Denne protokol beskriver en simpel metode til at isolere enkelt, inficeret blæren epitel celler fra en murine model af urinvejsinfektion.
I denne artikel vil skitsere vi en procedure, der anvendes til at isolere individuelle intracellulære bakterielle samfund fra en mus, der har været eksperimentelt inficeret i urinvejene. Protokollen kan groft inddeles i tre sektioner: infektion, blære epitelcelle høst og mund micropipetting at isolere individuelle inficerede epitelceller. Den isolerede epitelcelle indeholder levedygtige bakterieceller og er næsten fri for kontaminerende ekstracellulære bakterier, hvilket gør den ideel til downstream encellede analyse. Den tid, det tager fra starten af infektionen til at opnå en enkelt intracellulære bakterielle samfund er omkring 8 h. Denne protokol er billigt at installere og anvender bredt tilgængelige materialer, og vi forventer, at det også kan udnyttes i andre infektion modeller at isolere enkelt inficerede celler fra celle blandinger selvom de inficerede celler er sjældne. Men på grund af en potentiel risiko i munden micropipetting, denne procedure anbefales ikke til meget smitsomme agenser.
Urinvejsinfektioner (urinvejsinfektioner) er en af de mest almindelige bakterielle infektioner. Anslået 40-50% af kvinder forventes at opleve mindst én urinvejsinfektion (UTI) i løbet af deres levetid1. En af de vigtigste agenter af UTI er uropathogenic E. coli (UPEC), som tegner sig for over 70% af ukomplicerede urinvejsinfektioner2. Omkring en fjerdedel af dem, der har en UTI har desuden en tilbagevendende infektion, ofte forårsaget af den samme stamme, trods relevant antibiotisk behandling3. Den høje forekomst af UTI repræsenterer en betydelig byrde på sundhedssystemerne, koster mere end 2 milliarder dollars om året i USA ‘s4. Desuden fører brug af antibiotika til behandling af urinvejsinfektioner også til stigende antibiotikaresistens satser, som er en større offentlige sundhed bekymring5.
Derfor har en stor indsats været placeret i at forstå de mekanismer, hvorved UPEC inficerer urinvejene, såvel som dens evne til at forårsage recidiverende infektioner6,7,8. Især er en musemodel af infektion blevet brugt til at behandle bakterielle og vært egenskaber, der bidrager til UTI8. Denne musemodel har fordelen at være gældende for umodificeret klinisk stammer isoleret fra menneskelige patienter. Denne model har også ført til opdagelsen af potentielt druggable bakteriel veje vigtigt for etableringen af UTI, såsom den Type 1 pilus9 og jern erhvervelse systemer10.
Sammenlignet med disse succeser i at studere de tidlige begivenheder i UTI, mangler kendskab til de underliggende tilbagevendende UTI mekanismer stadig11. En hypotese er, at UPEC undviger antibiotikabehandling og forårsager tilbagevendende infektioner i blæren ved at danne intracellulære bakterielle samfund (IBC ‘s) i blæren epitel celler. IBC’er er blevet identificeret, både i murine modeller af infektion og i menneskelige UTI patienter12,13. Tilstedeværelsen af IBC’er i urinprøver fra pediatric UTI patienter har været forbundet med højere satser for gentagelse14,15. Imidlertid isolere IBC’er og studere bakterier i dem har vist sig for at være teknisk udfordrende på grund af deres sjældenhed; Det anslås, at en inficeret murine blære typisk kun har 10-100 IBC’er16. Derudover blæren epitel celler er forholdsvis stor (50-120 µm)17, at gøre det udfordrende for at implementere fluorescens bistået celle sortering (FACS) da der typisk FACS dyser er designet med diametre af 70 µm eller 100 µm. Celler så stor som blæren epitel celler er således ofte fjernes ved filtrering før FACS at undgå tilstopning af fluidics.
Vores lab for nylig beskrev en generel og økonomisk metode til at isolere sjældne inficerede celler fra blandinger som skrabede epitelceller af blæren18. Du kan effektivt isolere IBC’er, brugte vi traditionelle munden pipettering. Munden micropipetting er en teknik, der har længe været anvendt til micromanipulation af enkelt celler og embryoner til downstream analyse19,20,21,22,23, 24 , 25. traditionelle munden Pipettering af store flydende mængder (i milliliter) har ofte været årsag til laboratoriet vedrørende ulykker, og teknikken har med rette været undgået ved meget fra forskerkredse uden for traditionelle embryologi og enkelt celle applikationer. Vores protokol er inspireret af enkelt celle versioner af denne teknik19,20, som mindske risikoen ved at give en stor buffer (> 2 mL) af luften mellem forsker og prøve i forhold til mængden af væske overført (< 1 ΜL). Denne metode tager også fordel af fine kontrol at munden micropipetting giver, som oversætter til en lav endelige mængden af omgivende løsning overført og høj renhed af isolerede celler. Teknikken, der bruger billig materialer (<$ 50), og dermed burde være muligt at gennemføre i alle laboratorier.
Denne visuelle protokol beskriver vores IBC isolation teknik, giver en reference for at bistå andre forskere søger at kopiere denne teknik. Forskeren skal have adgang til en fluorescerende dissekere mikroskop (eller lignende udstyr), der kan bruges til at visualisere individuelle epitelceller og fluorescerende bakterier under live imaging, med en åben og tilgængelig imaging scenen for micropipetting (Se Tabel af materialer til detaljerne i mikroskop bruges, selvom andre tilsvarende instrument modeller kan også bruges). Mens denne protokol vil fokusere på IBC’er i en murine model af UTI, bør lignende metoder anvendes isolere inficerede celler fra celle suspensioner i andre modeller af infektion.
Den protokol, vi har beskrevet giver til isolering af enkelt IBC’er fra en murine model af UTI. Denne protokol isolerer IBC’er, der indeholder levedygtige intracellulære bakterier, som kan verificeres ved dyrkning for CFU. Protocol resultater i intracellulære bakterier fra IBC’er med lidt forurening af ekstracellulære bakterier, giver mulighed for yderligere karakterisering af både bakterier og vært celle fra et IBC (fig. 4C). Vi viser også, at bakterier fra en enkelt IBC kan bruges i downstream applikationer såsom qPCR (fig. 4C), hvilket tyder på, at vores teknik kan bruges til processen IBC’er for andre in vitro-analyser. Ved at samle de bakterier, der er høstet fra så lidt som 5 IBC’er, viser vi yderligere vores evne til at udføre qRT-PCR analyse på tre bakteriel gener, hvilket tyder på, at god kvalitet RNA kan høstes fra bakterier i vores isolerede IBC’er (figur 4D). Kombineret, tyder de data, vi har vist, på at udføre genome-wide RNA analyse (såsom RNA sekventering) på enkelt IBC’er kan være muligt ved hjælp af denne isolation teknik.
I denne protokol, har vi fokuseret på 6 h tidspunkt, fordi det er når IBC numre toppe i blærer af sort 6 mus inficeret af UTI8927. Desuden har vi også brugt en statisk bakteriekulturen system til at forbedre niveauet for type 1 pilus udtryk i UTI89. Udtryk af typen 1 pilus er kritisk for E. coli tillægger og inficere blæren epitel celler28. Men dette udtryk er stramt reguleret29 og miljømæssige stikord er kendt for at ændre den30. For at opretholde en konsekvent infektion fænotype og tilstrækkeligt antal IBC’er, anbefaler vi at bruge en 2 x 24 h statisk bakteriekulturen (lidt ændret fra Hung et al.8) og 6 h infektion tidspunkt når arbejder med tidligere testet E. coli stammer som NU14 og UTI8928,29. Det er imidlertid muligt, at disse variabler skal justeres i andre UTI stammer eller i andre mus stammer til at opnå den ideelle antal IBC’er fra hver infektion.
Mens protokollen fra Hung et al.8 bruger kun hunmus, har andre etablerede protokoller til oprettelse af urinvejsinfektion hos mandlige mus været rapporteret31. I denne model fulgt blærebetændelse i mandlige mus også IBC pathway. Som blærer af mandlige og kvindelige mus er ens i størrelse, forventer vi, at vores IBC isolation protokol kan anvendes på inficerede mandlige mus samt.
Den relativt simple teknologi udnyttes i denne protokol sikrer også, at det kan installeres i de fleste laboratorier. En af de vigtigste skridt, der er involveret i denne protokol er hale af glas kapillærer til at oprette microcapillaries for at markere den celletype af interesse. Dette trin giver mulighed for fleksibilitet i diameteren af microcapillaries skabt, og dermed metoden kan udvides til at omfatte flere forskellige mål celletyper. På grund af den iboende variation i at skabe disse kapillærer, skal pleje tages til at sikre, at den endelige diameter i en brugsområdet. Hvis kapillærer er for snæver, de undlader at afhente celle af interesse, men hvis de bliver for bredt, flere celler kunne vælges i et enkelt forsøg. Desuden bærer brug af åben ild under processen med kapillar trække en iboende risiko for forbrændinger og brand, så forskeren forsøger at skabe microcapillaries skal sørge for at forhindre sådanne hændelser opstår. For at reducere variabiliteten samt åbne brandrisikoen involveret i at gøre disse kapillærer, forskeren kunne gøre brug af en traditionel mikropipette trække maskine, som dem der bruges til elektrofysiologiske eksperimenter (f.eks. PC-100, Narishige gruppe). Da disse maskiner gøre brug af tyngdekraften eller robot platforme til at trække kapillærerne, de kan skræddersys til at opfylde behovene hos infektion modellen. Den brede vifte af mikropipette trække maskiner tilgængelige vil imidlertid betyde, at den enkelte forsker vil savn hen til efterkontrollere nogle trial and error til at bestemme den passende endelige kapillær diameter til brug med denne protokol.
Den præsenterede protokol gør brug af bakterier giver udtryk for en fluorescerende tag visuelt identificere IBC. Således, denne teknik er begrænset af forskernes evne til genetisk ændre den infektiøse organismer. Specielt for UPEC, er IBC-dannende stammer som CFT073 og NU14 blevet med held omdannet med normal god landbrugspraksis-udtrykker plasmider32,33,34; disse bør derfor være brugbar i den samme protokol. Baseret på området med musen blære (70 mm2)35, længden af individuelle epitelceller (50-120 µm)17og hyppigheden af IBC’er i en enkelt blære16, et konservativt estimat for forekomsten af IBC’er handler om 1 i 1.000 celler (eller 0,1%). Dette skøn montrer nytte af vores celle isolation protokol til at målrette sjældne hændelser. Præcisionen af cellemarkeringen gennem vores protokol og den brede vifte af kapillar diametre, der kan trækkes tyder på, at denne protokol kan bruges til at isolere intracellulære bakterier fra andre in vivo og in vitro-modeller af infektion. Ja, vi har med succes brugt denne teknik til at isolere smittede kulturperler blæren epitel celler (data ikke vist).
En af de mere teknisk udfordrende skridt i protokollen invertere blæren for at udsætte epitelceller for skrabning. Vi har fundet, at det også er muligt at gøre et snit på blæren til splay det for skrabning. Men tiden bør udvises forsigtighed til at reducere skaden epitelceller af blæren under processen med at skære det åbne; ideelt set bør et enkelt snit udnyttes til at splay blære open. Derudover bør cut foretages i kolde PBS, til at forhindre utilsigtet tab af celler eller blæren væv under processen.
Munden Pipettering af IBC’er i denne protokol giver større kontrol over celle udvælgelsesproces, samt begrænse det endelige rumfang af opløsning overføres sammen med cellen. Fin kontrol og stor adskillelse af løsning fra forskernes munden også maksimerer sikkerheden for forskeren, som mængder overført inden for nanoliter til microliter rækkevidde. Vores erfaring med den moderne mikropipette er derimod at det har en tendens til at overføre flere omkringliggende væske og celler med IBC, potentielt fører til forurening med ekstracellulære luminale bakterier. Vores konklusion, at munden pipettering giver en højere ydeevne over andre enkelt celle isolation metoder er også blevet rapporteret af andre labs22,23,24. Bortset fra enkelt celle isolation, er munden pipettering selv blevet brugt i encellede elektroporation for neuroner25, hvilket yderligere viser nytte og minut kontrol, som en uddannet forsker kan nå med teknikken. Men sikkerhed er af største betydning, og vi foreslå mulige yderligere foranstaltninger, der kan træffes afhængigt af patogener bliver brugt: (i) udvidelse af luften buffer mellem forskeren og det biologiske materiale, for eksempel ved hjælp af en sugning pipette med en større volumen (f.eks. 5 mL), eller (ii) tilføjer et fysisk filter som VAT i den aspirating pipette til at fungere som en yderligere barriere.
I tilfælde hvor en vurdering fører til den konklusion, at det stadig er for risikabelt at munden pipettering, kan kommercielt tilgængelige robot opsætninger (som dem der bruges til nanoinjections) kombineres med de andre dele af vores teknik til at give en mere sikker metode til isolere inficerede celler fra blandede befolkninger. Det skal bemærkes, at vores erfaring med at bruge en robot micromanipulator har vist en nedsat sats på IBC isolation i forhold til mund pipettering, som den store intra eksperimentel variation i blæren epitelcelle størrelse gør det udfordrende for brugeren af en robotarm til at bestemme den kraft, der kræves for at afhente enkelt IBC’er. Det er imidlertid stadig en levedygtig, men dyrere, mulighed for dem, der arbejder med meget smitsomme agenser af sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Danmarks Grundforskningsfond, premierministerens kontor, Singapore, under sin NRF Research Fellowship ordning (NRF indgå nr. NRF-RF2010-10); Singapore Ministry of Healths nationale medicinske Forskningsråd (NMRC/CIRG/1358/2013); og Genome Institute of Singapore (GIS) / agentur for videnskab, teknologi og forskning (A * stjerne).
1.5ml eppendorf tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
100% ethanol | For Alcohol Burner | ||
15 ml conical tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
1ml Tuberculin Syringe | BD Biosciences | 302100 | |
3% Bacterial Agar | For static bacterial culture and OD measurement | ||
70% ethanol | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Aesculap anatomic forceps | Braun/Kruuse | BD222R | For initial dissection of mouse (skin, fascia) |
Alcohol Burner | Wheaton | 237070 | |
Aspirating pipette | BD Biosciences | 357558 | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Bacterial loops | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424 | Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes |
Conical flasks | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Digital camera for microscope | Olympus | DP71 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Glass Capillaries | Kimax | 6148K07 | |
Iris Scissors STR SS 110MM | Braun | BC110R | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
Kanamycin Sulfate | Calbiochem | 420311 | For static bacterial culture and OD measurement |
LB broth (Miller) | Thermo/Gibco | 10855021 | For static bacterial culture and OD measurement |
Light source unit for microscope | Olympus | LG-PS2 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Lubricant | KY | Any similar commercial medical lubricant will suffice | |
Macro fluorescence microscope | Olympus | MVX10 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Micropipette + micropipette tips | For static bacterial culture and OD measurement | ||
PBS 1x | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Pipette controller + Pipettes | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Polyethylene Tubing | BD Intramedic | 427401 | |
Precision Glide needle 30G | BD Biosciences | 305107 | Possibly under new catalogue number (305106) |
Splinter forceps curved | Braun | BD312R | |
Spray bottle (for ethanol) | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Square cuvettes | Elkay | 127-1010-400 | For static bacterial culture and OD measurement |
Sterilgard III Advance Safety Cabinet | Baker | SG403 | Any biosafety cabinet with a UV irridiator |
Sterilin 90mm Standard Petri Dish | Thermo | 101VR20 | Any sterile petri dish |
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm | Braun | OK366R | Recommended for harvesting of bladder |
Surgical Scissors STR S/B 105MM | Braun | BC320R | |
Tabletop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals |
WPA C08000 cell density meter | Biowave (Biochrom) | 80-3000-45 | For static bacterial culture and OD measurement |