Det här protokollet beskriver en enkel metod att isolera enstaka, infekterade-urinblåsan epitelceller från en murin modell av urinvägsinfektion.
I den här artikeln beskriver vi ett förfarande som används för att isolera enskilda intracellulära bakteriella samhällen från en mus som har infekterats experimentellt i urinvägarna. Protokollet kan delas in i tre delar: den infektion, urinblåsan epitelial cellen skörd och mun micropipetting att isolera enskilda infekterade epitelceller. Isolerade epitelial cellen innehåller livskraftiga bakterieceller och är nästan gratis av kontaminerande extracellulära bakterier, vilket gör den idealisk för nedströms encelliga analys. Tiden från början av infektion för att erhålla en enda intracellulära bakteriella gemenskapen är ca 8 h. Detta protokoll är billig att distribuera och använder allmänt tillgängliga material och vi räknar med att det också kan användas i andra infektion modeller att isolera enstaka infekterade celler från cell blandningar, även om dessa infekterade celler är sällsynta. Dock på grund av en potentiell risk i mun micropipetting rekommenderas proceduren inte för mycket smittämnen.
Urinvägsinfektioner (UVI) är en av de vanligaste bakteriella infektionerna. Uppskattningsvis 40-50% av kvinnor förväntas uppleva minst en urinvägsinfektion (UVI) under sin livstid1. En av de viktigaste medlen av UTI är uropathogenic E. coli (UPEC), som står för över 70% av okomplicerad UVI2. Cirka en fjärdedel av dem som har en UVI har dessutom en återkommande infektion, ofta orsakas av samma stam, trots lämplig antibiotikabehandling3. Den höga förekomsten av UTI representerar en betydande börda för hälso-och sjukvårdssystem, kostar mer än $2 miljarder per år i USA4. Dessutom leder användningen av antibiotika för att behandla UVI också till ökande antibiotikaresistens priser, vilket är en större folkhälsa oro5.
Därför har en stor ansträngning placerats i förstå de mekanismer genom vilka UPEC infekterar urinvägarna, samt dess förmåga att orsaka återkommande infektioner6,7,8. Särskilt har en musmodell av infektion använts för att undersöka bakteriell och värd egenskaper som bidrar till UTI8. Denna musmodell har fördelen att vara tillämpliga på oförändrad klinisk stammar som isolerats från mänskliga patienter. Denna modell har också lett till upptäckten av potentiellt druggable bakteriell vägar viktigt för inrättandet av UVI, såsom Typ1 pilus9 och järn förvärv system10.
Jämfört med dessa framgångar i att studera tidiga händelser i UTI, saknas kunskap om mekanismerna bakom återkommande UVI fortfarande11. En hypotes är att UPEC undviker antibiotikabehandling och orsakar återkommande infektioner i urinblåsan genom att bilda intracellulära bakteriella samhällen (IBC) inom urinblåsan epitelceller. IBCer har upptäckts både i murina modeller av infektion och i mänskliga UTI patienter12,13. Förekomsten av IBCer i urinprov från pediatric UTI patienter har associerats med högre andelen återkommande14,15. Dock har isolera IBCer och studera bakterierna inom dem visat sig vara tekniskt utmanande på grund av deras raritet; Det uppskattas att en infekterad murina urinblåsan vanligtvis bara har 10-100 IBCer16. Dessutom urinblåsan epitelceller är relativt stora (50-120 µm)17, vilket gör det svårt för att distribuera fluorescens assisterad cell sortering (FACS) med tanke på att typiska FACS munstycken är utformade med diametrar av 70 µm eller 100 µm. Celler som är lika stor som urinblåsan epitelceller är således ofta bort genom filtrering före FACS att undvika igensättning av flödesteknik.
Vårt labb nyligen beskrivit en allmän och ekonomisk metod för att isolera sällsynta infekterade celler från blandningar såsom skrapade epitelceller av urinblåsan18. För att effektivt isolera IBCer, använde vi traditionella mun pipettering. Mun micropipetting är en teknik som har länge använts för mikromanipulation av enstaka celler och embryon för efterföljande analys19,20,21,22,23, 24 , 25. traditionell mun pipettering av stora flytande volymer (i milliliter) har ofta varit orsaken till laboratoriet relaterade olyckor, och tekniken har med rätta varit skys av mycket av forskarvärlden utanför traditionella embryologi och enstaka cell program. Våra protokoll är inspirerad av de enda cell versioner av denna teknik19,20, vilket minska risken genom att tillhandahålla en stor buffert (> 2 mL) av luft mellan forskaren och prov jämfört vätskevolym överfört (< 1 ΜL). Denna metod också drar nytta av den fina kontrollen som mun micropipetting ger, som översätter till en låg slutlig volym av omgivande lösningen överförs och hög renhet av isolerade celler. Tekniken använder billig material (< 50$), och bör därför vara möjligt att genomföra i alla övningar.
Denna visuella protokollet beskriver våra IBC isolering teknik, som tillhandahåller en referens för att hjälpa andra forskare som försöker replikera denna teknik. Forskaren behöver tillgång till en fluorescerande dissekera Mikroskop (eller liknande utrustning) som kan användas för att visualisera enskilda epitelceller och fluorescerande bakterier under levande imaging, med en öppen och tillgänglig imaging scen för micropipetting (se Tabell av material för detaljerna i mikroskopet används, även om andra motsvarande instrument modeller kan också användas). Medan detta protokoll kommer att fokusera på IBCer i en murin modell av UVI, bör liknande metoder gälla att isolera infekterade celler från cellsuspensioner i andra modeller av infektion.
Protokollet har vi beskrivit tillåter för isolering av enda IBCer från en murin modell av UVI. Detta protokoll isolerar IBCer innehållande livskraftig intracellulära bakterier, som kan verifieras genom odling för CFU. Protokoll resultaten i intracellulära bakterier från IBCer med lilla kontaminering av extracellulära bakterier, vilket möjliggör ytterligare karakterisering av både bakterier och värd cell från en IBC (figur 4C). Vi visar också att bakterierna från en enda IBC kan användas i efterföljande led applikationer såsom qPCR (figur 4C), tyder på att vår teknik kan användas till process IBCer för andra in vitro-analyser. Genom att samla de bakterier som skördas från så få som 5 IBCer, visar vi ytterligare vår förmåga att utföra qRT-PCR-analys på tre bakteriella gener, vilket tyder på att bra kvalitet RNA kan skördas från bakterier i våra isolerade IBCer (figur 4D). Kombinerat, ange data vi har visat att utföra genome-wide RNA analys (till exempel RNA-sekvensering) på enda IBCer kan vara möjligt med denna isolering teknik.
I detta protokoll, har vi fokuserat på 6 h tid-punkten för det är när IBC nummer topp i blåsorna av svart 6 möss som infekterats av UTI8927. Dessutom har vi också använt ett statiskt bakterieodling system för att förbättra nivån på typ 1 pilus uttryck i UTI89. Uttrycket av typ 1 pilus är kritisk för E. coli att fästa och infektera urinblåsan epitelceller28. Men detta uttryck är hårt reglerade29 och miljömässiga ledtrådar är kända för att påverka det30. För att upprätthålla en konsekvent infektion fenotyp och tillräckligt antal IBCer, rekommenderar vi att du använder en statisk bakterieodling från 2 x 24 h (något modifierad från Hung et al.8) och 6 h infektion tidpunkten när arbetar med tidigare testade E. coli stammar såsom NU14 och UTI8928,29. Det är dock möjligt att dessa variabler kommer att behöva justeras i andra UTI stammar eller andra möss stammar att få det perfekt antalet IBCer från varje infektion.
I protokollet från Hung et al.8 används endast honmöss, varit andra etablerade protokoll för fastställande av urinvägsinfektion hos hanmöss rapporterade31. I denna modell följde cystit hos hanmöss också den IBC-vägen. Eftersom blåsorna av manliga och kvinnliga möss är lika i storlek, räknar vi med att våra IBC isolering protokoll kan användas på infekterade manliga möss också.
Den relativt enkla teknik som utnyttjas i detta protokoll garanterar också att det kan användas på de flesta laboratorier. En av de viktigaste stegen som är inblandade i detta protokoll är att dra av glas kapillärer att skapa microcapillaries för att välja celltyp av av intresse. Detta steg ger flexibilitet i diametrarna av microcapillaries skapade, och således metoden kan utökas till flera olika mål celltyper. Dock på grund av den inneboende variationen att skapa dessa kapillärer, måste försiktighet iakttas för att säkerställa att den slutliga diametern är i ett användbart utbud. Om kapillärerna är för snävt, de misslyckas med att plocka upp cellen av intresse, men om de är gjorda för breda, flera celler kan väljas i ett försök. Användning av öppen eld under processen för kapillär dra bär dessutom en inneboende risk för brännskador och brand, så att forskaren försöker skapa microcapillaries bör ta hand att förhindra att sådana händelser inträffar. För att minska variationen samt öppna brandrisken inblandade i att göra dessa kapillärer, forskaren kan göra användningen av en traditionell mikropipett dra maskinen, som används för elektrofysiologiska experiment (t.ex. PC-100, Narishige-gruppen). Eftersom dessa maskiner gör användning av antingen gravitation eller robotliknande plattformar för att dra kapillärerna, de kan skräddarsys för att möta behoven hos den infektion modellen. Men, det breda utbudet av mikropipett dra maskiner tillgängliga kommer att innebära att den enskilda forskaren kommer att behöva gå igenom några försök och misstag att fastställa lämpliga slutliga kapillär diameter för användning med detta protokoll.
Presenterade protokollet utnyttjar bakterier att uttrycka en fluorescerande tagg att visuellt identifiera IBC. Således, denna teknik är begränsad av forskarnas förmåga att genetiskt modifiera den infektiösa organismen. Specifikt för UPEC, har IBC-bilda stammar såsom CFT073 och NU14 framgångsrikt transformerats med GFP-uttryckande plasmider32,33,34. Därför bör dessa användas i samma protokoll. Baserat på området av mus urinblåsan (70 mm2)35, längden på enskilda epitelceller (50-120 µm)17och frekvensen av IBC-behållare i en enda urinblåsan16, en konservativ uppskattning för incidensen av IBCer handlar om 1 av 1 000 celler (eller 0,1%). Denna uppskattning visar upp verktyget i vår cell isolering protokoll att rikta sällsynta händelser. Precisionen i cellmarkeringen genom våra protokoll och det breda utbudet av kapillär diametrar som kan dras tyder på att detta protokoll kan användas för att isolera intracellulära bakterier från andra in vivo och in vitro-modeller av infektion. Ja, vi har framgångsrikt använt denna teknik för att isolera smittade odlade urinblåsan epitelceller (inga data anges).
En av de mer tekniskt utmanande steg i protokollet Invertera urinblåsan för att exponera epitelceller för skrapning. Vi har funnit att det också är möjligt att göra ett snitt på urinblåsan att splay det för skrapning. Emellertid tack vård bör vidtas för att minska skador till epitelcellerna i urinblåsan under processen med att skära den öppen; helst bör en enda klippa utnyttjas för att splay urinblåsan öppna. Dessutom bör snittet göras i kalla PBS, att förhindra oavsiktlig förlust av celler eller urinblåsan vävnad under processen.
Munnen pipettering av IBCer i detta protokoll ger större kontroll över cell urvalsprocessen, samt att begränsa den slutliga volymen överförs tillsammans med cellen. Den fina kontroll och stor separation av lösning från forskarnas mun också maximerar säkerheten för forskaren, som de volymer som överförs är inom nliter till mikroliter utbud. Vår erfarenhet med den moderna mikropipett är däremot att det tenderar att överföra mer omgivande vätskan och celler med IBC, vilket kan leda till kontaminering med extracellulära luminala bakterier. Vår slutsats att munnen pipettering ger en högre prestanda över andra enda cell isoleringsmetoder har också rapporterats av andra labs22,23,24. Bortsett från enstaka cell isolering, har mun pipettering även använts i encelliga elektroporation för nervceller25, vilket ytterligare visar verktyget och den minuterna kontroll som utbildade forskare kan uppnå med tekniken. Men säkerheten är av primär betydelse, och vi föreslår eventuella ytterligare åtgärder som kan vidtas beroende på de patogener som används: (i) förlängningen av det luftbuffert mellan forskaren och det biologiska materialet, till exempel genom att använda en aspirera pipett med en större volym (t.ex. 5 mL), eller (ii) att lägga till en fysisk filter såsom bomull till utvärderingsenheten pipetten att fungera som ytterligare ett hinder.
I fall där en riskbedömning leder till slutsatsen att det fortfarande är för riskabelt att munnen pipettering, kan kommersiellt tillgängliga robotic uppställningar (till exempel de som används för nanoinjections) kombineras med de andra delarna av vår teknik för att ge en säkrare metod för isolera infekterade celler från blandade populationer. Det bör noteras att vår erfarenhet med att använda en robotic micromanipulator har visat en minskad frekvens av IBC isolering jämfört med munnen pipettering, som den stora inom experimentell variationen i urinblåsan epitelial Cellstorlek gör det utmanande för användaren av en robotarm att avgöra den kraft som krävs för att plocka upp enda IBCer. Det är dock fortfarande ett gångbart, men dyrare, alternativ för dem som arbetar med mycket smittämnen av sjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av National Research Foundation, premiärministerns kontor, Singapore, enligt dess NRF Research Fellowship system (NRF utmärkelse nr. NRF-RF2010-10); Singapore hälsoministeriets National Medical Research Council (NMRC/CIRG/1358/2013). Genome Institute i Singapore (GIS) / byrå för vetenskap, teknik och forskning (A * STAR).
1.5ml eppendorf tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
100% ethanol | For Alcohol Burner | ||
15 ml conical tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
1ml Tuberculin Syringe | BD Biosciences | 302100 | |
3% Bacterial Agar | For static bacterial culture and OD measurement | ||
70% ethanol | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Aesculap anatomic forceps | Braun/Kruuse | BD222R | For initial dissection of mouse (skin, fascia) |
Alcohol Burner | Wheaton | 237070 | |
Aspirating pipette | BD Biosciences | 357558 | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Bacterial loops | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424 | Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes |
Conical flasks | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Digital camera for microscope | Olympus | DP71 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Glass Capillaries | Kimax | 6148K07 | |
Iris Scissors STR SS 110MM | Braun | BC110R | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
Kanamycin Sulfate | Calbiochem | 420311 | For static bacterial culture and OD measurement |
LB broth (Miller) | Thermo/Gibco | 10855021 | For static bacterial culture and OD measurement |
Light source unit for microscope | Olympus | LG-PS2 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Lubricant | KY | Any similar commercial medical lubricant will suffice | |
Macro fluorescence microscope | Olympus | MVX10 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
Micropipette + micropipette tips | For static bacterial culture and OD measurement | ||
PBS 1x | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Pipette controller + Pipettes | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Polyethylene Tubing | BD Intramedic | 427401 | |
Precision Glide needle 30G | BD Biosciences | 305107 | Possibly under new catalogue number (305106) |
Splinter forceps curved | Braun | BD312R | |
Spray bottle (for ethanol) | For static bacterial culture and OD measurement | ||
Square cuvettes | Elkay | 127-1010-400 | For static bacterial culture and OD measurement |
Sterilgard III Advance Safety Cabinet | Baker | SG403 | Any biosafety cabinet with a UV irridiator |
Sterilin 90mm Standard Petri Dish | Thermo | 101VR20 | Any sterile petri dish |
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm | Braun | OK366R | Recommended for harvesting of bladder |
Surgical Scissors STR S/B 105MM | Braun | BC320R | |
Tabletop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals |
WPA C08000 cell density meter | Biowave (Biochrom) | 80-3000-45 | For static bacterial culture and OD measurement |