2. Tilpasse hver enkelt titrering kurve automatisk ved hjelp av ligningen 4, som gir en analytisk løsning for konkurransedyktige titrering analyser24.
    Ligningen 4:Equation 5
    Med:Equation 6
    Equation 7
    Equation 8
    Equation 9
    Der RT er protein konsentrasjon. LT er den umerkede og LST er merket DNA konsentrasjonen; KD2 er dissosiasjon konstant bestemmes; RT er konsentrasjonen av aktive protein; A og B er normalisering parametere.

    Først bestemme KD1, som fungerer som referanse for fastsettelse av ulike KD2 verdiene. KD1 er kan lett fastsettes med analysen ved å velge sekvensen av fargestoff-referanse DNA som en rekke umerkede konkurrenten DNA (se bruksanvisningen).
  3. Angi innhentet verdien for KD1 i programvaren og beregne KD2 verdiene for alle konkurrenten DNA på tallerkenen.
    Merk: Gratis parameterne for montering prosedyren er KD2, RT, A, og B.
  4. Eksportere dissosiasjon konstant KD2 og konsentrasjonen av aktive protein RT alle personlige titrering brønner av platen ved å klikke "Export" i programvaren.

12. PWM konstruksjon, spesifisitet av Protein-DNA samhandling og Pseudo teller

Opprett sekvens logoer for de ulike PWMs ved hjelp av online verktøyet WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) som beskrevet tidligere20.

Representative Results

Vi brukt HiP-FA TFs den segmentering genet nettverk25,26, som genererer anterior-posterior kroppen mønster av Drosophila embryoer, hovedsakelig gjennom transcriptional regulering. Fra dette nettverket, vi valgte bZIP domene gigantiske TF (Gt) for en detaljert analyse (Figur 4). Siden full lengde transkripsjonsfaktorer er vanskelig å uttrykke og gi det meste samme binding innstillingene som deres DNA bindende domener (DBD)13, vi brukte DBD del GST og uttrykt konstruere i E.coli GST fusion proteiner til gir samme resultat som DBDs alene20.

Gt konsensus sekvensen (enTTACGTAAC) representerer sterkeste bindende sekvensen som vi har funnet som beskrevet ovenfor. Vi deretter undersøkt påvirker binding energien i alle mulige ett-punkts mutasjoner i 10-mer Gt konsensus sekvensen (totalt 30), flankert av ekstra baser i 5' og 3 endene. Vi målt to gjentak som gel prøver ble produsert ved hjelp av automatisering, og en ekstra replikere produsert manuelt for sammenligning. KDs varierte fra 0,6 til > 2000 nM for enkeltvis mutert sekvenser, og vi bekreftet også fullstendig mangel på binding til en "ikke-bindende" sekvens (data ikke vist).

TF-DNA bindende særegenheter er vanligvis modellert bruker en posisjon vekt matrise (PWM), som et resultat er tilordnet hver mulig nucleotide i hver posisjon i bindingen motivet. PWM forutsetter at hver posisjon bidrar til binding styrke uavhengig og i de fleste tilfeller utgjør en tilstrekkelig modell for TF bindende innstillinger27. Vi generert revidert PWMs basert på våre affinitet målinger følge etablerte prosedyrer28,29 og sammenlignet dem til to PWMs tidligere rapportert i litteraturen. Først er basert på nukleotid frekvens teller fra binding av DNA footprinting4,5, og andre PWM ble innhentet av bakteriell ett-hybrid (B1H) utvalg. 15

Høy likheten av PWMs for de tre replikat (Figur 4, øvre panel), inkludert for eksempel forberedt manuelt (kopiere 3), viser den høye reproduserbarhet av metoden HiP-FA. Mens PWMs ved HiP-FA er generelle ligner PWMs oppnådd med de andre metodene (Figur 4, nedre panel), det er betydelig avvik: på posisjon 2 (svart pil), starten av kjernen bZIP motiv, mutasjoner T > (G, C, A) føre til fullstendig tap av binding i motivet ved HiP-FA, som er i samsvar med B1H motivet, men ikke med fikk med DNase footprinting, der bindingen er fortsatt relativt sterk for baser (G, A). Derimot på posisjon 7 (grå pil), mutasjon T > C fører til mye sterkere bindende enn det som var forventet basert på de tidligere målt PWMs.

Andre avvik er subtil, men ikke mindre viktig. Total, HiP-FA PWM er mindre spesifikk enn to andre, avspeiler at mange mutasjoner fra konsensus fortsatt føre middels sterke bindende. Dette kan kvantifiseres bruker innhold (IC). IC er 11,5 biter for HiP-FA matrisen (gjennomsnitt av de tre replikat), sammenlignet med IC = 13,4 biter og 16,8 biter for DNase footprinting og B1H matriser, henholdsvis. Vanligvis (men ikke universelt), PWMs ved HiP-FA er mindre spesifikk enn de som er oppnådd med andre metoder, basert på 26 TFs undersøkt20.

Figure 1
Figur 1:skjematisk skildringer av HIP-FA analysen og eksperimentelle oppsett. (a) gel leveringssystem for titrating konkurrent DNA i enkelt brønner. (b) HIP-FA mikroskopi oppsett. Tilpasset automatiserte widefield mikroskop med polarisert fluorescens lys gjenkjenning på en EM-CCD kamera. (c) Raw fluorescens bilde med de to regionene rundt brukes til å bestemme parallelt (rød) og vinkelrett (grønn) polarisert komponenter. (d) typisk oppsett av en 96-brønns plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Rå FA data og rekonstruert titrering kurver. a typisk FA(z,t) banen for en kalibrering som også inneholder NB. (b, c) FA(z,t) tid baner to titrering brønner måle binding til en sterk (b) og mer moderat (c) DNA bindende konkurrent. (d, e) Tilsvarende rekonstruert FA titrering mål og utstyrt kurver for sterk (d) og moderat (e) bindende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Å bestemme konsentrasjonen av konkurrent DNA c (z, t) ved hjelp av Nilen blå (NB). a FA-konsentrasjon kalibreringskurven for 16 base parene DNA oligomers. I en vanlig titrering serien, er NB innebygd i agarose gel med ulike konsentrasjoner konkurrent DNA. Affinitet til NB DNA er uavhengig av rekkefølgen20; Derfor den samme kalibrering kurver kan brukes til å bestemme c (z, t) for forskjellige DNA-sekvenser med samme lengde. (b) konkurrent DNA tid diffusjon profil på en vilkårlig z høyde bestemmes ved hjelp av fem kalibrering brønner. Hver målesyklusen vises gjennomsnittlig FAs fire NB inneholder brønner som hvite prikker. Kurvene er utstyrt med formel 3 (hvit linje, individuelle brønner i farger) og c (z, t) i lave konsentrasjoner (C < ~ 100 nM) bestemmes av ekstrapolert montering kurve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Binding spesifisiteter av bZIP domene familien gigantiske TF (Gt). HIP-FA PWMs av tre replikat: to tilberedt med automatisering og én manuelt forberedt (øvre panel) sammenlignes med PWMs generert av DNase footprinting og bakteriell ett-hybrid (B1H) utvalg metoden (nedre panel). Samlet HIP-FA bindende motivene er enig med tidligere data, men viser også betydelige forskjeller, som fremhevet med svart og piler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Konvensjonelle konkurransedyktig titrering med HIP-FA. (a) plate design viser 8 forskjellige konkurrent DNA serielt fortynnet i bindingen buffer i en enkeltrad i en 96-brønns plate. En FA varmekartet vises for forskjellige vilkårlig bindende styrker. (b) konkurransedyktig titrering tre konkurrent DNAs binding til Bcd TF med forskjellige interesseområder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

HiP-FA er en omfattende ny metode for å bestemme bindende preferanse landskapet TF-DNA samhandlinger. Det måler bindende slektskap mutational DNA motiv varianter direkte, unngå alle underliggende antakelsen om at bindingen innstillinger gjenspeiles i frekvensen av nukleotid forekomst i en rekke ovenfor-terskel bindemidler. Måling foregår i løsningen uten immobilisering og mekanisk eller kjemikalie innblanding bindende reaksjonen, tilnærmet forhold så tett som mulig. Kontrollert levering systemet tillater måling av en full titrering kurve i ett godt og øker både ytelse og pålitelighet under lagring protein. Med et mål med en høy numeriske blenderåpning og EM-CCD kamera med høy lys samling effektivitet tillater svært følsom fluorescerende lys oppdagelsen. Derfor med dette oppsettet endres liten FA så lavt som 10-15 mP kan oppdages nøyaktig; i praksis betyr dette at noen binding reaksjon som øker etter binding er minimal (så lavt som et forhold mellom 2) er lett oppdaget. Dette er vanligvis ikke tilfelle med kommersielle systemer som microplate lesere. På grunn av dens høy følsomhet utvider HiP-FA utvalget av dissosiasjon konstanter som kan måles pålitelig i picomolar området. Binding energier fastsettes nøyaktig over flere størrelsesordener.

For å vurdere kvaliteten av reviderte PWMs, utført vi to typer analyse20. Vi testet for fem faktorer av segmentering genet network, hvor godt forskjellige PWMs kan forutsi eksperimentelle ChIP-seq profiler i genomisk regioner i 21 segmentering gener. Som en andre test brukte vi et sekvensuttrykk-modell4 som spår uttrykk mønstre av segmentering enhancers basert på bindingen preferanse og protein konsentrasjonen av deltakende TFs. I begge øvelsene vi fant at mindre spesifikk HiP-FA PWMs utføre betydelig bedre enn mer spesifikke footprinting og B1H PWMs20.

I motsetning til de novo metoder krever HiP-FA noen forkunnskaper i en gitt TF bindende preferanse. Men konsensus sekvenser er kjent for mange TFs, og mange eksisterende metoder kan levere dem13,14,15. Hvis nødvendig, finner den sanne optimale bindende sekvensen iterativt.

Vi brukte DNA referanse oligomers fluorescently merket med Cy5 og Bodipy-650. Disse fargestoffer har vist seg for å utføre godt for FA målinger siden anisotropy av bundne og ubundne merket referanse DNA var den største blant de forskjellige testet fargestoffer. Dette sikrer dynamiske avstanden for FA verdiene. Generelt noen fluorescerende farge med en fluorescens levetid ≥ 1 ns trolig være egnet men må bli testet først. Hvis mulig, er det anbefales å bruke fargestoffer fluorescing i området nær-IR for å minimere protein autofluorescence.

Det viktigste trinnet i den eksperimentelle prosedyren er pipettering av gel i godt platene. God reproduserbarhet krever gel volumene være som uniform som mulig. Endringer i gel høyde er oversatt til endringer av diffusivity for det konkurransedyktige DNA oligomer og dermed tilsynelatende endringer av affinitet når du vurderer dataene. Dette er den viktigste kilden til variansen i en teknisk gjenskape. Bruk av en elektronisk Pipetter eller automatisering teknikker forbedrer reproduserbarhet. Luftbobler i gel kan unngås ved sakte og forsiktig pipettering. Det er også viktig å legge til alle konkurrerende løsninger på titrering brønnene med som liten forsinkelse som mulig. For beste reproduserbarhet, kan hele prosessen automatisert benytter en pipettering robot med varme inkubatorer. En viktig del for overføring protokollen til automatisering er nødvendig optimalisering av inkubator temperatur og inkubasjon times. Sørg for å finne den optimale balansen mellom viskositeten av gel (dvs., ikke for kaldt) og stabiliteten på proteiner (dvs. ikke for varmt). Denne avhenger både på dispensering hastigheten på geléer i brønner og stabilitet av protein brukes.

HiP-FA gjør bruk av en kontrollert leveringssystem for konkurrent DNA oligomers. For å konstruere titrations kurvene, er det nødvendig å bestemme konkurrent DNA konsentrasjon c(z,t) for hver gitt z-plasser innenfor gel matrise og tid punkt t. Dette er et kritisk steg, siden fastsettelse av KDs direkte avhengig c(z,t). Kalibrering brønner som inneholder NB fargestoff som en sensor for DNA konsentrasjon brukes til dette formålet (figur 1d, figur 2en). Vanligvis er 3-5 kalibrering brønner som inneholder NB per plate tilstrekkelig. Før du evaluerer noen HiP-FA eksperimentet, en NB kalibreringskurven skal være konstruert for oppsettet ved å utføre en konvensjonell titrering rekke NB oppløst i agarose gel med en konkurrent DNA av en sekvens i ulike konsentrasjoner (Figur 3 en), som forklart i detalj i trinn 8. Veldig sterk Bindow (KD < 500 pM), den ekstrapolering brukt bestemmelse av lave konsentrasjoner konkurrent DNA blir begrense, siden det er mindre nøyaktig enn en direkte måling. Men for TFs med slike lave KDs, kan HiP-Aktivaoppsett brukes til å utføre en konvensjonell konkurransedyktig titrering bindende buffer uten bruk av en agarose gel matrise (figur 5). For eksempel kan en full titrering med 12 ulike konsentrasjoner av konkurrent DNA utføres i en enkeltrad i en 96-brønns plate.

Kontrollert levering systemet krever også rask TF-DNA bindende kinetics og stabil proteiner, siden spredningen om agarose gel er dynamiske (selv om sakte). Begge eiendommene kan testes direkte med HiP-FA oppsettet av følgende, over tid, FA av TFs rundt når bundet til de respektive fluorescently merket referanse DNA. Vi målt KON og Kav priser for de undersøkte faktorene og fant dem å være på IPv6 sekunder20, i samsvar med andre studier30. Dette er tilstrekkelig raskt slik at målinger finne sted i likevekt. Når det gjelder andre bindende reaksjoner med tregere kinetikk stilles diffusivity for konkurrenten ved å senke sin konsentrasjon eller redusere gel porestørrelse. Når det gjelder de testet TFs, som alle har rask Tav (~ sekunder), gangen totale måling av ca 1-2 h er tilstrekkelig for å sikre termodynamisk likevekt på hver måling.

Et annet potensielt problem med relatert til protein er dannelsen av protein Sammendrag som kan endre FA målinger. Bruk av andre buffer betingelser som inneholder forskjellige tilsetningsstoffer (som tensides) kan hindre samlet formasjon, om nødvendig.

Vi har jobbet under forutsetning av linearitet av PWM; men kan HIP-FA skaleres for å inkludere alle mulige di-nukleotid mutasjoner av konsensus sekvensen. Til slutt, HiP-FA kan tilpasses å måle andre typer bindende interaksjoner. Forutsetningen er å ha tilgjengelig et passende referanse molekyl bundet av proteinet som kan merkes fluorescently. Med kontrollert levering system, kan en konsentrasjon gradient genereres for alle slags ligand; Derfor kan protein-protein og narkotika-protein interaksjoner måles med tilsvarende Hi-Fi og gjennomstrømning.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker J. Müller for cDNA kloner og medlemmer av Gallia lab, spesielt S. Bergelt, verdifulle råd og dristig diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av SFB 646, regulatoriske nettverk i genomet uttrykk og vedlikehold (C.J., P.B.), Center for integrert Protein Science (UG) og Graduate School for kvantitative biovitenskap München (M.S.). UG anerkjenner støtte ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: ebio - Innovationswettbewerb Systembiologie), og Humboldt-Foundation (Alexander von Humboldt, Professorat).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, O. G., von Hippel, P. H. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).
  2. Hammar, P., et al. Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation. Nature. 451, 535-540 (2008).
  5. Schroeder, M. D., et al. Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila. PLoS Biology. 2, 271 (2004).
  6. He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression. PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).
  7. Wilson, M. D., et al. Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21. Science. 322, 434-438 (2008).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).
  9. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).
  10. Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).
  11. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, (2010).
  12. Berger, M. F., et al. Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities. Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).
  13. Nitta, K. R., et al. Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution. eLife. 4, (2015).
  14. Jolma, A., et al. DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  15. Noyes, M. B., et al. A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system. Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).
  16. Nutiu, R., et al. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology. 29, (2011).
  17. Riley, T. R., et al. SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes. Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).
  18. Maerkl, S. J., Quake, S. R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. Science. 315, 233-237 (2007).
  19. Isakova, A., et al. SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors. Nature Methods. 14, 316-322 (2017).
  20. Jung, C., et al. True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy. Nature Communications. 9, 1605 (2018).
  21. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).
  22. Github. Available from: https://github.com/Reutern/PySite (2018).
  23. Github. Available from: https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA (2018).
  24. Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).
  25. St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-220 (1992).
  26. Pankratz, M., Jäckle, H. The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. Bate, M., Martinez Arias, A. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 467-516 (1993).
  27. Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions. Genetics. 191, (2012).
  28. Noureddine, M. A., et al. Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts. PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).
  29. Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA. Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).
  30. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).
Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).More

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter