ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Ett protokoll för beredning av poly (pentafluorophenyl akrylat) (poly(PFPA)) ympade kiseldioxid pärlor presenteras. Poly(PFPA) functionalized ytan sedan orörlig med antikroppar och används framgångsrikt för protein separation genom immunoprecipitation.
Abstract
Vi visar en enkel metod för att förbereda poly (pentafluorophenyl akrylat) (poly(PFPA)) ympade kiseldioxid pärlor för antikropp immobilisering och efterföljande immunoprecipitation (IP) ansökan. Poly(PFPA) ympade ytan är beredd via en enkel tvåstegsprocess. I det första steget sätts 3-aminopropyltrietoxisilan (APTES) som en länkare molekyl på kisel ytan. I det andra steget, poly(PFPA) homopolymer, syntetiseras via reversibel tillägg och fragmentering kedja överföring (flotte) polymerisation, ympas till länkaren molekylen genom exchange reaktion mellan pentafluorophenyl (PFP) enheter på den polymer och amine grupperna på APTES. Nedfallet av APTES och poly(PFPA) på kiseldioxid partiklar är bekräftat av röntgen fotoelektronen spektroskopi (XPS), såväl som övervakas av partikel storlek förändringen mätt via dynamiska ljusspridning (DLS). För att förbättra den ytan hydrophilicitet av pärlor, delvis ersättning av poly(PFPA) med amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) utförs också. Den PEG-substituerade poly(PFPA) ympade kiseldioxid pärlor immobilizeds sedan med antikroppar för IP-programmet. För demonstration, en antikropp mot proteinkinas RNA-aktiverat (PKR) är anställd, och IP-effektivitet bestäms av Western blotting. Analysresultaten visar att antikropp orörlig pärlorna faktiskt kan användas för att berika PKR medan icke-specifika proteininteraktioner är minimal.
Introduction
Reaktiva polymer borstar har fått stort intresse under de senaste åren. De kan användas för att immobilisera funktionella molekyler på organiska eller oorganiska material att skapa aktiverade ytor med tillämpningar inom områden som upptäckt och separation1,2,3,4, 5. Bland den reaktiva polymerer rapporterade, är de som innehåller pentafluorophenyl ester enheter särskilt användbart på grund av deras höga reaktivitet med aminer och beständighet mot hydrolys6. En sådan polymer är poly(PFPA), och det kan vara lätt functionalized efter polymerisation med molekyler som innehåller primära eller sekundära aminer7,8,9,10. I ett exempel, var poly(PFPA) borstar reagerade med amino-spiropyrans att skapa ljus-lyhörd ytor7.
Utarbetandet av poly(PFPA) och dess tillämpningar har beskrivits i ett antal tidigare publikationer6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. I synnerhet rapporterade Theato och medarbetare syntesen av poly(PFPA) borstar via både ”ympning till” och ”ympning från” metoder7,8,10,11,12 . I den ”ympning till” tillvägagångssätt, en poly (methylsilsesquioxane)-poly (pentafluorophenyl akrylat) (poly(MSSQ-PFPA)) hybrid polymer var syntetiseras8,10,11,12. Komponenten poly(MSSQ) kunde form stark vidhäftning med ett antal olika organiska och oorganiska ytor, vilket gör att komponenten poly(PFPA) att bilda en borste lager på belagda materialets yta. I den ”ympning från” tillvägagångssätt, ytan initierade reversibel tillägg och fragmentering kedja överföring (SI-flotte) polymerisation anställdes att förbereda poly(PFPA) borstar7. I det här fallet fästes en surface immobiliserade kedja överföring agent (SI-CTA) först kovalent till substratet via kiseldioxid-silane reaktion. Den immobiliserade SI-CTA deltog sedan i SI-flotte polymerisation av PFPA monomerer, generera tätt packade poly(PFPA) borstar med stabil kovalent koppling till substratet.
Genom att utnyttja poly(PFPA) borstarna syntetiseras via SI-flotte polymerisation, visat vi nyligen immobilisering av antikroppar på poly(PFPA) ympade kiseldioxid partiklar och deras efterföljande ansökan i protein rening18. Användning av poly(PFPA) borstar för antikropp immobilisering konstaterades för att lösa ett antal frågor i samband med nuvarande protein avskiljande via IP. Konventionella IP är beroende av användningen av Protein A/G som en länkare för antikropp immobilisering19,20,21. Eftersom användningen av Protein från A/G tillåter antikropparna bifogas med en specifik orientering, uppnås höga mål antigen återhämtning effektivitet. Men lider användningen av Protein från A/G av icke-specifika protein interaktion samt förlust av antikroppar under protein återhämtning, vilka båda bidrar till en hög nivå av bakgrundsbrus. Lös dessa brister genom varit direkta crosslinking av antikroppar till ett fast stöd utforskade22,23,24. Effektiviteten av sådana tekniker är vanligtvis låg på grund av slumpmässig orientering av tvärbunden antikroppar. För poly(PFPA) ympade substratet är immobilisering av antikroppar permanent, uppnås genom exchange reaktion mellan PFP enheter och amine funktioner på antikroppar. Även om antikroppar orientering är fortfarande slumpmässigt förmåner systemet från att ha många reaktiva PFP platser, kontrollerbar av graden av polymerisation. Dessutom visade vi som av delvis ersättning av PFP enheter med amino-PEG, surface hydrophilicitet kan stämmas, ytterligare förbättra protein återvinning effektiviteten av systemet18. Sammantaget har poly(PFPA) ympade kiseldioxid partiklar visat sig vara ett effektivt alternativ till traditionella IP med rimlig effektivitet samt mycket renare bakgrund.
I detta bidrag redovisar vi en alternativ metod att förbereda poly(PFPA) ympade yta för antikropp immobilisering och IP-program. I en enkel tvåstegsprocess, som illustreras i figur 1, är en APTES linker molekyl först deponeras på kisel ytan, sedan poly(PFPA) polymeren bifogas kovalent linker molekylen genom reaktion mellan PFP enheter på den polymer och amine funktioner på APTES. Denna förberedelse metod möjliggör den permanenta crosslinking av poly(PFPA) till en yta med substrat, men undviker många komplikationer i samband med SI-CTA syntes och SI-flotte polymerisation av poly(PFPA) penslar. Delvis ersättning av PFP aggregat med amino-PEG kan fortfarande utföras, möjliggör finjustering av polymer borste ytegenskaper. Vi visar poly(PFPA) ympade kiseldioxid pärlorna således beredd kan vara orörlig med antikroppar och används för protein berikning via IP. Den detaljerade pärla arbetsgången, antikropp immobilisering och IP-testning är dokumenterade i denna artikel, för läsare intresserade söker ett alternativ till konventionella Protein A/G baserat IP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Poly(PFPA) Homopolymer
- Omkristallisering av AIBN
- Kombinera 5 g 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) med 25 mL metanol i en 250 mL bägare. Fördjupa bägaren i ett oljebad för 60 ° C, då kraftigt rör blandningen med en uppståndelse bar tills AIBN är helt upplöst.
- Filtrera den varma lösningen genom filterpapper (5-8 μm partikel kvarhållande) och lagra filtratet vid 4 ° C för att kristaller bildas långsamt.
- Samla de recrystallized AIBN genom filtrering. Kombinera de insamlade med 25 mL färsk metanol och upprepa processen omkristallisering.
- Torka 2 x recrystallized AIBN i vakuumugn vid rumstemperatur (RT) över natten. Förvara produkten i mörker vid <-10 ° C.
- Syntesen av bensyl dithiobenzoate25
- Förbereda en 500 mL tre-hals runda-botten kolv utrustad med en magnetisk uppståndelse bar, en refluxing kondensator, en dropptratt och en gummi septum. Anslut kolven till raden kväve gas genom refluxing kondensorn och spola ut insidan luft med kväve. Sätt in en termometer genom septum. Tillsätt 41 mL (0,041 mol) av 1 M lösning av phenylmagnesium metylbromid i tetrahydrofuran (THF) via en spruta genom samma septum.
- Varma phenylmagnesium metylbromid lösningen till 40 ° C i ett oljebad. Lägg sedan till 3,1 g (0,041 mol) av koldisulfid genom dropptratten långsamt, underhålla lösningen temperaturen vid 40 ° C.
- Tillsätt 7,1 g (0,042 mol) av bensyl metylbromid till den resulterande blandningen genom dropptratten över 15 min. öka reaktion temperatur till 50 ° C. Fortsätt omrörningen vid denna temperatur för 45 min.
- Överför reaktionsblandningen i en separatory tratt och späd med 15 mL kallt vatten. Extrahera produkt genom att tillsätta 15 mL dietyleter och ta bort den nedre vatten-lagret. Upprepa extraktion med dietyleter två gånger.
- Tvätta de kombinerade organiska faserna med rikligt med vatten och sedan saltlake (lösning av 50% (w/v) NaCl i vatten) och torka produkten över vattenfritt magnesiumsulfat.
- Ta bort lösningsmedlet i vakuum vid 35 ° C med en roterande indunstare.
- Rena produkten genom kolonnkromatografi med 400 mL kiselgel (porstorlek 60 Å, 63-200 mesh partikelstorlek) och petroleumeter som eluenten, ger 5 g bensyl dithiobenzoate (BDB) som röd olja. Bekräfta den produkt renheten genom 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8,02-7,99 (2 H, m), 7,55-7,50 (1 H, m), 7,41-7,29 (7 H, m), 4.60 (2 H, s).
- Syntes av poly(PFPA) via flotte polymerisation9,26
- Kommersiellt tillgängliga PFPA monomer innehåller liten mängd hämmare. Innan polymerisation, ta bort hämmare av monomeren passerar en engångsspruta packad med grundläggande aluminiumoxid.
- Tillsätt 0,4 mg (0,0024 mmol) av recrystallized AIBN, 4,3 mg (0,018 mmol) BDB, 1012 mg (4.25 mmol) hämmare-fri PFPA och 0,7 mL vattenfri anisole till en 20 mL Schlenk kolv.
- Anslut kolven till Schlenk linje och lufta blandningen med minst tre frysning-pump-tining cykler. Kort, frysa reaktionsblandningen i badkar flytande kväve. Tillämpa vakuum för att ta bort gasen i headspace. Tillslut kolven och ta sedan bort från flytande kväve så att innehållet till Tina i RT.
- Placera kolven i ett oljebad för 70 ° C, och reagera i 4 h under N2 laxermedel.
- För att avsluta reaktionen, ta bort kolven från i oljebad och exponera reaktion innehållet till luft.
- Fällningen polymeren i kalla metanol och sedan torka den återvunna polymeren i vakuumugn vid 40 ° C över natten.
- För att mäta polymer molekylvikt, Använd gel permeation chromatography (GPC). THF som använda den mobila fasen vid 35 ° C med en 1 mL/min flow rate och kalibreringskurvan med monodisperse polystyren standarder. För att förvärva GPC mätning, lös polymeren i THF (1-2 mg/mL) och filtrera genom 0,2 μm disponibla polytetrafluoreten (PTFE) filter. Injicera 100 μL av provet i instrumentet GPC. Konvertera den uppmätta prov retentionstiden till molekylvikt med hjälp av polystyren kalibreringskurvan.
2. förberedelse av Poly(PFPA) Functionalized SiO2 pärlor
- Behandling av SiO2 pärlor med APTES
- SiO2 partiklar finns i form av en 5% (w/v) vattenhaltig suspension. Kombinera 0.8 mL SiO2 suspension med 40 mg APTES och 8 mL metanol i en injektionsflaska 20 mL scintillation utrustad med en uppståndelse bar.
- Låt reaktionen att gå vidare på RT i 5 h med kraftig omrörning.
- Överför lösningen till ett koniskt rör. För att isolera APTES functionalized SiO2 pärlor, Centrifugera lösningen vid 10 000 x g i 5 min och sedan avlägsna supernatanten. Tvätta pärlorna genom att åter dispergering dem i 3 mL färsk metanol. Skaka tuben för hand för att blanda, men vid behov förbättra spridningen av ultraljudsbehandling i ett vattenbad i några sekunder. Centrifugera pärlor vid 10 000 x g i 5 min. ta bort supernatanten och upprepa tvättningen en gång.
- Kombinera metanol tvättas SiO2 pärlor med 3 mL av dimetyl sulfoxid (DMSO). Skaka blandningen för hand, eller om nödvändigt Sonikera i några sekunder tills pärlorna är fullt spridda i DMSO. Centrifugera pärlorna på 10 000 x g i 5 min, ta sedan bort supernatanten. Upprepa detta för att säkerställa fullständig lösningsmedel exchange från metanol till DMSO.
Obs: Den slutliga suspensionen innehåller den APTES functionalized SiO2 pärlor spridda i 4 mL av DMSO. - För att kontrollera fördelningen av partiklarnas storlek, utföra DLS analys. Ta en droppe av suspensionen upprättats i steg 2.1.4 och plats i en disponibel UV kyvetten. Späd provet genom att fylla i kyvetten med färska DMSO tills det är 2/3 fullt. Sätt provet i cell hållaren att börja datainsamling. För partikel storlek mätning, använda de följande inställningsparametrarna: temperatur: 25 ° C; Jämviktstiden tid: 120 s; Mått Längd: automatisk.
- För att kontrollera ytan sammansättning, utföra XPS analys. Torka ett litet prov från den avstängning som bereddes i steg 2.1.4 i vakuumugn vid 40 ° C över natten. Ta torkade polymer och pack jämnt på en 0,5 x 0,5 cm provhållaren. Läsa in provet i den höga vakuumkammare (10-8 torr) och börja datainsamling. För särskild XPS instrumentet används, generera de photoelectrons använda en monokromatisk Al Kα röntgen drivs 15 kV och 6,7 mA och samla använda hybrid läge förstoring med analyzer på en 50 eV passera energi för högupplösta spektra, och en 100 eV passera energi för elementär undersökningar.
- Ympning poly(PFPA) till APTES functionalized SiO2 pärlor
- Bered den poly(PFPA) genom upplösning 20 mg poly(PFPA) i 2 mL av DMSO i en 20 mL injektionsflaska av scintillation.
Observera: I denna studie används en relativt låg molekylvikt poly(PFPA) (20 kg/mol). Således, trots hög polymer koncentrationen (10 mg/mL), inga tecken på polymer crosslinking observeras. Om en högre molekylvikt polymer används, kan sedan polymer lösning koncentration behöva justeras för att undvika möjliga crosslinking. - Tillsätt 1 mL APTES functionalized SiO2 pärlor upphängd i DMSO (från steg 2.1.4) till poly(PFPA) lösning. Reagera på RT för 1 h under kraftig omrörning.
- Isolera poly(PFPA) ympade SiO2 pärlorna genom centrifugering vid 10 000 x g i 5 min, följt av borttagning av supernatanten. Tvätta pärlorna genom att lägga till 3 mL av DMSO och blanda genom att antingen skaka med hand eller några sekunder av ultraljudsbehandling. Centrifugera pärlorna på 10 000 x g i 5 min, ta sedan bort supernatanten. Upprepa tvättningen av poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor med DMSO två gånger.
- Tvätta pärlorna två gånger mer med trippel destillerat vatten (TDW). I det här steget kombinera pärlorna med 3 mL TDW, sedan blanda genom att skaka hand eller några sekunder av ultraljudsbehandling. Centrifugera pärlorna på 10 000 x g i 5 min, ta sedan bort supernatanten.
- För att kontrollera fördelningen av partiklarnas storlek, utföra DLS enligt anvisningarna i steg 2.1.5. För att kontrollera ytkemi, utföra XPS enligt anvisningarna i steg 2.1.6.
- Bered den poly(PFPA) genom upplösning 20 mg poly(PFPA) i 2 mL av DMSO i en 20 mL injektionsflaska av scintillation.
3. beredning av SiO2 pärlor ympade med PEG-substituerade Poly(PFPA)
- För att förbereda den poly(PFPA) lösningen, Lös 20 mg poly(PFPA) i 2 mL av DMSO i en 20 mL injektionsflaska av scintillation.
- För att bereda PEG lösning, lös amine-functionalized PEG i 1 mL av DMSO. Den exakta mängden PEG används bestäms av den önskade graden av PFP substitution, bestäms av den ekvation som visas nedan:
Mängden amino-PEG (g/g-poly(PFPA)) = (N_poly(PFPA) x % PEG-Sub) x (MW_PEG / MW_poly(PFPA))
där N_poly(PFPA) = poly(PFPA) grad av polymerisation
% PEG-Sub = procent PEG substitution
MW_PEG = molekylvikt för amino-PEG
MW_ poly(PFPA) = molekylvikt för poly(PFPA) - Överför PEG lösningen till poly(PFPA) lösning. Reagera på RT för 1 h under kraftig omrörning.
- För att förbereda APTES functionalized SiO2 pärlor upphängd i DMSO, följ samma steg som visas i steg 2.1. Över 1 mL av suspensionen pärla till en PEG-substituerade poly(PFPA) lösning beredd enligt steg 3.3. Låt den ympning mellan poly(PFPA) och APTES functionalized SiO2 pärlor för att fortsätta på RT för 1 h under kraftig omrörning.
- Isolera pärlorna genom centrifugering vid 10 000 x g i 5 min, följt av borttagning av supernatanten. Tvätta pärlorna genom att lägga till 3 mL av DMSO och blanda genom att antingen skaka med hand eller några sekunder av ultraljudsbehandling. Centrifugera pärlorna på 10 000 x g i 5 min, ta sedan bort supernatanten. Upprepa den DMSO tvätten två gånger.
- Tvätta pärlorna två gånger mer med TDW. I det här steget kombinera pärlorna med 3 mL TDW, sedan blanda genom att skaka hand eller några sekunder av ultraljudsbehandling. Centrifugera pärlorna på 10 000 x g i 5 min, ta sedan bort supernatanten.
- Torka pärlor vid 40 ° C i vakuum ugn över natten.
4. antikropp immobilisering på Poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor
Obs: Samma procedur används oavsett procent PEG substitution på poly(PFPA). Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom upplösning PBS tablett i TDW. Förbereda 0,1% (v/v) fosfatbuffrad saltlösning med Tween-20 (PBST) genom att lägga till 1/1000 av Tween-20 i PBS.
- Lägga till 5 mg poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor i en 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tvätta pärlorna genom att lägga till 800 µL av PBS och blanda väl genom vortexa. Centrifugera pärlor vid 10 000 x g på RT i 1 min. ta bort supernatanten och upprepa tvättningen tre gånger.
- Tillsätt 350 µL av färska PBS, 50 µL 0,1% (v/v) PBST och 6,67 µg av antikropp. Inkubera ~ 20 h på en rotator vid 4 ° C.
- Tvätta pärlorna för att avlägsna obunden antikroppar. Centrifugera pärlorna på 400 x g och 4 ° C i 1 min. avlägsna supernatanten och lägga 400 μl lyseringsbuffert noggrant. Försiktigt återsuspendering pärlorna av pipettering upp och ner för fem gånger.
Obs: Lyseringsbuffert brukade tvätta pärlorna bör vara samma som används under cell lysis och IP, förutom att tillägg av Ditiotreitol och proteas hämmare är valfria, (se steg 5). - Upprepa detta tvätta tre gånger. Efter den sista tvättningen, avlägsna supernatanten så mycket som möjligt.
5. cell Lysis och Immunoprecipitation
- Beredning av lyseringsbuffert och tvättbuffert
- Förbereda lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 0,5% (v/v) NP-40, 10% (v/v) glycerol, 1 mM Ditiotreitol (DTT) och proteas hämmare cocktail).
- Förbered tvättbufferten (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 0,1% (v/v) NP-40 och 10% (v/v) glycerol).
- Lagra buffertlösningarna vid 4 ° C.
- Beredning av cellerna
- Utsäde cellerna (HeLa cells) en eller två dagar innan IP experiment och odla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
- Samla ca 1,4 x 107 celler med en cell skrapan och överföring in i en 15 mL koniska rör. Centrifugera cellerna vid 380 x g på RT i 3 min. avlägsna supernatanten och slamma med 1 mL kall PBS och överföring i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Centrifugera cellerna vid 10 000 x g vid 4 ° C i 30 s. ta bort supernatanten klockrent. Cell pellets kan lagras vid-80 ° C efter att ta bort supernatanten.
- Beredning av cell lysates
- Återsuspendering cellpelleten med 400 µL av lyseringsbuffert. Sonikera cellerna med hjälp av en ultrasonicator.
- Efter ultraljudsbehandling, vortex kort och centrifugera det lysate vid 20 000 x g vid 4 ° C i 10 min.
- Överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL centrifugrör.
- Immunoprecipitation
- Över 300 µL av cell lysate till tidigare beredda antikropp inkuberas poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor. Behålla 30 µL av cellen lysate som ingång provet i en ny mikrocentrifug rör. Lagra ingång provet vid 4 ° C.
Obs: Den totala mängden protein i cell lysate bör vara ungefär 4 mg. - Inkubera lysate/pärlor blandningen för 3 h på en rotator vid 4 ° C.
- Centrifugera blandningen vid 400 x g vid 4 ° C i 1 min. ta bort supernatanten och tillsätt 400 µL tvättlösning noggrant. Försiktigt återsuspendering pärlorna av pipettering upp och ner ungefär fem gånger.
- Upprepa detta tvätta tre gånger. Efter den sista tvättningen, avlägsna supernatanten så mycket som möjligt.
- Förbered 2 x sodium dodecyl sulfate (SDS) lastning färgämne (25% (v/v) glycerol, 0,1% (w/v) bromo fenol blå (BPB), 60 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2% (w/v) SDS och 2,75 mM 2-merkaptoetanol). Butik 2 x SDS lastning dye vid-20 ° C. Tillsätt 30 µL 2 x SDS lastning färgämne i pärlor och lagrade ingång provet, och värma dem för 10 min vid 95 ° C.
- Efter upphettning, analysera provet med Western blotting27, eller förvara provet vid-20 ° C.
- Över 300 µL av cell lysate till tidigare beredda antikropp inkuberas poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor. Behålla 30 µL av cellen lysate som ingång provet i en ny mikrocentrifug rör. Lagra ingång provet vid 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk för beredning av poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor, med eller utan PEG substitution visas i figur 1. För övervakning av APTES och poly(PFPA) ympning process, bare SiO2 pärlor, APTES functionalized SiO2 pärlor, och poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor kännetecknas av både DLS (figur 2) och XPS (figur 3). IP-effektivitetsvinsterna av pärlorna bestäms av Western blotting. Figur 4 visar den Western blotting resultat för IP med 1% PEG-substituerade poly(PFPA) ympade pärlor, där pärlorna inkuberas med ingen antikropp, icke-specifika antikroppar eller anti-PKR antikropp. Figur 5 visar Western blotting resultaten för IP använder 0% PEG-substituerade poly(PFPA) ympade pärlor och 1% PEG-substituerade poly(PFPA) ympade pärlor, både inkuberas med anti-PKR antikroppar.
Figur 1: Schematisk för beredning av poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor med APTES som en länkare molekyl. (en) Poly(PFPA) ympade pärlor. (b) delvis PEG-substituerade poly(PFPA) ympade pärlor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: DLS mätningar för (a) bare SiO2 pärlor (SiO2), (b) APTES functionalized SiO2 pärlor (APTES-SiO2) och (c) poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor (poly (PFPA)-SiO2), spridda i DMSO. Z-genomsnittliga diameter (d) och polydispertion index (PDI) för varje prov redovisas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: XPS spectra för bare SiO2 pärlor (SiO2), APTES functionalized SiO2 pärlor (APTES-SiO2), och poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor (poly (PFPA)-SiO2). Topparna undersöktes motsvarar (en) Si 2 p, (b) O 1s, (c), N 1s, och (d), F 1s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Western blotting resultat för IP med 1% PEG-substituerade poly(PFPA) ympade pärlor, behandlas med ingen antikropp (lane 2), en icke-specifik antikropp blandning, normal kanin IgG (lane 3) eller anti-PKR antikropp (lane 4). Lane 1 visar ingående protein blandningen innan IP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Western blotting resultat för IP använder 0% PEG-substituerade poly(PFPA) ympade pärlor (lane 2) och 1% PEG-substituerade poly(PFPA) ympade pärlor (lane 3), båda behandlas med anti-PKR antikroppar. Lane 1 visar ingående protein blandningen innan IP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syntesen av poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor illustreras i figur 1. Genom att använda APTES som en länkare molekyl, kan poly(PFPA) borstar kovalent ympade SiO2 substratet förberedas via en enkel tvåstegsprocess. Även om vissa av enheterna som PFP offras för reaktionen med APTES, förväntas ett stort antal PFP enheterna förbli tillgängliga för senare reaktion med antingen amino-PEG eller antikroppar. PFP grupper är kända för att bilda låg energi ytor så poly(PFPA) borstar gör inte solvate väl i vatten28. Antikropparna behöver vara orörlig på poly(PFPA) borstar för IP-programmet, och denna exchange reaktion sker i vattenlösning buffertlösning för att bevara aktiviteten av antikroppar. Som rapporterats i vår föregående publikation, kan delvis ersättning av PFP aggregat med hydrofil molekyler såsom amine-functionalized PEG förbättra ytan hydrophilicitet, leder till ökad antikropp immobilisering effektivitet18. I denna studie delvis PEG substituerade poly(PFPA) är också beredd, då ympade på SiO2 ytan använder samma APTES linker molekyl. Sammantaget kan de metoder som illustreras i figur 1 beredning av poly(PFPA) ympade ytor med olika grader av PEG substitution. Dessa polymer borstar med avstämbara ytegenskaper ger en idealisk plattform för antikropp immobilisering och efterföljande IP-ansökan.
Bead förberedelseprocessen övervakas av både DLS och XPS. DLS resultaten för olika functionalized SiO2 pärlor i DMSO sammanfattas i figur 2. Bare SiO2 pärlorna uppvisar hydrodynamiska diameter av 666 nm, i samråd med tillverkaren rapporterade pärla storlek (0,676 μm. SD = 0,03 μm). Efter APTES behandling, pärla diametern ökar till 740 nm. och med poly(PFPA) behandling, pärla diameter ytterligare ökar till 1889 nm. Det är viktigt att påpeka att polydispertion index (PDI) för poly(PFPA) ympade pärlorna är ganska stor (PDI = 0,76), vilket är ett tecken på dålig kvalitet prov som innehåller stora aggregat. Även om DLS kurvan visar bara en nano-storlek peak, kan små aggregat uppgå i suspensionen. Functionalized SiO2 pärlorna undersöks också av XPS att bestämma ytan sammansättning (figur 3). Efter APTES behandling, N 1s peak är associerad med amine grupperna på APTES upptäcks. Och, efter poly(PFPA) behandling, F 1s peak är associerad med PFP enheterna på polymeren upptäcks. Dessa uppgifter visar tillsammans framgångsrika funktionalisering av SiO2 ytan först med APTES, sedan med poly(PFPA).
För att visa att poly(PFPA) ympade pärlorna kan användas för protein berikning via IP, vi använde 1% PEG-substituerade poly(PFPA) ympade pärlor, och ruvade dem med ingen antikropp, en icke-specifik kanin IgG antikroppar blandning eller anti-PKR antikropp. Cell lysate innehållande målet PKR var ur cellen och PKR anrikning utfördes sedan via IP använder tre typen av pärlor. För att avgöra IP-effektivitet, analyserades de eluerade protein proverna mot två olika antikroppar via Western blotting. Anti-PKR antikropp användes för att visualisera mängden PKR återvinns. Och anti-GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas) antikropp användes som en negativ kontroll som GAPDH är en riklig protein som inte samverkar med PKR. Som visas i figur 4, pärlor orörlig utan antikropp eller icke-specifik antikropp blandning resulterar i ingen PKR återhämtning. Pärlorna inkuberas med anti-PKR antikropp kan däremot framgångsrikt berika PKR, vilket framgår av förekomsten av ett starkt PKR band och avsaknad av GAPDH band. Dessa resultat tyder på PEG-substituerade poly(PFPA) borstar kan faktiskt functionalized med antikroppar och användas för selektiv anrikning av målprotein. Observera att när protein återvinning effektivitetsvinsterna av olika bead system jämförs IP experimenten samt den efterföljande Western blotting analyser bör göras samtidigt. På grund av de inneboende variationerna i utförandet av dessa experiment, bör inte uppgifterna på separata prövningar jämföras direkt.
Som rapporterats tidigare spelar den ytan hydrophilicitet poly(PFPA) borstar en nyckelroll i IP effektivitet18. Figur 5 visar den Western blotting data för IP återhämtade sig protein prover med 0% PEG-substituerade poly(PFPA) ympade pärlor och 1% PEG-substituerade poly(PFPA) ympade pärlor. I båda fallen var pärlorna orörlig med anti-PKR antikroppar. Medan användningen av 0% PEG-substituerade poly(PFPA) resulterar i låg PKR återvinningseffektivitet, visar de 1% PEG-substituerade poly(PFPA) signifikant förbättring, indikeras av selektiv anrikning av målet PKR över målarter GAPDH. I samförstånd med våra tidigare publikation18ökat PEG behandling den yta hydrophilicitet poly(PFPA) borsten, vilket gör att fler PFP enheter ska vara tillgänglig för antikropp immobilisering, vilket leder till den observerade förbättringen i IP-effektivitet. Observera att procent PEG substitution rapporterade i denna studie inte kan direkt jämföras med rapporterade i vår tidigare studie som används SI-flotte syntetiseras poly(PFPA) penslar. De två fallen använder mycket olika polymer borste förberedelse metoder, så mängden PFP-enheter som är tillgängliga med lika PEG lastning förväntas vara mycket olika. Dock håller yttranden från de två studierna kvalitativt, båda pekar på ytan hydrophilicitet som en nyckel kontroll parameter för att uppnå hög IP-effektivitet.
Även ytan hydrophilicitet påverkar mängden antikroppar fäster poly(PFPA) borstar, har den också en betydande effekt på IP-bakgrund på grund av icke-specifika anrikning. I en typisk IP-experiment utförs många tvätt steg för att avlägsna obundna proteiner. När pärlorna är mycket vattenavvisande, såsom de med 0% PEG substitution, de tenderar att bilda stora aggregat som är svåra att bryta isär. I detta fall, icke-specifika proteiner kan vara instängd i de sammanlagda strukturerna och tvätt tillräckligt ta bort inte dem, vilket leder till en ökning i bakgrunden. Därför, när du utför IP, är det viktigt att optimera egenskapen pärla yta och bör uppmärksammas att säkerställa pärlorna är rimligen spridda.
Sammantaget visade vi en enkel tvåstegsprocess att förbereda poly(PFPA) ympade SiO2 pärlor, och visade att den ytan hydrophilicitet av pärlor kan finjusteras med delvis ersättning av PFP aggregat med amino-PEG. Dessa polymer borstar användes framgångsrikt för mål protein berikning via IP, presenterar sig som ett alternativ till traditionella Protein A/G baserat IP-teknik. Vi förväntar oss poly(PFPA) borstar för att hitta program på många andra områden som kräver biomolecule immobilisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av byrån för Defense utveckling (Grant nr. UD170039ID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2-Azobisisobutyronitrile, 99% | Daejung Chemicals | 1102-4405 | |
| Methyl alcohol for HPLC, 99.9% | Duksan Pure Chemicals | d62 | |
| Phenylmagnesium bromide solution 1.0 M in THF | Sigma-Aldrich | 331376 | |
| Carbon disulfide anhydrous, ≥99% | Sigma-Aldrich | 335266 | |
| Benzyl bromide, 98% | Sigma-Aldrich | B17905 | |
| Petroleum ether, 90% | Samchun Chemicals | P0220 | |
| Ethyl ether, 99% | Daejung Chemicals | 4025-4404 | |
| Magnesium sulfate anhydrous, powder, 99% | Daejung Chemicals | 5514-4405 | |
| Pentafluorophenyl acrylate | Santa Cruz Biotechnology | sc-264001 | contains inhibitor |
| Aluminium oxide, activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Daejung Chemicals | 7548-4400 | |
| Anisole anhydrous, 99.7% | Sigma-Aldrich | 296295 | |
| Silica nanoparticle | Microparticles GmbH | SiO2-R-0.7 | 5% w/v aqueous suspension |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane, >96.0% | Tokyo Chemical Industry | T1255 | |
| Dimethyl sulfoxide for HPLC, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| Amino-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether | Polymer Source | P16082-EGOCH3NH2 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Takara | T9181 | |
| Tween-20 | Calbiochem | 9480 | |
| Tris-HCl (pH 8.0) | Invitrogen | AM9855G | |
| KCl | Invitrogen | AM9640G | |
| NP-40 | VWR | E109-50ML | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Dithiothreitol | Biosesang | D1037 | |
| Protease inhibitor | Merck | 535140-1MLCN | |
| Bromo phenol blue | Sigma-Aldrich | B5525-5G | |
| Tris-HCl (pH 6.8) | Biosolution | BT033 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Biosolution | BS003 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| PKR Antibody | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| HeLa | Korea Cell Line Bank | 10002 | |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | WUC-D10H | |
| Ultrasonicator | BMBio | BR2006A | |
| Centrifuge I | Eppendorf | 5424 R | |
| Centrifuge II | LABOGENE | 1736R | |
| Rotator | FINEPCR | ROTATOR/AG | |
| Vacuum oven | DAIHAN Scientific | ThermoStable OV-30 | |
| Gel permeation chromatography (THF) | Agilent Technologies | 1260 Infinity II | |
| X-ray photoelectron spectrometer | Thermo VG Scientific | Sigma Probe | |
| Dynamic light scattering | Malvern Instruments | ZEN 3690 |
References
- Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).
- Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films. Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).
- You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors. Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).
- Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules. Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).
- Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R.
- Das, A., Theato, P. Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules. Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).
- Choi, J., et al. Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).
- Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).
- Son, H., et al. Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films. Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).
- Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization. Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).
- Kessler, D., Theato, P. Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability. Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).
- Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox. Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).
- Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials. European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).
- Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates. Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).
- Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification. Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).
- He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers. Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).
- Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification. Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).
- Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification. Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).
- Cullen, S. E., Schwartz, B. D. An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci. The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).
- Sisson, T. H., Castor, C. W. An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose. Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).
- Peritz, T., et al.
- Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization. Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).
- Yao, Y., et al. NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).
- Ma, J., et al. Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays. Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).
- Chong, Y., et al. Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R). Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).
- Jochum, F. D., Theato, P. Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers. Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2018).
- Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues. Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).
Tags
Kemi fråga 141 Poly (pentafluorophenyl akrylat) 3-aminopropyltrietoxisilan reaktiva polymer borste efter polymerisation funktionalisering antikropp immobilisering immunoprecipitationErratum
Formal Correction: Erratum: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification
Posted by JoVE Editors on 04/30/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification. Throughout the article, the term "3-aminopropyltriethoxysilane" has been replaced with "3-aminopropyltrimethoxysilane", and "APTES" with "APTMS".
The Keywords were updated from:
Poly(pentafluorophenyl acrylate), 3-aminopropyltriethoxysilane, reactive polymer brush, post-polymerization functionalization, antibody immobilization, immunoprecipitation
to:
Poly(pentafluorophenyl acrylate), 3-aminopropyltrimethoxysilane, reactive polymer brush, post-polymerization functionalization, antibody immobilization, immunoprecipitation
The Abstract was updated from:
We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent immunoprecipitation (IP) application. The poly(PFPA) grafted surface is prepared via a simple two-step process. In the first step, 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited as a linker molecule onto the silica surface. In the second step, poly(PFPA) homopolymer, synthesized via the reversible addition and fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, is grafted to the linker molecule through the exchange reaction between the pentafluorophenyl (PFP) units on the polymer and the amine groups on APTES. The deposition of APTES and poly(PFPA) on the silica particles are confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), as well as monitored by the particle size change measured via dynamic light scattering (DLS). To improve the surface hydrophilicity of the beads, partial substitution of poly(PFPA) with amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) is also performed. The PEG-substituted poly(PFPA) grafted silica beads are then immobilized with antibodies for IP application. For demonstration, an antibody against protein kinase RNA-activated (PKR) is employed, and IP efficiency is determined by Western blotting. The analysis results show that the antibody immobilized beads can indeed be used to enrich PKR while non-specific protein interactions are minimal.
to:
We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent immunoprecipitation (IP) application. The poly(PFPA) grafted surface is prepared via a simple two-step process. In the first step, 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) is deposited as a linker molecule onto the silica surface. In the second step, poly(PFPA) homopolymer, synthesized via the reversible addition and fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, is grafted to the linker molecule through the exchange reaction between the pentafluorophenyl (PFP) units on the polymer and the amine groups on APTMS. The deposition of APTMS and poly(PFPA) on the silica particles are confirmed by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), as well as monitored by the particle size change measured via dynamic light scattering (DLS). To improve the surface hydrophilicity of the beads, partial substitution of poly(PFPA) with amine-functionalized poly(ethylene glycol) (amino-PEG) is also performed. The PEG-substituted poly(PFPA) grafted silica beads are then immobilized with antibodies for IP application. For demonstration, an antibody against protein kinase RNA-activated (PKR) is employed, and IP efficiency is determined by Western blotting. The analysis results show that the antibody immobilized beads can indeed be used to enrich PKR while non-specific protein interactions are minimal.
The fourth paragraph of the Introduction was updated from:
In this contribution, we report an alternative method to prepare poly(PFPA) grafted surface for antibody immobilization and IP application. In a simple two-step process, as illustrated in Figure 1, an APTES linker molecule is first deposited onto the silica surface, then the poly(PFPA) polymer is covalently attached to the linker molecule through the reaction between the PFP units on the polymer and the amine functions on APTES. This preparation method allows for the permanent crosslinking of poly(PFPA) to a substrate surface, but avoids the many complications associated with SI-CTA synthesis and SI-RAFT polymerization of poly(PFPA) brushes. Partial substitution of the PFP units with amino-PEG can still be performed, allowing fine-tuning of the polymer brush surface properties. We show the poly(PFPA) grafted silica beads thus prepared can be immobilized with antibodies and used for protein enrichment via IP. The detailed bead preparation procedure, antibody immobilization, and IP testing are documented in this article, for readers interested in seeking an alternative to conventional Protein A/G based IP.
to:
In this contribution, we report an alternative method to prepare poly(PFPA) grafted surface for antibody immobilization and IP application. In a simple two-step process, as illustrated in Figure 1, an APTMS linker molecule is first deposited onto the silica surface, then the poly(PFPA) polymer is covalently attached to the linker molecule through the reaction between the PFP units on the polymer and the amine functions on APTMS. This preparation method allows for the permanent crosslinking of poly(PFPA) to a substrate surface, but avoids the many complications associated with SI-CTA synthesis and SI-RAFT polymerization of poly(PFPA) brushes. Partial substitution of the PFP units with amino-PEG can still be performed, allowing fine-tuning of the polymer brush surface properties. We show the poly(PFPA) grafted silica beads thus prepared can be immobilized with antibodies and used for protein enrichment via IP. The detailed bead preparation procedure, antibody immobilization, and IP testing are documented in this article, for readers interested in seeking an alternative to conventional Protein A/G based IP.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Treatment of SiO2 beads with APTES
to:
Treatment of SiO2 beads with APTMS
Step 2.1.1 of the Protocol was updated from:
SiO2 particles are available in the form of a 5% (w/v) aqueous suspension. Combine 0.8 mL of SiO2 suspension with 40 mg of APTES and 8 mL of methanol in a 20 mL scintillation vial equipped with a stir bar.
to:
SiO2 particles are available in the form of a 5% (w/v) aqueous suspension. Combine 0.8 mL of SiO2 suspension with 40 mg of APTMS and 8 mL of methanol in a 20 mL scintillation vial equipped with a stir bar.
Step 2.1.3 of the Protocol was updated from:
Transfer the solution to a conical tube. To isolate the APTES functionalized SiO2 beads, centrifuge the solution at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Wash the beads by re-dispersing them in 3 mL of fresh methanol. Shake the tube by hand for mixing, but if necessary, improve the dispersion by sonication in a water bath for a few seconds. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min. Remove the supernatant and repeat the wash step one more time.
to:
Transfer the solution to a conical tube. To isolate the APTMS functionalized SiO2 beads, centrifuge the solution at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Wash the beads by re-dispersing them in 3 mL of fresh methanol. Shake the tube by hand for mixing, but if necessary, improve the dispersion by sonication in a water bath for a few seconds. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min. Remove the supernatant and repeat the wash step one more time.
Step 2.1.4 of the Protocol was updated from:
NOTE: The final suspension contains the APTES functionalized SiO2 beads dispersed in 4 mL of DMSO.
to:
Combine the methanol washed SiO2 beads with 3 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO). Shake the mixture by hand, or if necessary sonicate for a few seconds, until the beads are fully dispersed in DMSO. Centrifuge the beads at 10,000 x g for 5 min, then remove the supernatant. Repeat the step to ensure complete solvent exchange from methanol to DMSO.
NOTE: The final suspension contains the APTMS functionalized SiO2 beads dispersed in 4 mL of DMSO.
Step 2.2 of the Protocol was updated from:
Grafting poly(PFPA) to APTES functionalized SiO2 beads
to:
Grafting poly(PFPA) to APTMS functionalized SiO2 beads
Step 2.2.2 of the Protocol was updated from:
Add 1 mL of APTES functionalized SiO2 beads suspended in DMSO (from Step 2.1.4) to the poly(PFPA) solution. React at RT for 1 h with vigorous stirring.
to:
Add 1 mL of APTMS functionalized SiO2 beads suspended in DMSO (from Step 2.1.4) to the poly(PFPA) solution. React at RT for 1 h with vigorous stirring.
Step 3.4 of the Protocol was updated from:
To prepare APTES functionalized SiO2 beads suspended in DMSO, follow the same steps shown in Step 2.1. Transfer 1 mL of the bead suspension into the PEG-substituted poly(PFPA) solution prepared in Step 3.3. Allow the grafting between poly(PFPA) and APTES functionalized SiO2 beads to proceed at RT for 1 h with vigorous stirring.
to:
To prepare APTMS functionalized SiO2 beads suspended in DMSO, follow the same steps shown in Step 2.1. Transfer 1 mL of the bead suspension into the PEG-substituted poly(PFPA) solution prepared in Step 3.3. Allow the grafting between poly(PFPA) and APTMS functionalized SiO2 beads to proceed at RT for 1 h with vigorous stirring.
The first paragraph of the Representative Results was updated from:
A schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads, with or without PEG substitution is shown in Figure 1. To monitor the APTES and poly(PFPA) grafting process, bare SiO2 beads, APTES functionalized SiO2 beads, and poly(PFPA) grafted SiO2 beads are characterized by both DLS (Figure 2) and XPS (Figure 3). IP efficiencies of the beads are determined by Western blotting. Figure 4 shows the Western blotting results for IP using 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, where the beads are incubated with no antibody, a non-specific antibody, or anti-PKR antibody. Figure 5 shows the Western blotting results for IP using 0% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads and 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, both incubated with anti-PKR antibodies.
to:
A schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads, with or without PEG substitution is shown in Figure 1. To monitor the APTMS and poly(PFPA) grafting process, bare SiO2 beads, APTMS functionalized SiO2 beads, and poly(PFPA) grafted SiO2 beads are characterized by both DLS (Figure 2) and XPS (Figure 3). IP efficiencies of the beads are determined by Western blotting. Figure 4 shows the Western blotting results for IP using 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, where the beads are incubated with no antibody, a non-specific antibody, or anti-PKR antibody. Figure 5 shows the Western blotting results for IP using 0% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads and 1% PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads, both incubated with anti-PKR antibodies.
Figure 1 was updated from:
Figure 1: Schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads using APTES as a linker molecule. (a) Poly(PFPA) grafted beads. (b) Partially PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads.
to:
Figure 1: Schematic for the preparation of poly(PFPA) grafted SiO2 beads using APTMS as a linker molecule. (a) Poly(PFPA) grafted beads. (b) Partially PEG-substituted poly(PFPA) grafted beads.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: DLS measurements for (a) bare SiO2 beads (SiO2), (b) APTES functionalized SiO2 beads (APTES-SiO2), and (c) poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2), dispersed in DMSO. The Z-average diameter (d) and polydispersity index (PDI) of each sample are reported.
to:
Figure 2: DLS measurements for (a) bare SiO2 beads (SiO2), (b) APTMS functionalized SiO2 beads (APTMS-SiO2), and (c) poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2), dispersed in DMSO. The Z-average diameter (d) and polydispersity index (PDI) of each sample are reported.
Figure 3 was updated from:
Figure 3: XPS spectra for bare SiO2 beads (SiO2), APTES functionalized SiO2 beads (APTES-SiO2), and poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2). The peaks examined correspond to (a) Si 2p, (b) O 1s, (c) N 1s, and (d) F 1s.
to:
Figure 3: XPS spectra for bare SiO2 beads (SiO2), APTMS functionalized SiO2 beads (APTMS-SiO2), and poly(PFPA) grafted SiO2 beads (poly(PFPA)-SiO2). The peaks examined correspond to (a) Si 2p, (b) O 1s, (c) N 1s, and (d) F 1s.
The first and second paragraphs of the Discussion were updated from:
The synthesis of poly(PFPA) grafted SiO2 beads is illustrated in Figure 1. By employing APTES as a linker molecule, poly(PFPA) brushes covalently grafted to SiO2 substrate can be prepared via a simple two-step process. Although some of the PFP units are sacrificed for the reaction with APTES, a large number of the PFP units are expected to remain available for later reaction with either amino-PEG or antibodies. The PFP groups are known to form low energy surfaces so poly(PFPA) brushes do not solvate well in water28. For IP application, the antibodies need to be immobilized on the poly(PFPA) brushes, and this exchange reaction is done in aqueous buffer solution in order to preserve the activity of the antibodies. As reported in our previous publication, partial substitution of the PFP units with hydrophilic molecules such as amine-functionalized PEG can improve surface hydrophilicity, leading to increased antibody immobilization efficiency18. In this study, partially PEG substituted poly(PFPA) is also prepared, then grafted to the SiO2 surface using the same APTES linker molecule. Overall, the methods illustrated in Figure 1 allow the preparation of poly(PFPA) grafted surfaces with different degrees of PEG substitution. These polymer brushes with tunable surface properties provide an ideal platform for antibody immobilization and subsequent IP application.
The bead preparation process is monitored by both DLS and XPS. The DLS results for various functionalized SiO2 beads in DMSO are summarized in Figure 2. The bare SiO2 beads exhibit hydrodynamic diameter of 666 nm, in agreement with the manufacturer reported bead size (0.676 μm; SD = 0.03 μm). After APTES treatment, the bead diameter increases to 740 nm; and with poly(PFPA) treatment, the bead diameter further increases to 1889 nm. It is important to point out that the polydispersity index (PDI) for the poly(PFPA) grafted beads is rather large (PDI = 0.76), which is indicative of poor quality sample containing large aggregates. Although the DLS curve only shows one nano-sized peak, small amount of aggregates may be present in the suspension. The functionalized SiO2 beads are also examined by XPS to determine surface composition (Figure 3). Following APTES treatment, N 1s peak associated with the amine groups on APTES is detected. And, following poly(PFPA) treatment, F 1s peak associated with the PFP units on the polymer is detected. Together these data show the successful functionalization of the SiO2 surface, first with APTES, then with poly(PFPA).
to:
The synthesis of poly(PFPA) grafted SiO2 beads is illustrated in Figure 1. By employing APTMS as a linker molecule, poly(PFPA) brushes covalently grafted to SiO2 substrate can be prepared via a simple two-step process. Although some of the PFP units are sacrificed for the reaction with APTMS, a large number of the PFP units are expected to remain available for later reaction with either amino-PEG or antibodies. The PFP groups are known to form low energy surfaces so poly(PFPA) brushes do not solvate well in water28. For IP application, the antibodies need to be immobilized on the poly(PFPA) brushes, and this exchange reaction is done in aqueous buffer solution in order to preserve the activity of the antibodies. As reported in our previous publication, partial substitution of the PFP units with hydrophilic molecules such as amine-functionalized PEG can improve surface hydrophilicity, leading to increased antibody immobilization efficiency18. In this study, partially PEG substituted poly(PFPA) is also prepared, then grafted to the SiO2 surface using the same APTMS linker molecule. Overall, the methods illustrated in Figure 1 allow the preparation of poly(PFPA) grafted surfaces with different degrees of PEG substitution. These polymer brushes with tunable surface properties provide an ideal platform for antibody immobilization and subsequent IP application.
The bead preparation process is monitored by both DLS and XPS. The DLS results for various functionalized SiO2 beads in DMSO are summarized in Figure 2. The bare SiO2 beads exhibit hydrodynamic diameter of 666 nm, in agreement with the manufacturer reported bead size (0.676 μm; SD = 0.03 μm). After APTMS treatment, the bead diameter increases to 740 nm; and with poly(PFPA) treatment, the bead diameter further increases to 1889 nm. It is important to point out that the polydispersity index (PDI) for the poly(PFPA) grafted beads is rather large (PDI = 0.76), which is indicative of poor quality sample containing large aggregates. Although the DLS curve only shows one nano-sized peak, small amount of aggregates may be present in the suspension. The functionalized SiO2 beads are also examined by XPS to determine surface composition (Figure 3). Following APTMS treatment, N 1s peak associated with the amine groups on APTMS is detected. And, following poly(PFPA) treatment, F 1s peak associated with the PFP units on the polymer is detected. Together these data show the successful functionalization of the SiO2 surface, first with APTMS, then with poly(PFPA).
