Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

doi: 10.3791/58763 Published: February 7, 2019

Summary

Здесь мы представляем новый метод для определения привязки сходство в равновесии и решения с высокой чувствительностью в крупных масштабах. Это улучшает количественный анализ транскрипционным фактором ДНК привязки. Метод основан на измерениях анизотропии автоматизированных флуоресценции в контролируемой поставки системы.

Abstract

Точная количественная оценка транскрипционного фактора (TF)-ДНК взаимодействия имеет важное значение для понимания регуляцию экспрессии генов. Поскольку существующие подходы страдают от значительных ограничений, мы разработали новый метод для определения TF-ДНК привязки сходство с высокой чувствительностью в крупных масштабах. Assay полагается на принципе анизотропии (ФА) установленных флуоресценции но вводит важные технические усовершенствования. Во-первых мы измеряем кривую полный конкурентных титрования FA в одной скважине путем включения дневно обозначенные Справочник ДНК в матрице геля агарозы пористых и TF. Немеченого ДНК олигомера загружается на верхней части как конкурент и путем диффузии, образует пространственно временных градиент. Результирующий градиент FA затем зачитал с помощью заказной эпифлуоресцентного микроскопа установки. Эта улучшенная установка значительно увеличивает чувствительность обнаружения сигнала FA, позволяя слабой и сильной привязки к быть количественную, даже для молекул подобными молекулярными весами проникли. Таким образом мы можем измерить одной кривой титрования за хорошо несколькими хорошо плиты, и через процедуру установки, мы можем извлечь как Константа диссоциации абсолютное (DK), так и концентрацию активных белка. Проверяя все точечные мутации варианты данного консенсуса обязательной последовательности, мы может обследования всей привязки специфика ландшафт TF, обычно на одной пластине. Результирующая позиция вес матрицы (PWM) превосходят тем, производный от других методов прогнозирования в vivo размещение TF. Здесь мы представляем подробное руководство для реализации хип-FA на обычных автоматизированных флуоресцентный микроскоп и конвейер данных анализа.

Introduction

Учитывая центральную роль факторов транскрипции (TFs) в регуляции генов, определение их привязки предпочтений в количественном выражении имеет первостепенное значение. Семенные исследования фон Hippel представил понятие, что регулирующие TFs быстро признать ДНК, таким образом, что их привязки хорошо описана термодинамического равновесия, в то время как управляются вниз по течению событий набора РНК-полимеразы промоутер медленнее кинетики1. Последние в естественных условиях обязательного исследования показывают, что эта картина является вероятно более сложных2,3; Тем не менее эти общие предположения служат хорошей приближений и поддерживали многие вычислительные подходы к найти СНГ регуляторные элементы и предсказать выражение последовательности4,5,6. В то время как равновесие привязки таким образом успешно работают как концепция, текущие методы для определения взаимодействия TF-ДНК сосредоточиться на обязательную силу специфичности и обычно непосредственно не мера привязки сходство в равновесии. Систематическое измерение TF-ДНК привязки представляет собой значительный технический вызов, и существующие методы имеют несколько различные ограничения.

Иммунопреципитации Chromatin, следуют глубокие виртуализации (чип seq)7, наиболее распространенных в vivo технику, не позволяют измерение привязки сходство или точной локализации привязки сайтов в геномной фрагментов. Несколько в vitro методы, включая DNase footprinting8, электрофоретической подвижности сдвига (EMSA)9, поверхностного плазмон резонанс (СРП)10и микромасштабной thermophoresis11 возможность измерить привязки узы, но они являются относительно низкую пропускную способность. И наоборот высокая пропускная способность методы, включая белка привязки microarrays12, HT-SELEX13,14и бактериальных один гибрид (B1H)15 не смогли измерить привязки сродства и обычно дают слишком конкретные обязательные последовательности, которые в основном за счет строгого отбора или мытья необходимые шаги. Более недавние события включают глубокие последовательности на основе хитов-ФЛИП16, SELEX-seq17и на основе микрофлюидика MITOMI18 или улыбка-Seq19, которые позволяют для извлечения близость абсолютной привязки; Однако они полагаются на измерении интенсивности флуоресценции помечены TF и ДНК. Флуоресценции сигналы, таким образом, стать ограничение в концентрациях, низким содержанием белка и в определении низких значений KD (< ~ 10 Нм). Кроме того привязка TF-ДНК в этих методов происходит на тонких поверхностей, поднимая вопросы с неспецифическим привязки или auto флуоресценции фон, который делает его трудно точно подсчитать слабого связывания.

Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали новый метод для определения TF-ДНК сродство ландшафтов в равновесии и решение, которое мы назвали высокой производительности флуоресценции анизотропии (хип-FA)20. Техника на основе установленных флуоресценции анизотропии (ФА) пробирного21 но изменен для измерения привязки константы с высокой чувствительностью и крупномасштабных с помощью заказной автоматизированных микроскоп и анализа установки.

FA assay контролирует взаимодействие дневно обозначенные видов (как ДНК олигомер) партнеру привязки, в данном случае TF, путем измерения молекулярного вращения помечены молекулы. После привязки к TF, скорость его вращения уменьшается из-за более высоких гидродинамических радиус и молекулярный вес связанных комплекса, что приводит к увеличению FA. Точное измерение очень прочное связывание (KD < ~ 1 Нм) требует использования низких концентраций Приклеенные этикетку, ссылка ДНК (c < ~ 1 Нм). Это трудно достичь с коммерческого документа, например стандартного Гонав читателя. Кроме того разница большого размера (10-100 раз) между присоединенным и свободным комплексы обычно необходима, запрещающие измерения взаимодействий между TF связывания доменов и короткие олигомеров ДНК, которые, как правило, примерно одинаковые молекулярных масс . Наконец кривой титрования полный, как правило, требует подготовки и измерения нескольких скважин, содержащие концентрации серии для titrating видов.

Для решения этих вопросов, мы используем widefield микроскопии установки, изменения для достижения высокой определение чувствительности и позволяют FA измерений в различных z позициях одной скважины. Это позволяет нам контролировать привязки взаимодействия между видами аналогичных молекулярной массы и с высокой работоспособностью. Более высокая пропускная способность достигается путем измерения FA в нескольких хорошо пластины форматов и проведении всей титрования серии в одном хорошо с помощью контролируемой поставки системы(рис. 1). Кроме того используя пробирного конкурентоспособной привязки, мы извлекаем не только константы привязки, но и концентрация активных белков. Это важной особенностью assay, поскольку лишь часть молекул выраженной TF являются активными из-за деградации или сворачиванию белков. Экспериментальной установки основан на коммерческих эпифлуоресцентного микроскопа с XY - и Z-пьезо этапов. Мы обновления системы с внешними лазерного возбуждения, а затем обнаружил, что два излучаемого линейная поляризация компонентов на чип EM-ПЗС-камеры с высокой квантовой эффективностью для обнаружения света (рис. 1b и 1 c). Система использует цель высокая числовая апертура (NA), в сочетании с ультра-чувствительных датчиков и таким образом дает высокочувствительный FA измерения. Записывая флуоресценции z стеки, привязки взаимодействия может быть измерена по оптической оси z при использовании гетерогенной матрицы для реагентов. Все эти изменения могут быть легко реализованы в существующей системе и являются экономически эффективными.

Мы используем пробирного конкурентоспособной привязки, в котором сродство немеченого ДНК олигомера измеряется по сравнению с дневно обозначенные ДНК, которая служит ориентиром. TF и ссылка ДНК включены в фиксированной концентрации в пористых агарозы гелевой матрицы (поры размер ~ 1 мкм), который представляет-взаимодействие среды для привязки. Ссылка ДНК помечается Cy5. Этот краситель оказался хорошо подходит для измерений Англии из-за существования относительно длительного флуоресцирования (~ 1нс) и флуоресценции выбросов в far-red видимого спектра (низкий авто флуоресценции фон). TF концентрация наблюдается в молярной сверх Cy5-ссылка ДНК, обеспечивая, что все ссылки ДНК привязан к белка. Решение о неподписанном конкурента ДНК затем осаждается на поверхности геля и рассеивает внутри пористой матрицы, установления градиента концентрации c (z, t) , который изменяется z-положение фокальной плоскости и времени t (Рисунок 1, Рисунок 2a-2 c). Таким образом TF, привязан к ДНК Cy5-ссылка локально подвергается воздействию различных концентраций конкурента ДНК, которая конкурирует для привязки, ведущих к динамически меняющихся FA Cy5-ссылка ДНК FAREF(z, t) (рис. 2b и 2 c).

Для определения концентрации c(z,t) конкурента, мы измеряем в отдельных скважинах (калибровку wells) динамически меняющихся FA сигнал из Голубого Нила (NB) фаNB(z, t) (Рисунок 2и 3). Этот краситель встраивается в ДНК и тем самым выступает в качестве датчика ДНК для конкурента ДНК. С этой контролируемой системы доставки десятки и сотни различных ДНК белковых привязки родство может быть измерена в пределах одной мульти хорошо пластины (96 - или 384-ну формат пластины). До завершения перемещения помечены ссылки ДНК от TF затем последовательно производится измерение. Мы определили специфику привязки для данного фактора путем измерения сходство все 3 N сингл база мутаций консенсуса последовательности длины N. Хип-FA требует небольшое количество белка (~ pmols на кривой титрования) и показывает низкой изменчивости в определении K sD[Коэффициент вариации (кв) < 20%], позволяя измерения в относительно крупных масштабах. Этот метод может осуществляться вручную или полностью автоматизированы с помощью робототехнической системы, что приводит к еще меньше CVs (рис. 4, верхняя группа). Константы диссоциации измеряются с высокой точностью до 0,5 Нм. Для чрезвычайно высокой работоспособностью (KD < 500 м), мы используем стандартные конкурентоспособные титрования (рис. 5) из-за неточности при измерении концентрации ДНК конкурента на низком уровне (< 100 Нм).

Хип-FA могут быть реализованы на почти любой стандарт, перевернутый, флуоресцентный эпифлуоресцентного микроскопа, при наличии автоматизированной XY-стадии и стадии z-axis пьезо. Оптические компоненты были построены вокруг установки автоматизированного widefield, оснащен междугородной цели. На практике assay может быть адаптирована к целям с другими характеристиками (в частности работы, расстояние и числовая апертура). Однако, это требует оптимизации параметров (расстояния между z-фрагменты, пористость и высота геля агарозы и т.д.). Возможно также использование других видов лазеров или камеры. Ниже приводится подробное описание всей экспериментальной процедуры и анализа данных в разделе протокол.

Protocol

1. поляризация микроскопия

  1. Для widefield лазерной подсветки, фокус 638 Нм линии непрерывной диодный лазер (40 МВт) на диафрагме многомодовых оптических кабелей для очистки луча. Подключите линейный поляризатор на выходе волокна для задания поляризации лазерного света.
  2. Блокировать возбуждения компонент испускаемого света с дихроичное зеркало (640 Нм отсечения) и полосовой фильтр (полосовой 700/75).
  3. Пусть флуоресценции сигнала проходят через поляризационные splitter луча, который разбивает его поперек и вдоль поляризованные компонентов испускаемого света. Затем фокус-отражение луча (параллельный компонент) и отраженного луча (перпендикулярных компонент) с ахроматический объектив фокусного расстояния 200 мм на чипе задней подсветкой EM-ПЗС-камеры (рис. 1b и 1 c). Используйте зеркало, чтобы настроить направление перпендикулярной лучу сторону объектива.

2. Разработка и тестирование люминесцентные помечены Ссылка ДНК олигомер

  1. Определить основные последовательность ведения ДНК: метод основан на конкурентных assay который измеряет Константа диссоциации (D2K) между транскрипционный фактор и ДНК олигомера в непомеченном конкурента, который конкурирует для связывания с дневно обозначенные ДНК, чья близость к TF выступает в качестве ссылки (D1K). Последовательность консенсуса, полученные из других источников, как DNase footprinting или бактериальной 1-гибрид может служить в качестве отправной точки5,15.
    Примечание: как правило, подходящую ссылку ДНК имеет 3 – 7 раз снижение сродство для TF, по сравнению с последовательностью консенсуса.
  2. Измерить хип-FA KD1s 2-3 предварительный одного мутаций последовательность консенсуса, полученные на предыдущем шаге. Пытаюсь мутировать позиции в последовательности консенсуса, которые не являются слишком конкретными, чтобы избежать полной потери привязки.
    Примечание: Важно, что последовательность ссылка связана с транскрипционным фактором интереса (мы использовали в этом протоколе гигантских Gt), но не слишком сильно, так что более слабых конкурентов может переиграть его при высоких концентрациях.
  3. Расширение основной мотив (8-12 базы пар вообще) длиной 16 пар оснований или более путем добавления симметрично Фланкируя последовательности в обе стороны (добавить боковой цепи для правильной привязки). При необходимости (для больше biding доменов, например), используйте более последовательностей (до ~ 50 базовый пар в длину были протестированы с Пробирной хип-FA).
    Предупреждение: Будьте осторожны, чтобы не добавить баз, которые, как ожидается, создать внематочная привязки сайтов. Используйте вычислительные инструменты, которые предсказывают сайтов связывания от доступных PWM для облегчения этого процесса (например, PySite22).
  4. Как помечены Ссылка ДНК порядок олигомеров, которые помечены дневно на вперед или обратить вспять прядь на 3 или 5' конца. Использование, например Cy5, Bodipy-650 или любые другие подходящие красителя в концентрации 10 мкм (акции 10 x 100 мкм) в воде и разбавленных поэтапный, как описано в шаге 3.1.
  5. Подготовка 500 мл 1 x буфер привязки, добавив 33 мм калия фосфатного буфера (рН = 7.0), 90 мм NaCl и 0,01% неионные моющего средства в дистиллированной воде. Также подготовьте 3 x привязки буфер, который содержит те же компоненты, за исключением на тройной концентрации. При использовании 3 x привязки буфера как Стоковый раствор для 1 x привязки буфера, подготовьте тома > 500 мл; в противном случае Подготовьте 250 мл.
    Примечание: Эта композиция была оптимизирована для транскрипционного фактора стабильности и предотвращения димеризации глутатион S-трансферазы (GST).
  6. Мера с микроскопии установки описано в шаге 1 FA 200 мкл буфера привязки, содержащий 0,8 Нм, помечены Ссылка ДНК в присутствии различных количество TF в стекло микроскопии 96-луночных днище (5-6 скважин с различной концентрации TF) Определите концентрацию TF для использования. Выполните серию титрования с увеличением количества TF и выбрать для assay концентрации, для которой кривая достигает плато, указанием полного связывания ДНК ссылкой олигомера.
    Примечание: Оптимальная концентрация TF зависит от значения констант диссоциации TF-ДНК. Как правило меньше KDs требуют более низкой концентрации.

3. олигомера отжига

  1. Для отжига ДНК олигомеров помечены ссылки ДНК (последовательности определено в предыдущем шаге), mix 7 мкл 10 мм краситель меченых вперед одноцепочечной ДНК решение и 7 мкл 10 мм концентрации его немеченого обратный дополнением в 186 мкл воды.
  2. Для конкурента последовательностей ДНК, смешать 20 мкл решений 100 мм (в воде, предусмотренного заводом-изготовителем) вперед одноцепочечной ДНК с 20 мкл, 100 мм соответствующего обратного одноцепочечной ДНК для каждой последовательности отдельных конкурентов, чтобы измерить.
  3. Выполните, отжиг отдельно в стандартное PCR циклователь путем нагревать вверх решения до 70 ° C на 3 мин и снижение температуры RT со скоростью 0,1 K/s. Если ПЦР машины используется не поддерживает градиенты температуры в этом случае, просто сделать ступенчатой инкубаций с понижением температуры (испытания были 99 циклов 3 s с K -0.4 за цикл).

4. гель подготовка

Примечание: В следующем разделе объясняется подготовкой двух различных видов гелей: 1 скважин титрования содержат гели с белком и используются для определения KDs для последовательностей ДНК соответствующих конкурента, и 2 скважин калибровки использовать NB к Определение концентрации ДНК в каждый момент времени точки и приобретение высоты. Основное внимание уделяется подготовке эксперимента в 96-луночных пластины, но также указаны соответствующие тома для формат 384-ну пластины.

  1. Растворите 0,5% w/v низкой температурой плавления агарозы в буфере привязки путем кипячения в лаборатории микроволновой печи. После полного растворения Отрегулируйте громкость снова с ddH2O для компенсации возможного испарения.
    Примечание: Для удобства, подготовить запас 10-20 10 мл аликвоты гели и расплавьте их на 75° C, когда они необходимы. Гель запасы могут храниться на RT.
    Предупреждение: Будьте осторожны избежать перегрева решения гелем в микроволновой печи. Короткое время нагрева, которую интервалы встряхивании между предпочтительным.
  2. Подготовить титрования и калибровки скважин, сначала Расплавьте два 10 мл гель запасов аликвоты при 75 ° C при встряхивании.
    1. Используйте 240 мкл (включая 20% накладных расходов) для каждого конкурента (n = количество последовательностей конкурента).
    2. Используйте такой же объем геля для калибровки хорошо NB для обеспечения равной температуре вязкость обоих гелей.
    3. Затем установите температуру до 35 ° C и ждать температуры сбалансировать.
  3. Для титрования скважин, добавить ссылку 1.4 Нм (конечная концентрация) гибридизированных ДНК (полученные в шаге 3), TF белка (конечная концентрация CTF = 20-60 Нм, как определено в шаге 2.6), DTT (0,2 мм) и привязка буфера в общем объеме мкл n x 200 или мкл n x 13 в 96 - или 384-ну пластины формат, соответственно (плюс накладные расходы). Смесь тщательно встряхнув инвертирование / (делать не вихрь).
  4. Медленно добавьте 200 мкл рабочего раствора в скважину в формат (13 мкл/хорошо для 386 скважин) 96-луночных пластины решения гелем подготовлен на предыдущем шаге в скважины титрования хорошо пластины.
  5. Для калибровки скважин, сначала добавьте 5 Нм NB растопленным лари за пределами скважины (общий объем в зависимости от хорошо пластины формат и количество калибровочных скважины; обычно достаточно 5-6 за хорошо пластины).
  6. Пипетка 200 мкл (13 мкл для формат 384-ну пластины) НБ, содержащие гель медленно в течение титрования скважин хорошо пластины и убедитесь в том избежать воздушных пузырей.
    Примечание: Использование электронных пипец или робототехника значительно увеличивает воспроизводимость.
  7. Пусть гель закрепить за 10 мин на RT и еще 10 мин при температуре 4 ° C (удалить конденсат из стекла впоследствии при необходимости). Убедитесь в том, проводить все эти шаги на идеально горизонтальной поверхности, чтобы избежать неоднородных гель поверхностей.
    Примечание: Гелей содержащих белок стабильны обычно по крайней мере несколько часов при 4 ° C.

5. Добавление решения ДНК конкурента

Примечание: Следующие решения должен быть подготовлен перед началом титрования и добавляются поверх калибровки и титрование скважин одновременно.

  1. Добавьте что отожженная помечены Ссылка ДНК и белка в 3 x привязки буфера в 3 раза выше концентрации, чем фондовый аликвоты геля.
    1. Микс 20 мкл полученного раствора с 40 мкл каждого отожженная конкурента ДНК раствор, полученный на шаге 3.
    2. Для каждой калибровки хорошо смешайте 20 мкл 3 x привязки буфер, содержащий 15 мм NB решение с 40 мкл отожженная конкурента ДНК (подходит любой последовательности той же длины).
      Примечание: Для 384-ну пластин, вместо 60 мкл в общей сложности 21 мкл.
  2. При необходимости, проверьте однородность гель высоты уровней в различных скважинах пластины спектроскопически путем измерения оптической плотности на 380 Нм, используя читатель мульти хорошо пластины (поглощение значения пропорциональны высот гель).
  3. 50 мкл (7 мкл для формат 384-ну пластины) смешанного конкурента ДНК решений (отожженная на шаге 3) поверх гели. Попробуйте добавить все решения конкурента как можно одновременно с помощью электронных многоканальные пипетки или 96-канальный дозирования головы, если таковые имеются. После добавления решения конкурента Установите пластину на микроскопа и начать измерения немедленно (шаг 7).

6. изображения приобретение

  1. Последовательно приобрести раз серии z-стеки (например, использование 12 самолетов и 100-300 мс времени освещения). Избегайте taking изображения слишком близко к поверхности хорошо (< ~1.4 мкм с пластин, используемых в настоящем документе) исключить какой-либо предвзятости поляризации.
  2. Выполнение 10-25 циклов измерений до полной отмены привязки помечены Ссылка ДНК от TF. Конечной точки обычно достигается через 1-2 ч, в зависимости от привязки кинетики и температуропроводности конкурента ДНК.

7. Добыча FA(z,t) от необработанных данных

  1. После того, как хорошо пластины были образы, вычислить из изображений raw флуоресценции средняя пикселов регионов, представляющих интерес для (I=) параллельно и перпендикулярно (I+) поляризованных интенсивности компонентов (рис. 1c). Это можно сделать автоматически с помощью программного обеспечения хип-FA23.
    Примечание: Программное обеспечение хип-фа, инструкция по эксплуатации и набора тестов могут быть скачаны23. Можно также используйте любой другой заказ программное обеспечение для извлечения я= и я+ и вниз по течению анализ кривых титрования, как подробно описано ниже.
  2. Вычислить FA для каждой скважины. Для каждой скважины сценарий вычисляет FA(z,t) каждой позиции z и времени точки t согласно:
    Уравнение 1:Equation 1
    Где G-G-фактор, который исправляет инструмент для любой уклон в сторону канала перпендикулярная.
  3. Определите G-фактор микроскопии установки путем измерения FA любых решений, содержащих Люминесцентную краску известных анизотропии. Извлеките компоненты два поляризация сигнала, а затем использовать уравнение 1 для получения G, зная Англии решения (G = 1,15 в этой установки).

8. Калибровочная кривая для определения концентрации ДНК конкурента из АнглииNB

  1. Отжиг 120 мкл каждого прямого и обратного ссылка олигомера (фондовых концентрации 100 мм; любой случайной последовательности с той же длины, как конкурент последовательности могут быть использованы) и смешать с 120 мкл 3 x привязки буфер, содержащий NB (15 Нм).
  2. Подготовьте серию разрежения с разведения 1:2 в 1 x привязки буфер с 6 разведений в общей сложности. Mix 50 мкл этих разведений с 200 мкл геля агарозы (T > 35 ° C) низкой температурой плавления 0,5% в 1 x привязки буфер, содержащий 5 Нм NB в triplicates.
  3. Добавить 200 мкл каждого из 6 решений, подготовленные на предыдущем шаге в 96-луночных пластине и хранить пластину за 1 час при температуре 4 ° C для обеспечения полной гелеобразования, затем 1 ч на RT. мера FANB решения с помощью программы установки хип-FA.
  4. Извлечь FANB (z, t) согласно предыдущему шагу и подходят данные с помощью Хилл уравнение:
    Уравнение 2:Equation 2
    Где CДНК является концентрация ДНК олигомера; k концентрация ДНК олигомеров на котором половина сайтов связывания заняты; FAМакс является константа нормализации; и n -коэффициент Хилл. k, FAМакс и n устанавливаются как свободные параметры во время процедуры установки.
  5. Введите три параметры, полученные из процедуры установки программного обеспечения хип-FA (в левом нижней панели).
  6. Повторите определения калибровочной кривой каждые несколько месяцев или после внесения изменений в настройку микроскопии.

9. Определение концентрации ДНК конкурента

  1. Используйте программное обеспечение хип-FA для извлечения c (z, t) из АнглииNB(z, t) измерений (рис. 3). Сначала получить калибровочной кривой, как описано в предыдущем разделе и введите параметры установки программного обеспечения (см. Руководство для подробной информации).
  2. Используйте программу для автоматически экстраполировать c(z,t) для c < 100 Нм (см. Руководство для подробной информации) с помощью уравнения 3 (рис. 3b), который описывает одномерный диффузии участник ДНК в матрице геля агарозы, предполагая, Бесплатные диффузии.
    Уравнение 3:Equation 3
    Где C0 является начальной концентрации конкурента ДНК; ERF — функция ошибок; z — позиция; D – коэффициент диффузии конкурента ДНК; и t0 время начала измерений. Бесплатный используемые параметры являются C0 и z /Equation 4.

10. обычных конкурсных титрования с хип FA для привязки очень сильный ДНК

  1. Серийно разбавить олигомеров ДНК различных конкурента в строках 96-луночных плиты (или 384-ну пластины) в концентрации: 0, 1.25, 3.5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900 и 4000 Нм. Добавьте ссылку на Cy5-меченых ДНК (1 Нм) и TF (20-50 Нм) в постоянной концентрации, с общим объемом 200 мкл в колодец в буфере привязки (Рисунок 5). Подождите 40 мин до достижения термодинамического равновесия и приобрести (с установки хип-FA) z стеки для каждой скважины (приобретение нескольких изображений на хорошо снижает изменчивость путем усреднения рассчитанные значения FA).
  2. Построить кривых титрования привязки равновесия и подходят им с 4 уравнением (рис. 5b). KDs определяется путем обычных конкурсных титрования идентичны тем, которые получаются путем хип-FA с использованием геля агарозы матрицы20.

11. Установка процедура кривых титрования фа

  1. Отображение в программное обеспечение хип-FA реконструированный титрования кривых для отдельных конкурента последовательностей FA(z,t) = f[c(z,t)] и визуально проверить качество данных (см. Руководство для подробной информации). При необходимости, уточните параметры, используемые для определения концентрации ДНК конкурента на шаге 10.
  2. Установите каждый индивидуальный титрования кривой автоматически с помощью уравнения 4, который дает аналитического решения для конкурентоспособных титрования анализов24.
    Уравнение 4:Equation 5
    С:Equation 6
    Equation 7
    Equation 8
    Equation 9
    Где RT является концентрация белка; LT немеченого и LST помечены концентрации ДНК; KD2 — Константа диссоциации определено; RT является концентрация активных белка; и нормализацию параметров A и B .

    Сначала следует Определите KD1, который служит ориентиром для определения различных значений KD2 . KD1 – можно легко определить с assay, выбрав последовательность ДНК краситель ссылку как последовательность немеченого конкурента ДНК (см. руководство).
  3. Введите полученное значение KD1 в программном обеспечении и вычислить значения KD2 для всех конкурентов ДНК на плите.
    Примечание: Бесплатный параметры процедуры установки являются KD2, RT, A и б.
  4. Экспортируйте Константа диссоциации KD2 и концентрация активных протеина RT для всех скважин отдельных титрования пластины, нажав кнопку «Экспорт» в программном обеспечении.

12. ШИМ строительство, специфика взаимодействия протеин дна, и псевдо графов

Создание последовательности логотипов для различных PWM, используя онлайн-инструмент WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi), как описано выше20.

Representative Results

Мы применили хип-FA к TFs сегментации гена сети25,26, который генерирует шаблон передней задней тела дрозофилы эмбрионов, главным образом через регуляцию. От этой сети, мы выбрали bZIP домена гигантских TF (Gt) для детального анализа (рис. 4). Так как полнометражный транскрипционных факторов трудно выразить и принести основном же настройки привязки как их ДНК связывания доменов (DBD)13, мы использовали ДБД, сливается с GST и выразил конструкции в E.coli GST синтез белков для доставить те же результаты, как DBDs только20.

Gt последовательность консенсуса (TTACGTAAC) представляет собой сильнейших привязки последовательность, которые мы определили как описано выше. Затем мы исследовали влияние на энергия всех возможных точечные мутации в пределах 10-mer Gt консенсуса последовательности (в общей сложности 30), обрамленная дополнительные основания на 5' и 3' концах. Мы измерили два реплицирует гель, образцы которых были произведены с помощью автоматизации и один дополнительный репликацию производится вручную для сравнения. KDs составляли от 0,6 до > 2000 Нм для поодиночке мутировавших последовательностей, и мы также подтвердили полное отсутствие привязки к последовательности «обязательной» (данные не показаны).

Особенности привязки TF-ДНК обычно моделируются с использованием матрицы вес позиции (PWM), в котором оценка присваивается каждой возможной нуклеотидов в каждой позиции в привязке мотив. ШИМ предполагает, что каждая позиция способствует обязательной силы самостоятельно и в большинстве случаев представляет собой модель достаточно для привязки предпочтений27TF. Мы создали пересмотренные PWM, основанный на наших измерениях сродство ниже установленных процедур28,29 и сравнили их двух PWM сообщалось ранее в литературе. Первый основан на нуклеотид частоты пунктам от привязки сайтов определяется ДНК footprinting4,5, и второй PWM было получено в результате бактериальной выбор один гибрид (B1H). 15

Высокое сходство PWM для трех реплицирует (рис. 4, верхняя группа), в том числе для образца подготовлен вручную (повторить 3), демонстрирует высокую воспроизводимость метода хип-FA. Хотя PWM, полученные хип-FA общий похож на полученной PWM с другими методами (рис. 4, Нижняя панель), есть значительные отклонения: в положении 2 (черная стрелка), начало основной мотив bZIP, мутации T > (G, C, A) приведет к Полная потеря привязки в мотив, полученные хип-фа, которая согласуется с B1H мотив, но не с тем полученные с footprinting DNase, в котором привязка остается относительно сильный, для основания (G, A). И наоборот, в положение 7 (серая стрелка), мутация T > C приводит к гораздо более обязательный характер, чем то, что ожидалось, основанный на ранее измеренных PWM.

Другие отклонения тонкие, но не менее важное значение. В целом PWM хип-фа является менее конкретным, чем два других, отражает тот факт, что многие мутации от консенсуса по-прежнему приводят в умеренно прочное связывание. Это может быть количественно с помощью информационного содержания (IC). IC составляет 11,5 бит хип-FA матрицы (в среднем три реплицирует), по сравнению с IC = 13.4 битов и 16,8 битов для DNase footprinting и B1H матрицы, соответственно. Как правило (хотя и не везде), PWM, полученные хип-FA менее конкретным, чем те, полученные другими методами, основанные на 26 TFs расследование20.

Figure 1
Рисунок 1:схема изображения хип-FA пробирного и экспериментальной установки. () системы доставки гель для титрования конкурента ДНК в одиночных скважин. (b) хип-FA микроскопии установки. Настроить автоматизированный widefield микроскоп с легкой поляризации флуоресценции обнаружения на EM-ПЗС-камеры. (c) Raw флуоресценции изображение с двумя областями интереса, используемых для определения параллельных (красный) и перпендикулярно поляризованные (зеленый) компоненты. (d) типичная схема 96-луночных плиты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Raw FA данных и кривых титрования реконструированный. (a) типичный FA(z,t) траектории для калибровки, также содержащий NB. (b, c) FA(z,t) время траекторий для двух скважин титрования, измерения привязки к сильным (b) и более умеренным (c) ДНК связывания конкурента. (d, e) Соответствующие реконструированный FA титрования измерений и установлены кривых для сильных (d) и умеренных (e) привязки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Определение концентрации ДНК c конкурента (z, t) с использованием Голубой Нил (NB). (a) FA-концентрация Калибровочная кривая для 16 пар оснований ДНК олигомеров. В серию обычных титрования NB встроен в агарозном геле вместе с различной концентрации конкурента ДНК. Сродство NB ДНК-последовательности независимые20; Таким образом, же калибровочных кривых может использоваться для определения c (z, t) для различных последовательностей ДНК одинаковой длины. (b) конкурента профиль диффузии время ДНК на высоте произвольного z определяется с использованием пяти калибровочных скважины. Для каждого измерительного цикла средняя ФАС четырех скважин, NB-содержащих отображаются в виде белых точек. Кривые установлены с помощью уравнения 3 (белая линия, отдельных скважин в цвет) и c (z, t) в низких концентрациях (C < ~ 100 Нм) определяется кривой экстраполированная фитинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Привязка специфики bZIP домена семьи гигантских TF (Gt). PWM хип-FA из трех реплицирует: два подготовлен с использованием автоматизации и один вручную подготовлен (Верхняя панель) по сравнению с PWM DNase footprinting и бактериальных один гибрид (B1H) метод отбора (Нижняя панель). В целом мотивы привязки хип-FA согласны с предыдущих данных, но также показывают существенные различия, как видно с черным и серым стрелки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Обычных конкурсных титрования с хип-FA. () пластина дизайн показывает 8 ДНК различных конкурентов, серийно разводили в буфере привязки в одной строке 96-луночных плиты. Для разных произвольных привязки сильные показана тепла карта Англии. (b) конкурентные титрования три конкурента ННО привязка к Bcd TF с различными сродства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Хип-фа является всеобъемлющий новый метод для определения привязки предпочтений пейзажи TF-ДНК взаимодействий. Он измеряет привязки сходство мутационного ДНК мотив вариантов непосредственно, избегая любых лежит предположение о том, что настройки привязки, отражены в повторяемости нуклеотидов в наборе выше порога вяжущих материалов. Измерение происходит в раствор без иммобилизации и механического или химического вмешательства с реакции, привязки, максимально приближаясь условия равновесия. Контролируемые системы доставки позволяет измерение кривой полной титрования в пределах одного хорошо и увеличивает пропускную способность и надежность при сохранении белка. Цель с помощью высокая числовая апертура и EM-CCD камера с эффективностью высокого света коллекции позволяет высокочувствительный флуоресцентный свет обнаружения. Таким образом с этой установки, малые FA изменения как низко как 10-15 mP может быть точно обнаружен; на практике это означает, что любой реакции привязки, для которых легко обнаруживается увеличение массы после привязки является минимальным (как низко как массе 2). Обычно, это не в случае с коммерческих систем как Гонав читателей. Из-за его высокой чувствительности хип-FA расширяет спектр константы диссоциации, которые могут быть надежно измерены в picomolar диапазоне. Связывание энергий определяются точно на несколько порядков.

Чтобы оценить качество пересмотренной PWM, мы провели два типа анализа20. Для пяти факторов сегментации сети гена, мы проверили, насколько различные PWM может предсказать экспериментальный чип seq профили в геномной регионах 21 сегментации генов. Как второй тест мы использовали выражение последовательности модель4 , который предсказывает, выражений шаблонов сегментации усилители на основе привязки предпочтений и белка концентрацию участвующих TFs. В обоих учений, мы обнаружили, что менее конкретным PWM хип-FA выполняют значительно лучше, чем более конкретные footprinting и PWM B1H20.

В отличие от методов de novo хип-FA требует некоторых предварительных знаний о данной TF привязки предпочтений. Однако консенсус последовательности известны многие TFs, и многие существующие методы могут поставлять их13,14,15. При необходимости, можно многократно найти истинный оптимальное связывание последовательность.

Мы использовали ДНК ссылкой олигомеров дневно помечены Cy5 и Bodipy-650. Эти красители оказались выполнять хорошо для Англии измерений, поскольку анизотропии связанные и несвязанные помечены Ссылка ДНК были крупнейшим среди различных проверенных красители. Это обеспечивает максимальный динамический диапазон для ОС ценностей. Как правило, любой Люминесцентную краску с флуоресцентным жизни ≥ 1 ns вероятностью может оказаться подходящим, но необходимо сначала протестированы. Если это возможно рекомендуется использовать красители флуоресцирующих в ближнем ИК диапазоне для сведения к минимуму аутофлюоресценция белка.

Наиболее важным этапом экспериментальной процедуры является дозирование гель в хорошо пластины. Хорошая воспроизводимость результатов требует гель томов быть максимально однородные. Изменения в высоте гель переводятся на изменения температуропроводности для конкурентоспособных олигомера в ДНК и таким образом в очевидной изменения сродства при оценке данных. Это является основным источником вариативность в технических репликации. Использование электронных методов пипетки или автоматизации улучшает воспроизводимость. Пузырьки воздуха внутри гель можно избежать, медленно и тщательно закупорить. Это также важно для добавления всех решений конкурентов на вершине титрования скважин с как мало задержки как можно. Для лучших воспроизводимости весь процесс можно автоматизировать с помощью робота дозирования с тепла инкубаторы. Важнейшим элементом для передачи протокола для автоматизации является необходимой оптимизации инкубатор температуры и время инкубации. Убедитесь в том найти оптимальный баланс между вязкости геля (т.е., не слишком холодно) и стабильность белков (то есть, не слишком жарко). Это зависит от того, как на дозирования скорость гели в колодцы и стабильности белка используется.

Хип-FA позволяет использовать контролируемые системы доставки для ДНК олигомеров конкурента. Для построения кривых титрования, это необходимо для определения концентрации ДНК конкурента c(z,t) , для каждой заданной z-позиции в пределах матрицы геля и времени точки t. Это еще один критический шаг, так как определение KDs напрямую зависит от c(z,t). Калибровка скважин, содержащий краситель NB как датчик для концентрации ДНК используются для этой цели (рис. 1d, рис. 2). Обычно достаточно 3-5 калибровки скважинах содержащих NB за тарелку. До оценки любого хип-FA эксперимент, NB калибровочной кривой должна быть построена для установки, выполняя обычные титрования серии NB, растворенного в агарозном геле с конкурентом ДНК любой последовательности в различных концентрациях (Рисунок 3 ), как подробно описано в шаге 8. В случае очень прочное связывание (KD < 500 м), экстраполяции, используемые для определения низких концентраций конкурента ДНК становится ограничения, поскольку она является менее точным, чем прямое измерение. Однако для TFs с такой низкой KDs, хип-FA установка может использоваться для выполнения обычных конкурсных титрования в буфере привязки без использования матрицы геля агарозы (рис. 5). Например один полный титрования с 12 различных концентраций конкурента ДНК может выполняться в одной строке 96-луночных плиты.

Контролируемые поставки системы также требует быстро TF-ДНК привязки кинетики и стабильной белков, начиная с распространения хотя геля агарозы динамические (хотя медленно). Оба свойства может быть проверена непосредственно с хип-FA установки ниже, со временем, FA TFs интерес, когда обязан их соответствующих дневно помечены Ссылка ДНК. Мы измеряетсяна K и KOFF ставки для исследуемых факторов и нашел их в порядке миллисекунд до секунд20, в соответствии с другим исследования30. Это достаточно быстро, чтобы обеспечить измерения в равновесии. В случае других реакций связывания с медленнее кинетики снижение его концентрации или уменьшая размер поры геля могут быть настроены температуропроводности конкурента. В случае испытания TFs, которые все имеют быстрый TOFF (~ секунд), общее измерение время около 1-2 h является достаточным для обеспечения термодинамическое равновесие в каждом измерении.

Еще одна потенциальная проблема, связанные с белок является формирование агрегатов белков, которые могут изменить измерения FA. Использование других условий буфера, содержащих различные добавки (как тензиды) может предотвратить совокупного образования, при необходимости.

Мы работали под допущение линейности ШИМ; Однако хип-FA могут быть расширены включить все возможные ди нуклеотида мутации консенсуса последовательности. Наконец хип-FA могут быть адаптированы для измерения других типов привязки взаимодействий. Предпосылкой является иметь доступные молекула подходящую ссылку связаны белка, который можно дневно обозначить. С управляемой системы доставки градиента концентрации могут быть созданы для любого вида лигандом; Таким образом взаимодействия протеин протеина и наркотиков белка может быть измерена с аналогичным образом высокой верности и пропускную способность.

Disclosures

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим J. Мюллер клонов cDNA и члены лаборатории Галлии, в частности S. Bergelt, за ценные советы и оживленные дискуссии. Эта работа была поддержана SFB 646, регулирования сети в выражение генома и техническое обслуживание (C.J., п.б.), центр для комплексного Наука белка (уг) и высшая школа для количественных Biosciences Мюнхен (магистра). Гентский университет признает поддержку, Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), Bundesministerium und für Bildung Тюрингия (BMBF: ebio - Innovationswettbewerb Systembiologie) и Гумбольдт-фонд (Александр фон Гумбольдт, Профессора).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, O. G., von Hippel, P. H. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).
  2. Hammar, P., et al. Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation. Nature. 451, 535-540 (2008).
  5. Schroeder, M. D., et al. Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila. PLoS Biology. 2, 271 (2004).
  6. He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression. PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).
  7. Wilson, M. D., et al. Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21. Science. 322, 434-438 (2008).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).
  9. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).
  10. Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).
  11. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, (2010).
  12. Berger, M. F., et al. Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities. Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).
  13. Nitta, K. R., et al. Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution. eLife. 4, (2015).
  14. Jolma, A., et al. DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  15. Noyes, M. B., et al. A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system. Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).
  16. Nutiu, R., et al. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology. 29, (2011).
  17. Riley, T. R., et al. SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes. Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).
  18. Maerkl, S. J., Quake, S. R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. Science. 315, 233-237 (2007).
  19. Isakova, A., et al. SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors. Nature Methods. 14, 316-322 (2017).
  20. Jung, C., et al. True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy. Nature Communications. 9, 1605 (2018).
  21. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).
  22. Github. Available from: https://github.com/Reutern/PySite (2018).
  23. Github. Available from: https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA (2018).
  24. Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).
  25. St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-220 (1992).
  26. Pankratz, M., Jäckle, H. The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. Bate, M., Martinez Arias, A. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 467-516 (1993).
  27. Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions. Genetics. 191, (2012).
  28. Noureddine, M. A., et al. Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts. PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).
  29. Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA. Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).
  30. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).
Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).More

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter