Här presenterar vi en nya metoden för att fastställa bindande tillhörighet vid jämvikt och i lösning med hög känslighet i stor skala. Detta förbättrar kvantitativ analys av transkription faktorn-DNA-bindning. Metoden är baserad på automatiserade fluorescens anisotropi mätningar i en kontrollerad leverans system.
Exakt kvantifiering av transkriptionsfaktor (TF)-DNA interaktioner är viktigt för att förstå reglering av genuttryck. Eftersom befintliga strategier lider betydande begränsningar, har vi utvecklat en ny metod för att bestämma TF-DNA bindande samhörighet med hög känslighet i stor skala. Analysen bygger på etablerade fluorescens anisotropi (FA) principen men introducerar viktiga tekniska förbättringar. Först, vi mäter en full FA konkurrenskraftiga Titrerkurvan i en enda väl genom att införliva TF och fluorescently märkta referens DNA i en porös agaros gelmatris. Omärkta DNA oligomer är laddad på toppen som en konkurrent och genom diffusion, bildar en plats och tid övertoning. Den resulterande FA-gradienten läses sedan upp med en anpassad epifluorescence Mikroskop setup. Denna förbättrade inställning ökar känsligheten hos FA signal upptäckt, så att både svaga och starka bindning till kvantifieras på ett tillförlitligt sätt, även för molekyler av liknande molekylvikter. På detta sätt, vi kan mäta en Titrerkurvan per brunn flera platta och genom montering förfarande, vi kan extrahera både absoluta dissociationskonstant (KD) och aktiva proteinkoncentration. Genom att testa alla enpunkts-mutation varianter av ett visst samförstånd bindande sekvens, kan vi överblicka hela bindande specificitet landskap av en TF, vanligtvis på en enda plåt. De resulterande position vikt matriserna (PWMs) överträffa dem härrör från andra metoder att förutsäga i vivo TF beläggning. Här presenterar vi en utförlig guide för att genomföra HiP-FA på konventionella automatiserade fluorescerande Mikroskop och data analys pipeline.
Gett den centrala rollen som transkriptionsfaktorer (TFs) i genreglering, att fastställa sina bindande preferenser på ett kvantitativt sätt är av största vikt. Banbrytande studier av von Hippel infördes uppfattningen att föreskrivande TFs snabbt erkänna DNA, så att deras bindning är väl beskrivna av den thermodynamic equilibriumen, medan nedströms händelserna rekrytera RNA-polymeras att arrangören styrs av långsammare kinetik1. Senaste in-vivo studier tyder på att denna bild är sannolikt mer komplexa2,3. dock dessa allmänna antaganden fungera som bra approximationer och stött många beräkningsvetenskapliga metoder för att hitta cis-reglerande element och förutsäga uttryck från sekvenser4,5,6. Medan jämvikt bindande har således lyckat använts som begrepp, nuvarande metoder för att bestämma TF-DNA interaktioner fokuserar på bindande specificitet och vanligtvis inte direkt åtgärd bindande tillhörighet vid jämvikt. Systematisk mätning av TF-DNA-bindning representerar en stor teknisk utmaning, och de befintliga metoderna har flera olika begränsningar.
Kromatin immunoprecipitation följt av djupa sekvensering (ChIP-seq)7, vanligaste i vivo tekniken, tillåter inte mätning av bindande tillhörighet eller exakt lokalisering av bindande platser inom genomisk fragment. Flera in vitro- metoder, inklusive DNAS Footprints8, elektroforetiska mobilitet Skift (EMSA)9, ytan plasmon resonans (SPR)10och hur provtagningsutrustningen skall thermophoresis11 är kunna mäta bindande tillhörighet, men de är relativt låg genomströmning. Däremot är hög genomströmning tekniker inklusive protein bindande microarrays12, HT-SELEX13,14och bakteriell one-hybrid (B1H)15 inte kunna mäta bindande samhörighet och vanligtvis ger alltför specifika bindande sekvenser, främst på grund av det stränga urvalet eller tvätt steg nödvändigt. Nyare utvecklingar inkluderar djupsekvensering baserat HiTS-FLIP16, SELEX-seq17, och mikrofluidik-baserade MITOMI18 eller leende-Seq19, som möjliggör utvinning av absolut bindande tillhörighet; dock de förlitar sig på att mäta fluorescens intensiteter av märkta TF och DNA. Fluorescens signaler, därför blir begränsande vid låg protein koncentrationer och att fastställa låga KD -värden (< ~ 10 nM). Dessutom finns TF-DNA bindning i dessa metoder, som äger rum på tunna ytor, att ta upp frågor med ospecifik bindning och/eller auto-fluorescens bakgrund, vilket gör det svårt att exakt kvantifiera svag bindning.
För att hantera dessa begränsningar, har vi utvecklat en ny metod för att bestämma TF-DNA affinitet landskapet vid jämvikt och i lösning, som vi kallade högpresterande fluorescens anisotropi (HiP-FA)20. Tekniken är baserad på etablerade fluorescens anisotropi (FA) assay21 men ändrades för att mäta bindande konstanter med hög känslighet och på storskaliga använder en anpassad automatiserad mikroskopet och analys setup.
FA analysen övervakar växelverkan av fluorescently märkta arter (som en DNA oligomer) till en bindande partner, i detta fall en TF, genom att mäta molekylär rotation av märkt molekylen. Vid bindning till TF minskar dess rotationshastighet på grund av den högre hydrodynamiska radien och molekylvikt av bundna komplexet, vilket resulterar i ökad FA. Korrekt mätning av mycket starka bindning (KD < ~ 1 nM) kräver användning av låga koncentrationer av märkt, referens DNA (c < ~ 1 nM). Detta är svårt att uppnå med ett kommersiellt medel som en standard microplate reader. Dessutom är en stor storlek skillnad (10 – 100-faldigt) mellan de bundna och obundna komplex oftast nödvändigt, förbjuda mätning av interaktioner mellan TF bindande domäner och korta DNA-oligomerer, som vanligtvis är av ungefär samma molekylvikt . Slutligen, en full Titrerkurvan normalt kräver förberedelse och mätning av flera brunnar innehållande en koncentration serie för titrering arter.
För att lösa problemen, använder vi en widefield mikroskopi setup, modifierad för att uppnå hög upptäckt känslighet och tillåta FA mätningar vid olika z-positioner för en enda brunn. Detta gör det möjligt för oss att övervaka bindande interaktioner mellan arter av liknande molekylvikt och med hög affinitet. Högre dataflöde uppnås genom att mäta FA i flera platta format och utför en hela titrering serie i en väl kontrollerad leverans system med (figur 1en). Genom att anställa en konkurrenskraftiga bindande assay, extrahera vi dessutom inte bara bindande konstanterna utan också koncentrationen av aktivt protein. Detta är ett viktigt inslag i analysen, eftersom endast en del av de uttryckta TF-molekylerna är aktiva på grund av protein Skellefteåsjukan eller nedbrytning. Den experimentella setup är baserad på en kommersiell epifluorescensmikroskop utrustad med XY – och Z-piezo stadier. Vi uppgraderade systemet med externa laser excitation, sedan upptäckt två utsända linjär polarization komponenter på chip i en EM-CCD-kamera med hög quantum effektivitet för lättare identifiering (figur 1b och 1 c). Systemet använder en hög numeriska bländaröppningen (NA) mål kopplat till en extremt känslig sensor och således ger mycket känsliga FA mätningar. Genom att registrera fluorescens z-stackar, kan bindande interaktioner mätas längs optiska z-axeln när du använder en heterogen matris för reaktanterna. Alla dessa modifieringar lätt kan genomföras på ett befintligt system och är kostnadseffektiva.
Vi anställer en konkurrenskraftiga bindande analys där affinitet av en omärkt DNA oligomer mäts i jämförelse med fluorescently märkta DNA, som fungerar som en referens. TF och referens DNA införlivas vid fasta koncentrationer i en porös agaros gelmatris (por storlek ~ 1 µm) som utgör en icke-interagera miljö för bindningen. Hänvisningen DNA är märkt med Cy5. Detta färgämne visade sig vara väl lämpad för FA mätningar på grund av dess relativt lång fluorescens livstid (~ 1ns) och fluorescens utsläpp i den mån av det synliga spektrumet (låg auto-fluorescens bakgrund). TF koncentrationen är i molar överskott över Cy5-referens DNA, att säkerställa att alla referens DNA är bundet till protein. En lösning av omärkta konkurrent DNA sedan deponeras på gel ytan och diffunderar inne i porösa matrisen, upprätta en koncentrationsgradient c (z, t) som ändras över z-fokalplanet och tiden t (figur 1a, figur 2a-2 c). TF bunden till Cy5-referens DNA är således lokalt utsatt för olika koncentrationer av konkurrenten DNA som tävlar för bindande, vilket leder till ett dynamiskt föränderliga FA av Cy5-referens DNA FAREF(z, t) (figur 2b och 2 c).
För att avgöra den konkurrent koncentrationen c(z,t), vi mäter i separata brunnar (kalibrering brunnar) dynamiskt föränderliga FA signal för Nilen blå (NB) FANB(z, t) (figur 2en och 3). Denna färg intercalates i DNA och fungerar därmed som en DNA sensor för konkurrenten DNA. Med denna kontrollerad leverans system, kan tiotals till hundratals olika DNA-protein bindande tillhörighet mätas inom en flera platta (96 – eller 384-bra platta format). Mätningen utförs sedan sekventiellt tills fullständig förskjutning av den märkta referensen DNA från TF. Vi fastställt bindande specificiteten för en given faktor genom att mäta tillhörighet av alla 3 N enda-base mutationer av samförstånd sekvensen av längden N. HipHop-FA kräver låga mängder protein (~ pmols per Titrerkurvan) och visar låg variabilitet vid fastställandet av KDs [koefficient av variation (CV) < 20%], samtidigt som mätningar i relativt stor skala. Metoden kan utföras manuellt eller helt automatiserad använder ett robotsystem, vilket resulterar i ännu lägre CVs (figur 4, övre panelen). Dissociation konstanter mäts med hög noggrannhet ner till 0,5 nM. För extremt hög affinitet (KD < 500 pM), vi använder en standard konkurrenskraftiga titrering (figur 5) på grund av felaktigheter i mäta konkurrent DNA koncentrationer på låga nivåer (< 100 nM).
HipHop-FA kan tillämpas på nästan alla standard, inverterad, fluorescerande epifluorescensmikroskop, förutsatt tillgängligheten av en automatiserad XY-etapp och en piezo z-axeln. Optiska komponenter byggdes runt en automatiserad widefield setup utrustad med en långväga mål. I praktiken kan analysen anpassas till målen med andra egenskaper (särskilt arbets-, avstånd- och numerisk bländare). Men detta kräver optimering av parametrarna (avstånd mellan z-segment, porositet och höjd av agarosgel, etc.). Användning av andra typer av lasrar eller kamera är också möjligt. En detaljerad beskrivning av hela experimentella förfarandet och dataanalys ges nedan i avsnittet protokoll.
HipHop-FA är en omfattande ny metod för att fastställa bindande preferens landskap av TF-DNA interaktioner. Den mäter bindande tillhörighet mutationsanalys DNA motiv varianter direkt, att undvika eventuella underliggande antagandet att bindande inställningar återspeglas i frekvensen nukleotid i en uppsättning av ovan-tröskel bindemedel. Mätning sker i lösningen utan immobilisering och mekaniska eller kemiska störningar med bindande reaktionen, tillnärma jämvikt villkor så nära som möjligt. Kontrollerad leverans systemet tillåter mätning av en full Titrerkurvan inom en enda väl och ökar både genomströmning och tillförlitlighet samtidigt spara protein. Med ett mål med en hög numerisk bländare och EM-CCD-kamera med en hög ljus insamlingskapacitet tillåter för mycket känsliga fluorescerande ljus upptäckt. Därför med denna setup ändras små FA så låg som 10-15 mP kan identifieras korrekt; i praktiken innebär detta att någon bindande reaktion som upptäcks lätt massa ökningen efter bindande är minimal (så lågt som en massa förhållandet 2). Detta är vanligtvis inte fallet med kommersiella system som mikroplattan läsare. På grund av dess höga känslighet utökar HiP-FA räckvidden för dissociation konstanter som kan mätas på ett tillförlitligt sätt in i picomolar spänner. Bindande energier bestäms exakt över flera tiopotenser.
För att utvärdera kvaliteten på de reviderade PWMs, utfört vi två typer av analys20. Vi testade, för fem faktorer av segmentering gen nätverket, hur väl olika PWMs kan förutsäga experimentella ChIP-seq profiler i genomisk regionerna av 21 segmentering gener. Som ett andra test använde vi en sekvens-till-uttryck modell4 som förutspår uttrycksmönster av segmentering förstärkare på grundval av bindande preferens och protein koncentrationen av deltagande TFs. I både övningar, fann vi att den mindre specifika HiP-FA PWMs presterar betydligt bättre än den mer specifika Footprints och B1H PWMs20.
Till skillnad från de novo metoder kräver HiP-FA vissa förkunskaper om en given TFS bindande preferens. Men samförståndet sekvenser är känd för många TFs och många befintliga metoder kan förse dem13,14,15. Om det behövs kan sekvensen sant optimala bindande hittas iterativt.
Vi använde DNA referens oligomerer fluorescently märkt med Cy5 och Bodipy-650. Dessa färgämnen har visat för att utföra väl för FA mätningar sedan anisotropin bundna och obundna märkt-reference DNA var den största bland de olika testa färgämnena. Detta garanterar en maximal dynamiska räckvidd för FA värden. I allmänhet någon fluorescerande färgämne med en fluorescens livslängd ≥ 1 ns sannolikt kommer att vara lämpliga men måste testas först. Om möjligt är det klokt att använda färgämnen som fluorescerar i intervallet nära-IR för att minimera protein autofluorescens.
Det mest kritiska steget av experimentella förfarandet är den pipettering av gelen väl plattorna. Bra reproducerbarhet kräver gel volymerna vara så enhetliga som möjligt. Förändringar i gel höjd översätts till förändringar av diffusivitet för den konkurrenskraftiga DNA oligomer, och därmed uppenbara förändringar av tillhörighet när utvärdering av data. Detta är den huvudsakliga källan av variansen i en tekniskt replikera. Användning av en elektronisk Pipettera eller automation teknik förbättrar reproducerbarhet. Luftbubblor i gelen kan undvikas genom långsam och försiktig pipettering. Det är också viktigt att lägga till alla konkurrent lösningar ovanpå titrering brunnarna med som liten fördröjning som möjligt. För bästa reproducerbarhet, kan hela processen automatiseras med hjälp av en pipettering robot med värme inkubatorer. En viktig del för att överföra protokollet till automation är nödvändig optimering av inkubator temperatur och inkubationstider. Se till att hitta en optimal balans mellan viskositeten av gelen (dvs., inte för kallt) och stabiliteten i proteiner (dvs, inte för varmt). Detta beror både på gelerna tubens hastighet in i brunnar och stabilitet av protein används.
HipHop-FA använder sig av en kontrollerad leveranssystem för de konkurrent DNA oligomererna. För att konstruera titreringar kurvor, är det nödvändigt att bestämma den konkurrent DNA koncentrationen c(z,t) för varje givet z-position inom gelmatrisen och tid punkt t. Detta är ett annat viktigt steg, eftersom fastställandet av KDs beror direkt på c(z,t). Kalibrering brunnar som innehåller NB färgämnet som en sensor för DNA-koncentration används för detta ändamål (figur 1d, figur 2en). Vanligtvis räcker 3-5 kalibrering brunnar innehållande NB per platta. Innan utvärdera någon HiP-FA experiment, NB kalibreringskurvan borde konstrueras för struktur genom att utföra en konventionell titrering serie NB upplöst i agarosgel med en konkurrent DNA sekvenser med olika koncentrationer (figur 3 en), som förklaras i detalj i steg 8. Vid mycket starka bindning (KD < 500 pM), extrapoleringen används för bestämning av låga koncentrationer av konkurrent DNA blir begränsande, eftersom det är mindre exakt än en direkt mätning. Dock för TFs med sådan låg KDs, kan den HipHop-Anl. inställningen användas för att utföra en konventionell konkurrenskraftiga titrering i bindande buffert utan användning av en agaros gelmatris (figur 5). Exempelvis kan en fullständig titrering med 12 olika koncentrationer av konkurrent DNA utföras i en enda rad med en plattan med 96 brunnar.
Kontrollerad leverans systemet kräver också snabb TF-DNA bindande kinetik och stabila proteiner, sedan diffusion men agarosgel är dynamiska (även om långsam). Båda egenskaperna kan testas direkt med den HipHop-Anl. inställningen av följande, över tiden, FA av TFs sevärdheter när bunden till deras respektive fluorescently märkta referens DNA. Vi mätte KON och KOFF priser för de undersökta faktorerna och funnit dem vara storleksordningen millisekunder till några sekunder20, i enlighet med andra studier30. Detta är tillräckligt snabbt för att säkerställa att mätningarna sker vid jämvikt. När det gäller andra bindande reaktioner med långsammare kinetik, kan diffusivitet av konkurrenten stämmas av sänka dess koncentration eller minska gel porstorlek. När det gäller testade TFs, som alla har snabb TOFF (~ sekunder), en total mättid på ca 1-2 h är tillräcklig för att säkerställa termodynamisk jämvikt vid varje mätning.
En annan potentiell problem relaterat till protein är bildandet av protein aggregat som kan förändra FA mätningar. Användning av andra buffert villkor som innehåller olika tillsatser (som tensider) kan förhindra sammanlagda bildande, om det behövs.
Vi har arbetat med linjäritet antagande av PWM; dock kan HIP-FA skalas för att inkludera alla möjliga di-nukleotid mutationer av sekvensen konsensus. Slutligen, HiP-FA kan anpassas att mäta andra typer av bindning interaktioner. Förutsättningen är att ha tillgängliga en lämplig referens molekyl bunden av det protein som kan märkas fluorescently. Med kontrollerad leverans system, kan en koncentrationsgradient skapas för någon form av liganden; protein-protein och drog-protein interaktioner kan därför mätas med likaså HiFi och genomströmning.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar J. Müller för cDNA kloner och medlemmar av Gallien labbet, särskilt S. Bergelt, för värdefulla råd och pigg diskussion. Detta arbete stöds av SFB 646, regulatoriska nätverk i genomet uttryck och underhåll (C.J., P.B.), centrum för integrerad Protein Science (U.G.) och forskarskolan för kvantitativa biovetenskaper München (M.S.). U.G. erkänner stöd genom den Deutsche Forschungsgemeinschafts (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), den Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: Eriksson – Innovationswettbewerb Systembiologie), och Humboldt-stiftelsen (Alexander von Humboldt, Professur).
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
Nile Blue A | Sigma | N5632-25G | |
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS | Greiner | 655891 | 175 µm thick glass bottom |
384 Well Sensoplate, black | Greiner | 788896 | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-50G | |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Tween-20 | Sigma | P1379-1L | |
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Merck | 1.05099.1000 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.04873.1000 | |
Q-POD Element | Merck Millipore | ZMQSP0DE1 | |
Millipak 40 Gamma Gold Filter | Merck Millipore | MPGL04GK2 | |
Milli-Q Integral 3 Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ003WW | |
Quantum TIX | Merck Millipore | QTUMOTIX1 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
Mastercycler gradient | Eppendorf | Z316083 | |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.200 | |
Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP | Sarstedt | 72.737.002 | |
MICROSCOPY SETUP: | |||
Automated widefield microscope | LEICA | DMI6000 | |
Long distance objective | LEICA | HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry | |
638 nm line continuous diode laser | Omicron | PHOxX 638-40, 40mW | |
Back-illuminated EM-CCD Camera | Andor | iXon DV897 | |
Dichroic mirror | AHF | 640nm cut-off | |
Bandpass filter | AHF | ET bandpass 700/75 | |
Linear polarizer | Thorlabs | LPVISC050-MP2 | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | BS010 | |
Achromatic lens | Thorlabs | 200 mm focal length | |
Multimode optical fiber | Optronis | FVP600660710 | |
ROBOTIC SYSTEM: | |||
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper | Beckman Coulter | Biomek NXP | |
SOFTWARE: | |||
Programming language | National Instruments | Labview 9.0 | |
Script for the HiP-FA software available at | https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA |