Solid-støttet, protein-fri, doble phospholipid bilayer membraner (DLBM) kan forvandles til komplekse og dynamiske lipid nanotube nettverk og kan tjene som 2D opp modeller av det endoplasmatiske retikulum.
Vi presenterer en praktisk metode for å danne en opp-strukturelle organelle modell for det endoplasmatiske retikulum (ER). Modellen består av svært tett lipidic nanorør som, morfologi og dynamikk, minner av Akutten. Nettverkene er avledet fra phospholipid dobbel bilayer membran patcher følge et gjennomsiktig Al2O3 substrat. Vedheft er formidlet av Ca2 + i ambient bufferen. Etterfølgende utarming av Ca2 + med BAPTA/EDTA forårsaker tilbakekalling av membranen, som resulterer i spontan lipid nanotube nettverk formasjon. Metoden bare fosfolipider og microfabricated flater for enkel dannelsen av en ER modell og krever ikke tillegg av proteiner eller kjemisk energi (f.eks GTP eller ATP). I motsetning til 3D morfologi av mobilnettet endoplasmatiske retikulum er modellen todimensjonale (riktignok nanotube dimensjoner, geometri, strukturen og dynamikken vedlikeholdes). Denne unike i vitro ER modellen består av bare noen komponenter, er lett å konstruere og kan observeres under lys mikroskop. Den resulterende strukturen kan være ytterligere dekorert for ytterligere funksjonalitet som tillegg av ER-assosiert proteiner eller partikler å studere transport fenomener blant rør. De kunstige beskrevet her er egnet strukturelle modeller for cellular ER, som unike karakteristisk morfologi har vist seg å være relatert til sin biologiske funksjon, mens detaljer om dannelsen av rørformede domenet og rearrangements innen er fortsatt ikke helt forstått. Vi oppmerksom på at denne metoden bruker Al2O3 tynn-film-belagt mikroskopi coverslips, som er kommersielt tilgjengelig men krever spesielle bestillinger. Derfor er det lurt å ha tilgang til en microfabrication for forberedelse.
ER utfører viktige oppgaver i biologiske cellen inkludert proteinfolding, lipid syntese og kalsium forskrift1,2. ER morfologi er iboende til funksjonene utføres. Den kombinerer planar stabler og tett-dynamisk rørformede domener, som kontinuerlig kommuniserer med cytoskeleton og gjennomgå konstant bevegelse og omorganisering. Noen av remodeling at ER strukturer gjennomgå inkluderer kontinuerlig transformasjon mellom planar ark og rør, vesicle formasjon fra eller fusion ER lumen, forlengelse av eksisterende rør, rør retraksjon, fusion og brekkasje3. Merkelig struktur rørformede nettverkene er energisk ugunstige. Stier og mekanismer som ER genererer og opprettholder denne organisasjonen også hvordan dette gjelder dens funksjon ikke er ennå forstått fullt ut4,5.
Det er kjent at ER feil når det mister sin homøostatisk tilstand, som resulterer i ER stress, en tilstand som skyldes en økning i proteinsyntese, akkumulering av misfolded proteiner eller endringer i Ca2 + og oksidativt balanse. ER får stresset igjen deformasjon av naturlige morfologi av organeller, spesielt ved å forstyrre nettverk organisasjon6,7. Som et svar aktiverer cellen en reparasjon mekanisme for å homøostatisk igjen. I reparasjon kan føre til ER-indusert celle apoptose, som bidrar til flere metabolske og degenerative sykdommer som Alzheimers sykdom, type 2 diabetes, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og flere andre7, 8. Nåværende forskning mål organiseringen av rørformede ER nettverk, og flere studier fokuserer på gjenoppbygge ER i vitro2. Noen eksisterende modeller2,9,10 krever proteiner til å starte og vedlikeholde membran kurvatur3,11 og hjelpe organelle nå formen. Åpenbart er modellsystemer som speil noen av Hovedfunksjonene til strukturelle og organisatoriske er og gi tilgang til eksperimentelle studier etterspurt.
Vi presenterer her prosedyrer for utarbeidelse av en lettvinte, protein/kjemisk energi-fri, dynamisk i vitro modell for ER, gir en grunnleggende plattform for å studere ER morfologi og funksjonene4. I denne metoden er en ER modell laget med en nedenfra og opp tilnærming ved hjelp av bare noen elementer, som molekyler rundt kan integreres for å legge til kompleksiteten. Nettverket representerer ER strukturen og dynamikken. Videre reversibel transformasjon mellom planar membranen og rør, vesicle formasjon fra rør, rør fusion, skyve og retraksjon kan alle observeres. I tillegg til servering som opp-modell for fullstendig forstått mobilnettet ER, kan lipid ruten til nanotube nettverk beskrevet i denne protokollen være aktuelle for forskere studere selvstendig montering, nanofluidics, enkelt-molekylet og kolloid transport fenomener, Marangoni flyt, og andre relaterte felt. Bare molekylær byggeblokkene som brukes i vår metode er fosfolipider. Protokollen krever lite laboratoriearbeid og grunnleggende utstyr og er tilgjengelig for inkorporering av flere elementer.
I følgende diskusjonen, er den avgjørende skritt, endres og begrensninger av protokollen beskrevet. Det første viktige steget er riktig montering av observasjon kammeret, gitt at vedheft av PDMS rammen til Al2O3 overflaten er egentlig svak. I tilfelle der rammen ikke overholder underlaget riktig innholdet vil lekke fra observasjon kammeret og eksperimentet kommer til å stoppe. De viktigste faktorene som hindrer riktig tetting av overflaten og rammen er 1) mangel på grundig rengjøring (gjenbrukes) PDMS rammen og 2) luftbobler som noen ganger blir fanget mellom rammen og underlaget. En nylig forberedt eller rengjøres grundig PDMS ramme bør brukes. Bør skylles rammen før og etter hver bruk med isopropanol, fulgt av skylling med DI vann og håndflatene med nitrogen. Al2O3 overflater krever ikke noen tidligere rengjøring, siden de er fabrikkert i et renrom miljø og oppbevares i lukkede beholdere til bruk. På grunn av amphoteric natur Al2O3, bør det ikke utsettes for sterkt syreholdig eller grunnleggende løsninger. Andre design for observasjon kammeret kan ansettes, avhengig av tilgjengelighet av det enkelte oppsettet. Viktige funksjoner på denne kammer er gratis tilgang til flytende prøven fra åpne toppen og inertness ramme materiale med hensyn til brukte løsninger og eksempler. Kammeret dimensjonene er også en viktig faktor, som de bør ta et volum fra 0,5 til 1 mL. Siden flater brukes vanligvis standardstørrelse coverslips (24 x 60 mm), avhengig volumet av kammeret av tykkelsen på rammen. Til vår kunnskap er avstandsstykker med størrelse og fargedybde som rommer eksempel volumene vanligvis håndteres i denne protokollen ikke kommersielt tilgjengelig. Vi har derfor dedikert en inndeling i protokollen til detaljer om fabrikasjon og montering av en prøve chamber ramme.
Det andre avgjørende skrittet i denne protokollen er buffer utveksling. En utfordring i dette trinnet er en nødvendig for å utføre denne utvekslingen. Spredning av MLV ved kontakt med Al2O3 underlaget er umiddelbar og kontinuerlig utvidelse av DLBM fører til sin rupturing, avslutter eksperimentet (figur 2A, B). Derfor spredning bør kontinuerlig overvåket og buffer utveksling må utføres i tide. Utveksling bør ikke utføres for raskt etter initialisering av spredning, slik at membran patcher å nå en optimal størrelse (100-200 µm i diameter). På den annen side, forårsaker kontinuerlig vedheft på overflaten høy membran spenning, som fører til rupturing. Dermed patcher alle membran til slutt brudd hvis spre ikke er avbrutt. Tidspunktet for den rupturing er forskjellig for hver oppdateringen, siden det kommer an på størrelsen og interne strukturen av MLV og tilgjengelighet av lipider deri. Derfor skal øyeblikk av utveksling ordnes til en timepoint som un sprukket flekker med optimal størrelser utgjør størstedelen av hele befolkningen. En annen utfordring i bufferen exchange trinn er frekvensen av fjerning og tillegg av bufferne. Utfører denne erstatningen for fort har en skadelig innflytelse på de endelige membran strukturene (figur 2C-E). Overdreven utvinning av Ca2 +– HEPES bufferen uten å forlate en tynn flytende film på underlaget, resulterer i tørket og irreversibelt deformert membran patcher (figur 2C). Selv om en riktig mengde væske opprettholdes på overflaten, forårsaker brå tillegg bufferen som Chelator-HEPES også forstyrrelsene av membran strukturer. Figur 2 D,E viser typisk utseendet på hydrodynamically forstyrret membran patcher. Samlet morfologiske avbrudd påvirker ikke nødvendigvis de dynamiske egenskapene til de siste strukturene (dvs. rørformet rearrangements i gjenværende områdene vil fortsatt skje). Imidlertid vil det bli vanskelig å observere materiale transformasjon på deformert strukturer. For eksempel i figur 2D, ville det være vanskelig å bestemme retningen mot MLV DLBM trekkes.
En mulig endring av protokollen er den lipid brukes. Hovedfokuset er på fosfolipider som dominerer ER sammensetningen i pattedyr og gjær16 (e. g., phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), og phosphatidylinositol (PI). Opprinnelige forsøkene ble utført med PC og PI blandinger4. I resultatene presentert ble en blanding av PC og dop og et derivat av PE brukt. Men har ikke alle vilkårlig lipid komposisjoner blitt funnet for å lage stålrør strukturer fra denne protokollen. Noen av de andre eksperimentelt undersøkte lipid blandinger involverer totale hjertet ekstrakt, soya bean ekstrakt polar, E. coli ekstrakt polar, blandinger av PC med stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) i varierende forhold og blandinger av PC-PE-PI-Posphatidyl serine (PS) i varierende forhold. Siden rørformede membran strukturer har høy curvatures og krever spesielle arrangement av personlige lipid molekyler, forventes det at observert fenomenet er lipid sammensetning-spesifikke.
En annen endring gjelder i denne protokollen er metoden overflaten fabrikasjon. Her, ble ALD brukt til å fabrikkere Al2O3 belagt coverslips. Dette er forskjellig fra metoden opprinnelig rapporterte deponering, reaktive sputtering4. Mens dette indikerer at en alternativ overflaten fabrikasjon metode kan fortsatt føre til ER som tubulation, synes en viktig begrensning å være spesifisitet av overflate materiale. Modus for å spre og styrke av vedheft er svært avhengig av egenskapene til overflate, som påvirker faktorer som elektrostatisk interaksjoner, wettability, hydrophobicity og råhet av overflaten. Al2O3 flater gir optimal vedheft styrke, og lipid filmer kan både knytte sterkt nok som en dobbel lipid bilayer membran og koble til skjemaet rørformede nettverk ved fjerning av Ca2 + ioner. Vi har tidligere testet samme eksperiment med SiO2, der multilamellar blemmer spredt som en dobbel lipid bilayer membran, men ingen rørformede nettverk formasjon ble observert på tillegg chelater17. De-vedlegg og rør formasjon er observert på Al2O3 eller plasma etset Al18. Våre undersøkelser avslørte at parameteren medvirkende fører til så fenomen zeta potensielle av overflater, som Al og Al2O3 ble nær null (mV) og SiO2 betydelig negativ. Zeta potensialet i borosilicate ligner SiO219; Derfor er vedheft av lipid filmer på borosilicate like sterk og irreversibel. Faktisk fører multilamellar lipid reservoaret kontakt med borosilicate flater vanligvis til umiddelbar brudd og dannelse av enkelt lipid bilayers20. Al2O3 overflater kreves for denne protokollen er ikke lett eller kommersielt tilgjengelig. De kan imidlertid være tilpasset bestilt fra spesialitet glass og underlaget produsenter. Tilgang til renrom fasiliteter med tynn-film fabrikasjon utstyr anbefales.
De andre eksisterende opp metodene å dikte ER som rørformede nettverk2,10 involverer proteiner som inndata av kjemisk energi (f.eks., GTP og ATP). Rapoport og kolleger2 rapportert dannelsen av ER-nettverk på glass coverslips i vitro ved å blande membran-bøying proteiner i ER, og fosfolipider GTP. Arbeidet Bachand et al. 10 viser hvordan slike dynamisk rørformede nettverk kan opprettes ved hjelp av molekylære motorer og ATP som energikilden. Denne protokollen presentert krever ikke membran proteiner eller hydrolyse av organiske forbindelser for energi. Kun nødvendige komponentene er solid underlaget og fosfolipider. Rensing og utvinning av proteiner er ikke nødvendig. Denne protokollen gir, i form av enkelhet av grunnleggende molekyler, den mest grunnleggende ER modellen.
Med denne grunnleggende, lipid-baserte ER modellen etablert, er bygge opp kompleksiteten ved å legge til ER-assosiert komponenter interessant, siden det gjør undersøkelse av individuelle virkninger på systemet. Ligner de faktiske ER nettverkene, rør i modellen er dynamiske. Bøyning til og overføring av merket membran proteiner eller fluorescerende partikler på rørformet nettverket, kan gi informasjon om membran bevegelsesretning. Innkapsling og overvåking av fluorescerende væske inne i DLBM og rør under transformasjon og en mulig kartlegging av intratubular innhold transport kan tjene som et annet fokus. Til slutt, en overgang fra 2D ER modellen som følge av denne protokollen mot en 3D glatt ER modell kan vedtas gjennom innkapsling av nettverk i hydrogel arkitekturer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Prof Aldo Jesorka fra Chalmers University of Technology i Sverige for hans uvurderlig kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom økonomisk støtte fra Forskningsrådet (Forskningsrådet) prosjekt stipend 274433, UiO: biovitenskap konvergens miljø, svenske Research Council (Vetenskapsrådet) prosjekt Grant 2015-04561, i tillegg til oppstart finansiering tilbys av senter for molekylær medisin Norge & fakultet for matematikk og naturfag ved Universitetet i Oslo.
Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
Pressure meter – Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
Heating and drying oven – venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24×60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |