Протокол для подготовки поли (пентафторфенилгидразин акрилатные) (poly(PFPA)) привитые кремнезема бусины представлены. Функционализированных поверхность poly(PFPA) затем прикол с антителами и успешно используется для разделения белков через иммунопреципитации.
Мы демонстрируем простой способ подготовить поли (пентафторфенилгидразин акрилатные) (poly(PFPA)) привитые кремнезема Бусины для иммобилизации антитела и последующих иммунопреципитации (IP) приложения. Poly(PFPA) привитые поверхность готова через простой двухэтапный процесс. На первом шаге как компоновщик молекулы на поверхности кремния осаждается 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES). На втором шаге, poly(PFPA) гомополимер, синтезированных через реверсивный сложения и фрагментации цепной передачи (РАФТ) полимеризации, является привитыми к молекуле компоновщик через реакции обмена между пентафторфенилгидразин (ПРМ) единиц на полимерные и амины группы на APTES. Осаждения APTES и poly(PFPA) на кремний частицы являются подтверждается Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS), а также контролируется изменения размера частиц измеряется через Динамическое рассеяние света (DLS). Для улучшения поверхности гидрофильность бусы, частичная замена poly(PFPA) с Амин функционализированных poly(ethylene glycol) также производится (амино PEG). ПЭГ замещенных poly(PFPA) привитые кремнезема, который бусины затем прикол с антитела для IP приложения. Для демонстрации занятых антитело против протеинкиназы РНК активированный (PKR), и эффективность IP определяется Западный blotting. Результаты анализа показывают, что бусины иммобилизованные антитела действительно может использоваться для обогащения PKR, в то время как неспецифический белковых взаимодействий являются минимальными.
Реактивные полимерной щетки получили большой интерес в последние годы. Они могут быть использованы для иммобилизации функциональные молекулы органических или неорганических материалов для создания активированных поверхностей с приложениями в таких областях, как обнаружение и разделения1,2,3,4, 5. Среди полимеров сообщили содержащие пентафторфенилгидразин эфира единицы являются особенно полезными ввиду их высокой реактивности с аминами и стойкость к гидролизу6. Один из таких полимеров является poly(PFPA), и она может быть легко функционализированных после полимеризации с молекул, содержащих первичных или вторичных аминов7,8,9,10. Одним из примеров poly(PFPA) щетки были прореагировало с амино spiropyrans для создания поверхности свет отзывчивым7.
Подготовка poly(PFPA) и его приложений были описаны в ряде предыдущих публикаций6,,78,9,10,11,12 ,13,14,,1516,17. В частности Theato и коллеги сообщили синтез poly(PFPA) щетки через «прививки» и «прививки от «методы7,8,10,11,12 . В «прививки» подход, поли (methylsilsesquioxane)-поли (пентафторфенилгидразин акрилатные) (poly(MSSQ-PFPA)) гибридный полимер был синтезированных8,10,,1112. Компонент poly(MSSQ) был в состоянии формы сильная адгезия с рядом различных органических и неорганических поверхностей, таким образом позволяя poly(PFPA) компонент для формирования кистью слой на поверхности с покрытием материала. В «прививки от «подход, поверхность начато реверсивные сложения и фрагментации цепной передачи (SI-плот) полимеризации был нанят подготовить poly(PFPA) щетки7. В этом случае агент передачи поверхности иммобилизованных цепи (SI-CTA) был впервые ковалентно присоединяется к подложке через кремний силана реакции. Иммобилизованных SI-CTA затем участвовала в SI-плот полимеризации мономеров Стихийного, генерации плотно упакованных poly(PFPA) щетки с стабильной ковалентная связь к подложке.
Используя кисти poly(PFPA), синтезированных через SI-плот полимеризации, мы недавно продемонстрировали иммобилизации антител на poly(PFPA) привитые частиц кремнезема и их последующего применения в очистки белков18. Использование poly(PFPA) щетки для иммобилизации антитело было обнаружено решить ряд вопросов, связанных с текущей разделение белков через IP. Обычные IP основывается на использовании белка A/G как компоновщик для антитела иммобилизации19,,2021. Поскольку использование белка A/G позволяет антитела к быть присоединен с конкретной ориентации, высокие цели антигена восстановления эффективность достигается. Однако использование белка A/G страдает от неспецифических белков взаимодействия, а также потеря антител при восстановлении белка, оба из которых способствуют высокий уровень фонового шума. Для устранения этих недостатков, прямые сшивки антител к твердой поддержки был изучены22,,23–24. Эффективность таких методов обычно низка из-за случайной ориентации crosslinked антителами. Для poly(PFPA) привитые субстрата иммобилизация антител является постоянным, благодаря реакции обмена между подразделениями ПРМ и Амин функциональности на антитела. Хотя антитела ориентации по-прежнему случайных, система преимущества при использовании многих реактивной ПРМ сайты, управляемые по степени полимеризации. Кроме того мы показали, что путем частичной замены ПРМ единиц с амино PEG, гидрофильность поверхности могут быть настроены, дальнейшего повышения эффективности белка восстановления системы18. В целом частиц кремнезема poly(PFPA) привитые были продемонстрированы быть эффективной альтернативой традиционным IP с разумной эффективности, а также много чистых фона.
В этот вклад мы сообщаем альтернативный метод для подготовки poly(PFPA) привитые поверхность для иммобилизации антитела и IP приложения. В простой двухэтапный процесс, как показано на рисунке 1, молекула APTES компоновщика сначала осаждается на поверхности кремния, то poly(PFPA) полимер ковалентно прикрепляется к молекуле компоновщик через реакции между ПРМ единиц на полимерные и Амин функции на APTES. Этот метод подготовки позволяет постоянным сшивки poly(PFPA) к поверхности субстрата, но избегает многих осложнений, связанных с SI-CTA синтеза и SI-плот полимеризации poly(PFPA) кистей. Можно по-прежнему выполняться частичного замещения ПРМ единиц с амино PEG, позволяет тонкой настройки свойств поверхности кисти полимера. Мы покажем, poly(PFPA) привитые кремнезема бусы подготовленный таким образом может быть прикол с антителами и используется для обогащения белка через IP. Процедура подготовки подробных шарик, антитела иммобилизации и IP тестирования документируются в этой статье, для читателей, заинтересованных в поисках альтернативы обычного белка A/G на основе IP.
Синтез poly(PFPA) привитые SiO2 бусины иллюстрируется на рисунке 1. Используя APTES как компоновщик молекулы, poly(PFPA) щетки ковалентно привитыми к SiO2 субстрата может быть подготовлен через простой двухэтапный процесс. Хотя некоторые подразделения ПРМ приносятся в жер?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана агентство развития (Грант № обороны UD170039ID).
2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
KCl | Invitrogen | AM9640G | |
NP-40 | VWR | E109-50ML | |
Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |