Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Ontwerpen van poreuze Silicon Films als dragers van de zenuw groeifactor

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

Hier presenteren we een protocol te ontwerpen en te fabriceren nanostructured poreuze silicium (PSi) films als afbreekbaar dragers voor de zenuw groeifactor (NGF). Neuronale differentiatie en uitgroei van PC12 cellen en muizen achterwortelganglia ganglion (DRG) neuronen worden gekenmerkt op een behandeling met de NGF-geladen PSi vervoerders.

Abstract

Ondanks het grote potentieel van de NGF voor het behandelen van neurodegeneratieve ziekten, zijn therapeutische administratie vormt een aanzienlijke uitdaging als het eiwit niet van de bloed - hersen barrière overschrijden doet, als gevolg van de chemische eigenschappen, en vereist dus op lange termijn levering naar de hersenen om een biologisch effect te hebben. Dit werk beschrijft fabricage van nanostructured PSi films als afbreekbaar dragers van de NGF voor duurzame levering van deze gevoelige eiwit. De PSi-dragers zijn speciaal afgestemd op de hoge laden werkzaamheid en continu release van NGF verkrijgen voor een periode van vier weken met behoud van de biologische activiteit. Het gedrag van de NGF-PSi-dragers als een NGF uitvoeringssysteem is onderzocht in vitro door onderzoek van hun capaciteit voor het opwekken van neuronale differentiatie en uitgroei van PC12 cellen en gedissocieerde DRG neuronen. Levensvatbaarheid van de cellen in het bijzijn van netjes en NGF-geladen PSi vervoerders wordt geëvalueerd. De topicale van NGF vrijgegeven van de PSi-dragers wordt vergeleken met de conventionele behandeling van repetitieve gratis NGF overheidsdiensten. PC12 celdifferentiatie is geanalyseerd en wordt gekenmerkt door het meten van drie verschillende morfologische parameters van gedifferentieerde cellen; (i) het aantal neurites uitpakken vanaf het soma (ii) de totale neurites lengte en (iii) het aantal vertakkende punten. PC12 cellen behandeld met de NGF-PSi-vervoerders tonen een diepgaande differentiatie gedurende de release. Bovendien Toon DRG neuronale cellen gekweekt met de NGF-PSi-vervoerders een uitgebreide neurite initiatie, vergelijkbaar met neuronen behandeld met repetitieve gratis NGF overheidsdiensten. De bestudeerde afstembare dragers demonstreren de langdurige implantaten voor NGF release met een therapeutisch potentieel voor neurodegeneratieve ziekten.

Introduction

NGF is essentieel voor de ontwikkeling en het onderhoud van neuronen in het perifere zenuwstelsel (PNS)1 en speelt een cruciale rol in het behoud en de functie van basale reukkolf cholinerge neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS)2. Hoge farmacologisch benut voor de behandeling van centrale neurodegeneratieve ziekten, zoals Alzheimer en Parkinson, wijd gebleken, met klinische proeven momenteel in vooruitgang3,4,5, 6. De grootste uitdaging in de levering van de NGF aan de CNS woont in haar onvermogen om over te steken van de bloed-hersenbarrière (BBB), systemisch toegediend7. Bovendien NGF gevoeligheid voor snelle enzymatische afbraak maakt haar korte halfwaardetijd en aanzienlijk beperkt zijn therapeutisch gebruik8,9. Daarom is er een onvervulde uitdaging voor het ontwerp van afgiftesystemen waarmee op een veilige manier voor een langdurige en gecontroleerde vrijlating van de NGF. Verschillende NGF levering systemen, met inbegrip van polymeer gebaseerde systemen geweest bestudeerde10,11,12,13,14,15, 16 , 17. de profielen van de release van deze systemen werden vaak gekenmerkt door een duidelijke eerste uitbarsting, gevolgd door een continue langzaamwerkend, waar in de laatste fase het introductie tarief was aanzienlijk laag in vergelijking met de eerste uitbarsting11 ,18,19. Bovendien inactivering van het eiwit door de zure afbraakproducten van de polymeren (bijvoorbeeld, poly(lactic-co-glycolic) zuur) of verlies van de NGF topicale tijdens de inkapseling werden waargenomen met deze systemen20.

Nanostructured PSi wordt gekenmerkt door een aantal aantrekkelijke eigenschappen, met inbegrip van haar hoge oppervlakte, grote poreuze volume, biocompatibiliteit en afstembare afbreekbaarheid in lichaamsvloeistoffen, het predestining voor een veelbelovende drug delivery platform21, 22,23,24,25,26,27,28. Juiste keuze anodisatie voorwaarden kunt gemakkelijk aanpassen van de PSi structurele eigenschappen (b.v., porositeit en porie-grootte) voor het afstemmen van de drug laden en release kinetiek21,27. Bovendien laat verschillende handige chemische routes het oppervlak van de PSi te wijzigen en door die verder afstemmen de oplossnelheid van de Si-steiger onder fysiologische omstandigheden en de tarieven van de release van de drug22,24, 29,30.

Dit werk richt zich op het ontwerpen van een PSi gebaseerde expresbezorgingssysteem voor langdurige gecontroleerde afgifte van de NGF. Het effect van de NGF-PSi-dragers in neuronale differentiatie en uitgroei is onderzocht met behulp van PC12 cellen en losgekoppeld van de DRG neuronen. We laten zien dat de geladen NGF haar topicale heeft bewaard door inducerende neurite uitgroei en diepgaande differentiatie gedurende een periode van 1 maand release binnen een eenmalige toediening.

Protocol

Alle methoden zijn goedgekeurd door de ethische commissie van Bar Ilan Universiteit.

1. fabricage van geoxideerde PSi (PSiO2) vervoerders

  1. Snijd een Si-wafer (één kant gepolijst op het < 100 > gezicht en zwaar boor-doped, p-schakeling, 0.95 mΩ·cm) in 1,5 cm × 1,5 cm monsters met een diamant-tipped-pen.
  2. De Si-monsters in een oven van de buis bij 400 ° C gedurende 2 uur in de lucht oxideren (verwarming tarief: 25 ° C/min, natuurlijke koeling).
  3. Dompel de Si monsters in een oplossing van waterige waterstoffluoride (HF) (48%), ddH2O en ethanol (99,9%) (1:1:3 v/v/v) voor 5 min; vervolgens spoel de monsters met ethanol driemaal en droog onder een stikstof-stream.
    Opmerking: Bereiden en HF oplossing in plasticware alleen opslaan als HF verteerd organisch materiaal zoals glas.
    Let op: HF is een sterk bijtende vloeistof, en het moet met uiterste zorg worden behandeld. In het geval van blootstelling, Spoel grondig met water en behandeling van het getroffen gebied met HF tegengif gel; zoeken onmiddellijk voor medische zorg.
  4. Monteer het Si monster in een cel van polytetrafluorethyleen etsen, met een strook aluminiumfolie als een rug-contact en een platina spoel als de teller-elektrode.
  5. Etch een offer laag in een 3:1 (v/v) oplossing van waterige HF en ethanol (99,9%) voor 30 s bij een constante stroomdichtheid van 250 mA/cm2; dan spoel het oppervlak van de resulterende PSi film met ethanol driemaal en droog onder een stikstof-stream.
  6. Los de vers-geëtst poreuze laag in een waterige oplossing van de NaOH (0.1 M) gedurende 2 minuten. Spoel na met ethanol driemaal en droog onder een stikstof-stream.
  7. Dompel het monster in een oplossing van waterige HF (48%), ddH2O en ethanol (99,9%) (1:1:3 v/v) voor 2 min. Spoel na met ethanol driemaal en droog onder een stikstof-stream.
  8. Elektrochemisch etch het Si monster in een 3:1 (v/v) oplossing van waterige HF en ethanol (99,9%) voor 20 s bij een constante stroomdichtheid van 250 mA/cm2; dan spoel het oppervlak van de resulterende PSi film met ethanol driemaal en droog onder een stikstof-stream.
  9. Thermisch oxideren de vers-geëtst PSi monsters in een oven van de buis bij 800 ° C gedurende 1 uur in de lucht (verwarming tarief: 25 ° C/min, natuurlijke koeling) vormen een poreuze SiO2 (PSiO2) steiger.
  10. Spin-jas de PSiO2 monsters met een positieve dikke fotoresist bij 4000 t/min voor 1 min; Bak vervolgens de gecoate monsters bij 90 ° C gedurende 2 minuten (verwarming tarief: 5 ° C/min, natuurlijke koeling).
  11. Dobbelstenen de PSiO2 monsters in 8 mm × 8 mm monsters met behulp van een dobbelen zag.
  12. Als u wilt verwijderen de fotoresist, geniet de blokjes monsters in aceton voor 3 h; Spoel grondig met ethanol en droog onder een stikstof-stream.

2. veilig laden PSiO2 met NGF

  1. Ter voorbereiding van de NGF laden oplossing, ontbinden 20 µg lymfkliertest β-NGF in 400 µL van 1:1 (v/v) oplossing van 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en ddH2O.
  2. Voeg 52 µL van het laden oplossing op de top van het PSiO2 monster en incubeer gedurende 2 uur op RT in een afgedekte schaal.
    Opmerking: Handhaven hoge luchtvochtigheid in de schotel om te voorkomen dat het opdrogen van de oplossing tijdens de incubatie.
  3. Het verzamelen van de oplossing op de bovenkant van het monster voor de daaropvolgende kwantificering van NGF inhoud binnen de vervoerder van de2 PSiO.
    Opmerking: NGF laden in PSiO2 moet worden uitgevoerd vóór het beoogde gebruik, het protocol hier niet kan worden onderbroken vanwege het risico van het drogen en denaturatie van het eiwit.

3. kwantificering van NGF laden door de NGF ELISA

  1. Ter voorbereiding van de ELISA-plaat, voeg 100 µL van 0,5 µg/mL vangen antilichaam (konijn anti-hβ-NGF) aan elk goed, afdichting van de plaat en na een nacht bebroeden bij RT.
  2. De putten om vloeistof afzuigen en het wassen van de plaat die vier keer met 300 µL van was buffer gecombineerd (0,05% Tween-20 in PBS) per putje; na de laatste wasbeurt omkeren de plaat om te verwijderen van de resterende buffer en vlek op een papieren handdoek.
  3. Voeg 300 µL van blok buffer (1% bovien serumalbumine (BSA) in PBS) aan elk putje en incubeer gedurende ten minste 1 uur op RT. Vervolgens gecombineerd en wassen van de plaat viermaal zoals beschreven in stap 3.2.
  4. Ter voorbereiding van een ijkcurve, Verdun NGF laden oplossing (zie stap 2.1) in verdunningsmiddel (0,05% Tween-20, 0,1% BSA in PBS) tot 1 ng/mL. Voer 2-fold seriële verdunningen van 1 ng/mL tot nul tot de kalibratie kromme monsters krijgen.
  5. Ter voorbereiding van de monsters, Verdun de NGF laden oplossing (uit stap 2.1) en de verzamelde na laden oplossing (uit stap 2.3) in verdunningsmiddel 1:100,000 en 1:10,000 respectievelijk, om te bereiken van het bereik van de concentraties van de ELISA-kit in gebruik (16-1.000 pg/mL).
  6. Voeg 100 µL van de verdunde monsters en kalibratie kromme monsters aan elk goed in drievoud en Incubeer bij RT gedurende 2 uur; vervolgens gecombineerd en wassen van de plaat viermaal zoals beschreven in stap 3.2.
  7. Voeg 100 µL van 1 µg/mL detectieantilichaam (biotinyleerd konijn anti-hβ-NGF) aan elk putje en Incubeer bij RT gedurende 2 uur. Vervolgens gecombineerd en wassen van de plaat viermaal zoals beschreven in stap 3.2.
  8. Avidin-Horseradish Peroxidase (HRP) 1:2,000 in verdunningsmiddel verdunnen, voeg 100 µL per putje en incubeer gedurende 30 min op RT. Nu gecombineerd en wassen van de plaat viermaal zoals beschreven in stap 3.2.
  9. Voeg 100 µL van substraat oplossing aan elk putje en 25 min. op RT voor kleur ontwikkeling uit te broeden. Meet de extinctie op 405 nm met golflengte correctie ingesteld bij 650 nm microplate lezer gebruikt.
  10. NGF concentratie in zowel het laden oplossing en de verzamelde na laden oplossing op basis van de kalibratiekromme te bepalen.
  11. Als u wilt berekenen NGF massa geladen binnen PSiO2 vervoerder, aftrekken NGF massa in de verzamelde na laden oplossing van de NGF massa in het laden oplossing. NGF laden werkzaamheid wordt berekend door de volgende vergelijking:
    Equation

4. in vitro NGF Release van PSiO2

  1. Incubeer de NGF-geladen PSiO2 dragers in 2 mL zuiver 0,01 M PBS, met 1% (m/v) BSA en natriumazide 0,02% (m/v) bij 37 ° C en onder de orbitale beweging van 100 rpm.
  2. Om de 2 dagen de oplossing te verzamelen en te vervangen door 2 mL verse PBS. Bevriezen van de verzamelde release monsters in vloeibare stikstof en bewaren bij-20 ° C voor verdere analyses.
  3. Gebruik de verkrijgbare analyse van de NGF ELISA te kwantificeren NGF inhoud in de release-monsters zoals beschreven in stappen 3.1-3.9.
    Opmerking: Bij de voorbereiding van de release monsters voor ELISA kwantificering, verschillende verdunningen moeten worden uitgevoerd voor verschillende tijdstippen langs de release periode (dat wil zeggen, eerder tijdstip punten moeten veel meer dan de latere tijdstippen worden verdund). Bovendien, voor elk monster release, ten minste twee verschillende verdunningen moeten worden uitgevoerd en gekwantificeerd om ervoor te zorgen dat het bereiken van het bereik van de concentraties van de ELISA-kit.
  4. NGF concentratie in de monsters van de release op basis van de kalibratiekromme bepalen en uitzetten van een grafiek van accumulatieve NGF release na verloop van tijd.

5. kwantificering van in vitro Si erosie door inductief gekoppeld Plasma atomaire emissie spectroscopie (ICP-AES)

  1. Verdun 1 mL voor release monsters 1:10 in release buffer, 0,01 M PBS (met 1% (m/v) BSA en 0,02% (m/v) natriumazide) voor een totaal volume van 10 mL.
  2. Si atomaire emissie pieken bij 212.4, 251.6 en 288.2 nm voor de verdunde monsters te controleren.
  3. Bepaal Si concentratie in de monsters op basis van een kalibratiekromme.
  4. Om vast te stellen het Si afbraak profiel, Si inhoud op elk tijdstip wordt uitgedrukt als een percentage van de totale inhoud van de Si van de vervoerders (dat wil zeggen, de cumulatieve Si inhoud langs de release periode).
    Opmerking: Om ervoor te zorgen nauwkeurige kwantificering van het totaalgehalte van Si van de vervoerders, release monsters zijn bemonsterde 1 maand volgende op het eindpunt van de release bestuderen en geanalyseerd voor Si concentratie met behulp van ICP-AES. Optelling van de cumulatieve Si inhoud langs de release periode en de Si-inhoud in de monsters na de introductie biedt de 100% van de inhoud van de Si.

6. cel levensvatbaarheid en de groei in het bijzijn van de NGF-geladen Psio2 dragers

  1. De cultuur van de cel van Rat Feochromocytoom (PC12)
    1. Het fundamentele groeimedium voorbereiden door 10% paard serum (HS), 5% foetale runderserum (FBS), 1% L-glutamine, penicilline streptomycine van 1% en 0,2% amfotericine naar Roselle Park medisch Instituut (RPMI) medium toe te voegen.
    2. Bereiden van differentiatie medium door toevoeging van 1% HS, 1% L-glutamine, penicilline 1% streptomycine en 0,2% amfotericine op RPMI gemiddeld.
    3. Groeien celsuspensie (106 cellen) in een maatkolf van 75 cm-2 -cultuur met 10 mL van fundamentele groeimedium voor 8 dagen; om de 2 dagen Voeg 10 mL van fundamentele groeimedium in de kolf.
    4. Voor het genereren van gedifferentieerde PC12 celcultuur, overbrengen in de celsuspensie een centrifugebuis; Centrifugeer cellen gedurende 8 minuten op 200 x g en RT. Discard het supernatant.
    5. Opschorten van de cellen in 5 mL verse basic groeimedium samen en centrifugeer opnieuw de cellen gedurende 5 min. op 200 x g en RT; Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 3 mL basis groeimedium.
    6. Als u wilt scheiden cel clusters, gecombineerd de cellen tienmaal met behulp van een injectiespuit 23 G.
    7. Met behulp van een hemocytometer cel counter cellen tellen en zaad 104 cellen/cm2 -werkgebied op collageen type l gecoate platen in aanwezigheid van differentiatie medium.
    8. Na 24u, voeg verse lymfkliertest β-NGF (50 ng/mL) "of" NGF-geladen PSiO2 vervoerder per plaat.
      Opmerking: Hogere NGF concentraties (> 50 ng/mL) het precieze effect als de opgegeven concentratie bezitten.
    9. Vernieuwen het differentiatie-medium om de 2 dagen.
    10. Beoordelen van de levensvatbaarheid van de cellen, toevoegen van 10% (v/v) van de levensvatbaarheid indicatoroplossing (resazurin-gebaseerd) op representatieve tijdstippen en incubeer gedurende 5 uur bij 37 ° C; meet de extinctie op 490 nm met behulp van een spectrofotometer.
  2. Cultuur van de cel van de muizen Dorsal Root Ganglia (DRG)
    1. Om te isoleren DRG van twee 7-week-oude C57bl muizen, eerst doven van de muizen met 70% ethanol en maak een incisie in de huid te verwijderen.
    2. Snijd de onderkant van de schedel en de spieren van de buikwand tot het ruggenmerg wordt blootgesteld.
    3. Verwijder van de wervelkolom door een verlaging van de op het niveau van het dijbeen en reinig de omliggende weefsels.
    4. Snijd van de kolom in drie stukken; Knip elk stuk in de schouderstreek te genereren van twee helften en schil uit het ruggenmerg.
    5. Onder de binoculair, pak alle DRG ganglia en dompel ze in een koude Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS).
    6. Schoonmaken van het omliggende bindweefsel door heimwee de DRG op een petrischaal en zachtjes Verwijder Residuele hersenvliezen onder de binoculair.
    7. De DRG cellen door ze aan het broeden voor 20 min in 1.000 U van papaïne distantiëren.
    8. De cellen gedurende 4 minuten bij 400 x gcentrifugeren. Verwijder het supernatant en houden van de cel-pellet.
    9. Resuspendeer de pellet in een 10 mg/mL collagenase en 12 mg/mL dispase-II-oplossing en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C.
    10. Centrifugeer de cellen gedurende 2 minuten bij 400 x g; Verwijder het supernatant en houden van de cel-pellet.
    11. Triturate de cel pellet in 1 mL HBSS, 10 mM glucose en 5 mM HEPES (pH 7,35) door herhaalde passage door een vernauwde Pipet van Pasteur.
    12. Zachtjes de gedissocieerde cellen toevoegen op L-15 gemiddeld 20% van silica gebaseerde colloïdale medium voor cel scheiding bevattende dichtheid kleurovergang centrifugeren; Centrifugeer gedurende 8 minuten op 1000 x g. De bovendrijvende substantie gecombineerd en houd de cel-pellet.
      Opmerking: Het doel van deze stap is te scheiden en zuiveren van de neuronale cellen van axonale puin, de cellen van Schwann en de fibroblasten.
    13. Resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver F-12 drager wordt vastgelegd; Centrifugeer gedurende 2 min op 1000 x g; Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL van F-12 medium.
    14. Tellen van de cellen en zaad 2 × 104 cellen op poly-L-lysine en laminin gecoat glas onder 35 mm cultuur gerechten, in een F-12 antibioticum-gratis medium aangevuld met 10% FBS.
      Opmerking: In eerste instantie zaad de cellen in een klein volume van medium (150-200 µL); Voeg na 2 uur incubatie bij 37 ° C, medium voor een uiteindelijke volume van 2 mL.
    15. Zachtjes toevoegen de NGF-geladen PSiO2 vervoerder of verse lymfkliertest β-NGF (50 ng/mL) per plaat.
    16. Na 2 dagen, de cultuur van de cel te bevestigen door het aan het broeden met een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing voor 15 min op RT; immunokleuring de celcultuur met behulp van een gemeenschappelijk immunofluorescentie kleuring procedure31.
    17. Het beeld van de celcultuur van de neuronale met behulp van een confocal microscoop.

7. cel differentiatie analyse

  1. PC12 cellen differentiatie percentage in aanwezigheid van de NGF-geladen PSiO2 dragers
    1. Incubeer de NGF-geladen PSiO2 dragers in 2 mL voor differentiatie medium, in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
    2. Elke 2 dagen, de oplossing te verzamelen en te vervangen door 2 mL verse voedingsbodem. Bevriezen van de verzamelde release monsters in vloeibare stikstof en bewaren bij-20 ° C voor verdere analyses.
    3. Zaad PC12 cellen in 12-well collageen beklede platen als geïnstrueerd in sectie 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. Na 24u, voeren de release monsters representatief tijdstippen (van punt 5.1.2) naar de verschillende putten; toevoegen voor controleputjes, verse lymfkliertest β-NGF (50 ng/mL).
    5. Na 24 h, het imago van de cellen met behulp van een lichte Microscoop.
    6. Om te bepalen van het percentage neurite-bevattende cellen, cellen die neurites uit het totale aantal cellen in de beelden was ontgroeid handmatig tellen (n = 5 frames voor elk putje); het uitzetten van een grafiek van het percentage PC12 cellen met neurite uitgroei na verloop van tijd.
      Opmerking: PC12 van de ongedifferentieerde cellen leek te hebben afgeronde structuur zonder neurites, terwijl de gedifferentieerde cellen kunnen worden geïdentificeerd door uitgroei van neurites (ten minste één van de minimale lengte gelijk is aan de diameter van de cel soma) of morfologische veranderingen.
  2. Morfometrische analyse van gedifferentieerde cellen van de PC12
    1. Voor verwerking van de beeldanalyse, aanschaffen fase beelden van gekweekte cellen omhoog tot 3 dagen na behandeling met NGF (als gratis reagens of als het product van de release van de NGF-geladen PSiO2 dragers).
      Opmerking: Op latere tijdstippen (buiten dag 5) ontwikkeling van de cellen zeer complexe netwerken, voorkomen van de Morfometrische metingen op de resolutie van een enkele cel.
    2. Download het beeld processing programma NeuronJ, een ImageJ plug-in, waardoor een semi-automatische neurite tracering en het meten van de lengte.
    3. Het image-bestand omzetten in een 8-bits indeling en maatregel pixel micrometer verhouding met behulp van de afbeelding schaal bar.
    4. Stel de schaal met behulp van de analyseren | De opdracht van de Schaal instellen en maatregel de lengte van elke neurite.
    5. Handmatig tellen het aantal vertakkende punten en het aantal neurites die afkomstig zijn uit elke cel soma.
      Opmerking: De lengte van een gemiddelde neurite 1 dag na de NGF behandeling is ongeveer 30 µm. De gemeten neurite lengtes kunnen worden verspreid.

Representative Results

Geoxideerde PSi films zijn vervaardigd, zoals beschreven in het protocol. De Si-wafer is onderworpen aan elektrochemisch etsen voor 20 s bij 250 mA/cm2 (figuur 1ai), gevolgd door thermische oxidatie bij 800 ° C (figuur 1aii) voor de productie van een steiger van de2 PSiO. Hoge resolutie scanning elektronen microscopie (HR-SEM) beelden van de resulterende PSiO2 film worden getoond in Figuur 1bc. Bovenaanzicht opname van de film (Figuur 1b) beeldt de zeer poreuze aard met poriën van ongeveer 40 nm in diameter. Transversale opname van een gekloofd film (Figuur 1 c) blijkt een poreuze laagdikte van 2.9 µm, gekenmerkt door een tussendeur cilindrische poriën.

De PSiO2 films worden geladen met de NGF laden oplossing zoals geïllustreerd in Figuur 1aiii. NGF laden is gekwantificeerd aan de hand van de NGF ELISA door het meten van de NGF-concentraties in de laden oplossing vóór en na incubatie met de PSiO2 films. De gemiddelde massa van de geladen NGF per PSiO2 film wordt bepaald als 2,8 ± 0,2 µg, hetgeen overeenkomt met een hoge laden werkzaamheid van 90% (m/m) (gegevens niet weergegeven31). Teneinde het NGF release-Profiel van de PSiO-2 -dragers, de geladen films in PBS worden geïncubeerd bij 37 ° C en elke 2 dagen aliquots worden bemonsterd voor kwantificering van de vrijgegeven eiwitconcentratie met behulp van ELISA van de NGF. Bovendien, de Si-inhoud in de release-monsters is gekwantificeerd aan de hand van ICP-AES en de Si erosie kinetiek van de PSiO-2 -dragers is gevestigd. Figuur 2 toont de NGF-release en de bijbehorende Si afbraak profielen van de poreuze vervoerders. Een aanhoudende release van de NGF, burst tenietdoen, wordt bereikt voor een periode van 1 maand. NGF release in de eerste week is sneller (helling = 0.442) vergeleken met een trager release in latere dagen langs de release periode (helling 0,043). Opgemerkt moet worden dat gedurende de gehele 1-maand release periode, het bedrag van de NGF vrijgegeven volstaat voor inducerende diepgaande differentiatie van PC12 cellen, zoals later zullen worden besproken. De accumulerende NGF vrijgegeven blijkt te zijn in een goede correlatie (R2 = 0.971) met de resterende Si inhoud, zoals wordt weergegeven in de inzet van Figuur 2.

Vervolgens de topicale van de NGF-geladen PSiO2 dragers is gekenmerkt in vitro, PC12 cellen en DRG neuronen worden gebruikt als modellen voor Neuronale Differentiatie en uitgroei. PC12 cellen en gedissocieerde DRG neuronen worden overgeënt zoals beschreven in het protocol. Ten eerste, de levensvatbaarheid van de cellen in aanwezigheid van de PSiO-2 -dragers wordt onderzocht door het broeden van de cellen met nette (niet geladen) of de NGF-geladen PSiO2; controle platen en behandeld met nette PSiO2 cellen worden aangevuld met gratis NGF om de 2 dagen. Geen cytotoxiciteit wordt waargenomen bij blootstelling van de cellen aan de nette of NGF-geladen PSiO2 dragers (Figuur 3a), aan te tonen dat PSiO2 biocompatibel met deze cellijn is. Figuur 3b toont representatieve HR-SEM microfoto van PC12 cellen behandeld met de NGF-geladen PSiO2 vervoerders. De waargenomen cellen uittreksel neurites en formulier kenmerk vertakt neuronale netwerken. Vergelijkbare resultaten worden verkregen wanneer zaaien losgekoppeld neuronale cellen van de DRG in het bijzijn van de NGF-geladen PSiO2 dragers. Confocale beelden van immunostained DRG cellen gekweekte met de NGF-geladen PSiO2 vervoerders (figuur 3e) tonen een uitgebreide neurite initiatie en rek, vergelijkbaar met de positieve controle (dat wil zeggen, neuronen aangevuld met gratis NGF, Zie afbeelding 3d), terwijl de negatieve controle (dat wil zeggen, onbehandelde neuronen, Zie Figuur 3 c), vertoont een arme deel van neurite uitgroei.

Om te beoordelen PC12 cellen differentiatie percentage in aanwezigheid van de NGF vrijgelaten uit de PSiO-2 -dragers, wordt differentiatie gekwantificeerd door het tellen van de cellen met neurite uitgroei uit de cel Totaal bevolking. Figuur 4 geeft een overzicht van de resultaten in termen van het percentage van gedifferentieerde cellen op verschillende tijdstippen tijdens een periode van 26 dagen. Aanzienlijke differentiatie percentagewaarden worden bereikt gedurende de looptijd van de bestudeerde. Met name na 26 dagen, heeft de vrijgegeven NGF geïnduceerde differentiatie van boven de 50%, een percentage van de differentiatie die is aanzienlijk hoger in vergelijking met eerdere studies met polymeer gebaseerde vervoerders16. Deze resultaten wijzen erop dat de NGF entrapment binnen de poreuze host de biologische activiteit van het eiwit voor inducerende diepgaande differentiatie voor een periode van ~ 1 maand bewaard.

Verder onderzoek naar het effect van de NGF-PSiO2 dragers op neuronale differentiatie, drie karakteristieke morfologische parameters van de gedifferentieerde cellen van de PC12 worden gemeten op het niveau van eencellige: (i) het aantal neurites wilt uitpakken vanaf de soma ( II) de totale neurites lengte en (iii) het aantal vertakkende punten. De cellen worden behandeld met NGF-geladen PSiO2 dragers of met herhaalde toediening van gratis NGF (om de 2 dagen), als een besturingselement. Figuur 5a -c presenteert de Morfometrische analyse van de celpopulatie dagen 1 en 3. De cellen van de PC12 behandeld met de NGF-geladen PSiO2 weergegeven Morfometrische-waarden die overeenkomen met de behandeling van de controle voor alle drie geteste parameters. Na 3 dagen, worden de waarden van alle morfologische parameters toe aan het zelfde tarief voor zowel de NGF-geladen PSiO2 dragers en de behandeling van de controle van herhaalde toediening van gratis NGF waargenomen.

Figure 1
Figuur 1: Fabricage van PSiO2 films. (a) fabricage regeling van de vervoerders van de2 PSiO: (i) silicium wafer is onderworpen aan elektrochemisch etsen voor 20 s bij 250 mA/cm2, gevolgd door de thermische oxidatie (ii) bij 800 ° C tot het produceren van een steiger van de2 PSiO, en (iii) de NGF laden door Fysische adsorptie (schema's worden niet getekend op schaal). (b-c) Bovenaanzicht en dwarsdoorsnede electron microfoto van een karakteristiek PSiO2 film. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: NGF release en Si erosie profielen van NGF-geladen PSiO2 dragers. De mate van aantasting van de PSiO-2 -dragers wordt gepresenteerd als het deel van de resterende Si inhoud op elk punt van de tijd uit het totaalgehalte van Si van de poreuze film. De inzet wordt van de correlatie tussen de accumulatieve NGF vrijgegeven en resterende Si inhoud. Error bars vertegenwoordigen SD, n = 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Levensvatbaarheid van de cellen en de groei in het bijzijn van de NGF-geladen PSiO2 dragers. (a) In vitro de karakterisering van de cytotoxiciteit. De levensvatbaarheid van de cellen PC12 wordt gemeten op 1, 3 en 7 dagen na hun blootstelling aan nette (niet geladen) PSiO2 dragers, NGF-geladen PSiO2 dragers of gratis NGF (50 ng/mL elke 2 dagen, controle platen). (b) Electron microfoto van PC12 cellen gekweekte met NGF-geladen PSiO2 dragers voor 9 dagen. Linker paneel: een zoom-in, beeltenis neurite uitvloeisel van de cel soma; rechter paneel: een zoom-out, met vermelding van de zeer complexe neuronale netwerk gevormd. (c-e) Confocale microscopie beelden van immunostained DRG neuronale cel cultuur (2 dagen na het zaaien): (c) onbehandeld cellen; (d) cellen aangevuld met gratis NGF (50 ng/mL); (e) NGF-PSiO2 dragers. Immunefluorescentie kleuring van neurofilament H kunt beeldvorming van het soma cel en de outgrowing neurites. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: PC12 cellen differentiatie percentagewaarden bij blootstelling aan NGF vrijgegeven van NGF-geladen PSiO2 dragers op representatieve tijdstippen. Differentiatie percentage wordt uitgedrukt als het aantal cellen met neurite uitgroei uit de cel Totaal bevolking. Controle behandeling verwijst naar cellen aangevuld met gratis NGF (50 ng/mL). De lichte microscopie van representatieve beelden van de cellen in de verschillende tijdstippen zijn afgebeeld langs de x-as; schaal bar = 25 µm voor microfoto van dag 2, 8, 14, 26 en 50 µm voor opname van de controle. Error bars vertegenwoordigen SD, n = 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Morfometrische analyse van gedifferentieerde cellen PC12. Drie morfologische parameters van gedifferentieerde cellen van de PC12 zijn gemeten, op het niveau van eencellige, op dag 1 en 3 na blootstelling aan de NGF-geladen PSiO2 dragers of herhaalde toediening van gratis NGF elke 2 dagen (controle); (een) neurites totale lengte (b) aantal neurites wilt uitpakken vanaf de cel soma en (c) aantal vertakkende punten. Error bars vertegenwoordigen SD, n = 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Afbreekbaar nanostructured PSiO2 films zijn vervaardigd en werkzaam als dragers voor NGF, waardoor voor de continue en langdurige release, met behoud van de biologische activiteit. Het potentieel van de PSiO2 om te dienen als een expresbezorgingssysteem voor NGF is aangetoond in vitro door aan te tonen hun vermogen om voldoende NGF dosering voor induceren van neuronale differentiatie en het bevorderen van de uitgroei van PC12 cellen en neuronen van de DRG vrij te geven. De gemanipuleerde films kunnen worden gebruikt als op lange termijn reservoirs van NGF voor toekomstige behandeling in vivo.

De structurele eigenschappen van de gefabriceerde PSi films werden op maat gemaakt speciaal voor NGF lading; de stroomdichtheid van het elektrochemisch etsen-proces werd aangepast om op te halen van de poriegrootte van ongeveer 40 nm dat zou gemakkelijk de NGF, een eiwit met een molecular weight van 26,5 kDa32 en een karakteristiek diameter van ~ 4 nm33, binnen de poreuze matrix. Bovendien, thermische oxidatie van de poreuze steiger werd uitgevoerd zodat de fysische adsorptie van NGF door elektrostatische aantrekking van de positief geladen eiwitten aan de negatief geladen geoxideerd oppervlak van de PSi. De Oppervlaktechemie van PSi oefent een grote invloed op de werkzaamheid van het laden en gemakkelijk kan worden afgestemd om betere controle van de interacties tussen de lading en de poreuze matrix. Deze interacties bepalen vervolgens de structuur van de geadsorbeerde eiwitmolecules en hun topicale34,35,,36. Kortom, werd het systeem aangepast om optimaal laden van NGF verkrijgen door zorgvuldig te selecteren van de juiste poriegrootte, oppervlakte kenmerken en de ideale laden oplosmiddel en het resulterende effect van het dictaat van de genoemde parameters het eiwit laden werkzaamheid. Daarom wijzigingen in de parameters van de fabricage (b.v., stroomdichtheid, ETS tijd, aard en concentratie van dopering of elektrolyt), oppervlakte chemie of laden oplossing samenstelling kan invloed hebben op de werkzaamheid van de laden en topicale van de geladen eiwitten.

Het tarief van de introductie van een lading van de PSi-orPSiO2-host wordt over het algemeen bepaald door een combinatie van twee gelijktijdige mechanismen, proefliggen diffusie van de nettolading moleculen en de aantasting van de Si steiger37. De erosie en de daaropvolgende oplossnelheid worden beïnvloed door de innesteling site, de pathologie en ziekte staat28,38,39. Het werd opgericht in vorige werk dat als een verschillende versie tarief vereist voor een bepaalde therapeutische toepassing is, het release-profiel kan worden gewijzigd en verlengd door het veranderen van de Oppervlaktechemie van de PSi oppervlakte38,40, 41. Verschillende chemische wijzigingen, zoals thermische oxidatie, thermische verkoling en hydrosilylation technieken, is aangetoond dat het oppervlak van de PSi te stabiliseren en invloed hebben op de afbraak en de daarop volgende lading release35,42 ,43,44,45. Bovendien, laden van NGF in de dragers door covalente gehechtheid van de eiwitmolecules aan de steiger van de Si via verschillende Oppervlaktechemie routes moet leiden tot een langduriger release omdat de nettolading slechts vrijgegeven wordt wanneer de covalente bindingen verbroken worden of de ondersteuning van Si matrix is gedegradeerd21.

Bovendien, naar aanleiding van haar productie-procédé, PSi kan worden gerenderd in verschillende configuraties naast dunne lagen, zoals microdeeltjes46, nanodeeltjes47 of vrijstaande membranen26, die ook kan worden gebruikt als dragers voor de NGF en behoeften voldoen aan specifieke toepassing.

Om klinisch relevante, moet de inhoud van de NGF binnen de PSiO-2 -dragers het scala aan therapeutische doses bereiken. Van de methode beschreven in het protocol, de NGF-geladen PSiO2 dragers worden ingevoerd in een consistent volume van 2 mL van cel media of PBS buffer en dus de concentratie van de oplossing van de laden en de respectieve NGF massa geladen werden aangepast zodanig dat deze een NGF-concentratie die relevant is voor het systeem getest in vitro uitgebracht. Bij gebruik van deze methode voor verschillende systemen, zoals omgevingen ex vivo of in vivo , moet de concentratie van de NGF laden oplossing worden verhoogd en aangepast volgens de benodigde dosis. Hoger gehalte van de NGF kan ook worden verkregen door de invoering van meerdere vervoerders per geteste gebied of met behulp van grotere gebieden van PSiO2 monsters.

Bovendien moet opgemerkt worden dat in latere tijd punten langs de release periode, de vrijgegeven NGF-concentraties veel lager dan in eerdere tijd punten zijn. Bij het ontwerpen van het systeem volgens de behoeften van de toepassing, moet rekening worden gehouden met het feit dat de NGF-flux niet constant in de tijd is.

Talrijke NGF levering systemen zijn ontwikkeld en gemeld in de literatuur, de meeste van hen zijn polymeer gebaseerde systemen, bestaande uit natuurlijke of synthetische polymeren conjugaten10,11,12,15 , 16 , 17. deze systemen is effectief gebleken aanhoudende release profielen, echter de release periode spanned over een periode van enkele dagen met een aanzienlijke burst-effect. Sommige van deze platforms levering lijden aan kritische beperkingen zoals verlies van topicale op het proces van inkapselen, waarvoor gebruik van verschillende stabiliserende agenten18,48, evenals geavanceerde en complexe fabrication technieken16. Een van de grootste uitdagingen bij het ontwerpen van toedieningssystemen voor eiwitten is de mogelijkheid om de topicale van de moleculen op entrapment binnen de carrier systeem behouden. In PSi/PSiO2 op RT of zelfs bij lagere temperaturen kunnen eiwitten of peptides worden geladen zonder gebruik te maken van sterke organische oplosmiddelen, die beide belangrijke factoren bij het laden van deze gevoelige biomoleculen. Eerdere studies hebben aangetoond dat PSi/PSiO2 Oppervlaktechemie een cruciale rol speelt bij het minimaliseren van mogelijke denaturatie van de geladen eiwitten35,36. Daarom is PSi/PSiO2 een voordelige nanomateriaal voor de ontwikkeling van toedieningssystemen voor factoren die de groei in het algemeen en NGF in het bijzonder.

Het huidige werk is gericht op gebruik te maken van deze methode als een nieuwe therapeutische benadering voor het directe beheer van NGF in de CNS voor mogelijke behandeling van neurodegeneratieve ziekten. De NGF-geladen PSiO2 vervoerders kunnen worden geïmplanteerd in de hersenen van muizen en de werkzaamheid van het platform als op lange termijn implantaten is studeerde in vivo. Bovendien, het combineren van deze veelbelovende vervoerders met niet-invasieve biolistics49,50 kunnen één voor het beheer van de NGF-geladen PSiO2 deeltjes in een zeer ruimtelijke resolutie naar een gelokaliseerde gebied met behulp van een pneumatische roman capillaire pistool voor de behandeling van neurodegeneratieve aandoeningen, waar een Spatio drug administration is vereist. Bovendien kan NGF neuronale groei direct in een chemische kleurovergang wijze51, vergelijkbaar met axon begeleiding moleculen. Dus, de geladen PSiO2 dragers kunnen dienen als lokstof hotspots aan NGF, om groei, complementair aan andere leiding signalen52,53. Bovendien, kunnen de PSiO2vervoerders worden specifiek aangepast ondersteunen de levering van de NGF gedurende een tijd veel-uitgebreid tot enkele maanden door verdere tuning de nanostructuur van de2 PSiO en haar oppervlakte chemie.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

MS en ES erkennen de kernservices en steun van het Lorry I. Lokey centrum voor leven wetenschap en techniek en de financiële steun van de Russell Berrie nanotechnologie Instituut van het Technion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiesmann, C., De Vos, A. Nerve growth factor: structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, (5), 748-759 (2001).
  2. Dreyfus, C. F. Effects of nerve growth factor on cholinergic brain neurons. Trends in Pharmacological Sciences. 10, (4), 145-149 (1989).
  3. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 9, (5), 246-257 (1998).
  4. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Encapsulated cell biodelivery of nerve growth factor to the basal forebrain in patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 33, (1), 18-28 (2012).
  5. Eyjolfsdottir, H., et al. Targeted delivery of nerve growth factor to the cholinergic basal forebrain of Alzheimer's disease patients: application of a second-generation encapsulated cell biodelivery device. Alzheimer's Research & Therapy. 8, (1), 30 (2016).
  6. Tuszynski, M. H., et al. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Nature Medicine. 11, (5), 551-555 (2005).
  7. Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain barrier to neurotrophins. Brain Research. 788, (1), 87-94 (1998).
  8. Thorne, R. G., Frey, W. H. Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system. Clinical Pharmacokinetics. 40, (12), 907-946 (2001).
  9. Tria, M. A., Fusco, M., Vantini, G., Mariot, R. Pharmacokinetics of nerve growth factor (NGF) following different routes of administration to adult rats. Experimental Neurology. 127, (2), 178-183 (1994).
  10. Bhang, S. H., et al. The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture. Biomaterials. 30, (1), 126-132 (2009).
  11. Camarata, P. J., Suryanarayanan, R., Turner, D. A., Parker, R. G., Ebner, T. J. Sustained release of nerve growth factor from biodegradable polymer microspheres. Neurosurgery. 30, (3), 313-319 (1992).
  12. Cooper, A., Bhattarai, N., Zhang, M. Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve tissue regeneration. Carbohydrate Polymers. 85, (1), 149-156 (2011).
  13. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 37 (2016).
  14. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7, (3), 1058-1066 (2015).
  15. Sridhar, R., et al. Electrosprayed nanoparticles and electrospun nanofibers based on natural materials: applications in tissue regeneration, drug delivery and pharmaceuticals. Chemical Society Reviews. 44, (3), 790-814 (2015).
  16. Valmikinathan, C. M., Defroda, S., Yu, X. Polycaprolactone and bovine serum albumin based nanofibers for controlled release of nerve growth factor. Biomacromolecules. 10, (5), 1084-1089 (2009).
  17. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, (17), 3765-3772 (2002).
  18. Cao, X., Shoichet, M. S. Delivering neuroactive molecules from biodegradable microspheres for application in central nervous system disorders. Biomaterials. 20, (4), 329-339 (1999).
  19. Saltzman, W. M., Mak, M. W., Mahoney, M. J., Duenas, E. T., Cleland, J. L. Intracranial Delivery of Recombinant Nerve Growth Factor: Release Kinetics and Protein Distribution for Three Delivery Systems. Pharmaceutical Research. 16, (2), 232-240 (1999).
  20. Zhu, G., Mallery, S. R., Schwendeman, S. P. Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly (lactide- co-glycolide). Nature Biotechnology. 18, 52 (2000).
  21. Anglin, E. J., Cheng, L., Freeman, W. R., Sailor, M. J. Porous silicon in drug delivery devices and materials. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (11), 1266-1277 (2008).
  22. Canham, L. T., et al. Derivatized mesoporous silicon with dramatically improved stability in simulated human blood plasma. Advanced Materials. 11, (18), 1505-1507 (1999).
  23. Chen, F., et al. Organosilica Nanoparticles with an Intrinsic Secondary Amine: An Efficient and Reusable Adsorbent for Dyes. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (18), 15566-15576 (2017).
  24. Godin, B., et al. Tailoring the degradation kinetics of mesoporous silicon structures through PEGylation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 94A. 4, (4), 1236-1243 (2010).
  25. Kempen, P. J., et al. Theranostic Mesoporous Silica Nanoparticles Biodegrade after Pro-Survival Drug Delivery and Ultrasound/Magnetic Resonance Imaging of Stem Cells. Theranostics. 5, (6), 631-642 (2015).
  26. Low, S. P., Voelcker, N. H., Canham, L. T., Williams, K. A. The biocompatibility of porous silicon in tissues of the eye. Biomaterials. 30, (15), 2873-2880 (2009).
  27. Salonen, J., Kaukonen, A. M., Hirvonen, J., Lehto, V. -P. Mesoporous silicon in drug delivery applications. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, (2), 632-653 (2008).
  28. Tzur-Balter, A., Shatsberg, Z., Beckerman, M., Segal, E., Artzi, N. Mechanism of erosion of nanostructured porous silicon drug carriers in neoplastic tissues. Nature Communications. 6, (2015).
  29. Salonen, J., Lehto, V. -P. Fabrication and chemical surface modification of mesoporous silicon for biomedical applications. Chemical Engineering Journal. 137, (1), 162-172 (2008).
  30. Tzur-Balter, A., Massad-Ivanir, N., Segal, E. Surface Engineered Porous Silicon-based Nanostructures for Cancer Therapy. MRS Proceedings. 1416, (2012).
  31. Zilony, N., et al. Prolonged controlled delivery of nerve growth factor using porous silicon nanostructures. Journal of Controlled Release. 257, 51-59 (2017).
  32. Young, M., Saide, J. D., Murphy, R. A., Arnason, B. G. Molecular size of nerve growth factor in dilute solution. Journal of Biological Chemistry. 251, (2), 459-464 (1976).
  33. Erickson, H. P. Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by. Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 11, (1), 32 (2009).
  34. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Thermal oxidation for controlling protein interactions with porous silicon. Langmuir. 26, (17), 14316-14322 (2010).
  35. McInnes, S. J., et al. Surface engineering of porous silicon to optimise therapeutic antibody loading and release. Journal of Materials Chemistry B. 3, (20), 4123-4133 (2015).
  36. Prestidge, C. A., et al. Loading and release of a model protein from porous silicon powders. Physica Status Solidi (A. 204, (10), 3361-3366 (2007).
  37. Tzur-Balter, A., Young, J. M., Bonanno-Young, L. M., Segal, E. Mathematical modeling of drug release from nanostructured porous Si: combining carrier erosion and hindered drug diffusion for predicting release kinetics. Acta Biomaterialia. 9, (9), 8346-8353 (2013).
  38. Nieto, A., et al. Surface Engineering of Porous Silicon Microparticles for Intravitreal Sustained Delivery of Rapamycin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (2), 1070-1080 (2015).
  39. Warther, D., et al. Porous silicon based intravitreal platform for dual-drug loading and controlled release towards synergistic therapy. Drug Delivery. 25, (1), 1537-1545 (2018).
  40. Li, W., et al. Tailoring Porous Silicon for Biomedical Applications: From Drug Delivery to Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 30, (24), 1703740 (2018).
  41. Yazdi, I. K., et al. Physicochemical properties affect the synthesis, controlled delivery, degradation and pharmacokinetics of inorganic nanoporous materials. Nanomedicine. 10, (19), 3057-3075 (2015).
  42. Fry, N. L., Boss, G. R., Sailor, M. J. Oxidation-Induced Trapping of Drugs in Porous Silicon Microparticles. Chemistry of Materials. 26, (8), 2758-2764 (2014).
  43. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Surface chemistry of porous silicon and implications for drug encapsulation and delivery applications. Advances in Colloid and Interface Science. 175, 25-38 (2012).
  44. Salonen, J., Mäkilä, E. Thermally Carbonized Porous Silicon and Its Recent Applications. Advanced Materials. 30, (24), (2018).
  45. Wang, M., et al. Influence of Surface Chemistry on the Release of an Antibacterial Drug from Nanostructured Porous Silicon. Langmuir. 31, (22), 6179-6185 (2015).
  46. Salonen, J., et al. Mesoporous silicon microparticles for oral drug delivery: loading and release of five model drugs. Journal of Controlled Release. 108, (2), 362-374 (2005).
  47. Park, J. -H., et al. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nature Materials. 8, (4), 331-336 (2009).
  48. Johnson, P. J., Skornia, S. L., Stabenfeldt, S. E., Willits, R. K. Maintaining bioactivity of NGF for controlled release from PLGA using PEG. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 86, (2), 420-427 (2008).
  49. Shefi, O., et al. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, (23), 6119-6123 (2006).
  50. Zilony, N., Tzur-Balter, A., Segal, E., Shefi, O. Bombarding Cancer: Biolistic Delivery of therapeutics using Porous Si Carriers. Scientific Reports. 3, 2499 (2013).
  51. Zuidema, J. M., Provenza, C., Caliendo, T., Dutz, S., Gilbert, R. J. Magnetic NGF-Releasing PLLA/Iron Oxide Nanoparticles Direct Extending Neurites and Preferentially Guide Neurites along Aligned Electrospun Microfibers. ACS Chemical Neuroscience. 6, (11), 1781-1788 (2015).
  52. Baranes, K., Moshe, H., Alon, N., Schwartz, S., Shefi, O. Neuronal Growth on l- and d-Cysteine Self-Assembled Monolayers Reveals Neuronal Chiral Sensitivity. ACS Chemical Neuroscience. 5, (5), 370-376 (2014).
  53. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (15), 1700267 (2017).
Ontwerpen van poreuze Silicon Films als dragers van de zenuw groeifactor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter