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Bioengineering

Gestaltung von porösem Silizium Filme als Träger von Nerve Growth Factor

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwerfen und fabrizieren nanostrukturierten poröse Silizium (PSi) Filme als abbaubare Träger für den Nervenwachstumsfaktor (NGF). Neuronale Differenzierung und Auswuchs der PC12 Zellen und Mäusen Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen sind bei der Behandlung mit der NGF geladen PSi Träger gekennzeichnet.

Abstract

Trotz des großen Potenzials des NGF zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen seine therapeutischen Verwaltung stellt eine große Herausforderung dar, da das Protein nicht die Blut - Hirn-Schranke, aufgrund seiner chemischen Eigenschaften überquert und erfordert daher langfristige Lieferung an das Gehirn, um eine biologische Wirkung haben. Diese Arbeit beschreibt Herstellung von nanostrukturierten PSi Filme als abbaubare Träger der NGF für nachhaltige Lieferung dieses sensiblen Proteins. Die PSi-Träger sind speziell auf um hohe Beladung Wirksamkeit und kontinuierliche Freisetzung von NGF für einen Zeitraum von vier Wochen, wobei seine biologischen Aktivität zu erhalten. Das Verhalten der NGF-PSi Träger als ein NGF-Delivery-System ist untersuchten in Vitro anhand ihrer Fähigkeit, neuronale Differenzierung und Auswuchs der PC12 Zellen und dissoziierten DRG-Neuronen zu induzieren. Zellviabilität im Beisein ordentlich und NGF geladen PSi Träger wird ausgewertet. Die Bioaktivität der NGF freigesetzt von den PSi-Trägern ist im Vergleich zu der konventionellen Behandlung der sich wiederholenden kostenlose NGF Verwaltungen. PC12 Zelldifferenzierung analysiert und charakterisiert durch die Messung der drei verschiedenen morphologischen Parametern von differenzierten Zellen; (i) die Anzahl der Neuriten extrahieren aus der Soma (Ii) die gesamten Neuriten Länge und (Iii) die Anzahl der Verzweigungspunkten. PC12 Zellen behandelt mit den NGF-PSi-Trägern zeigen eine tiefe Differenzierung während der gesamten Release. Darüber hinaus zeigen DRG neuronale Zellen kultiviert mit NGF-PSi-Träger einer umfangreiche Neuriten Initiation mit sich wiederholenden kostenlose NGF Verwaltungen Neuronen ähnlich behandelt. Die untersuchten abstimmbaren Träger zeigen die langfristigen Implantate für die NGF Release mit einem therapeutischen Potenzial für Neurodegenerative Erkrankungen.

Introduction

NGF ist essentiell für die Entwicklung und Wartung von Neuronen im peripheren Nervensystem (PNS)1 und spielt eine entscheidende Rolle in das Überleben und die Funktion der basalen Vorderhirn cholinerge Neuronen im zentralen Nervensystem (ZNS)2. Seine pharmakologische hohe Potenzial für die Behandlung von zentralen Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson, wurde allgemein mit klinischen Studien derzeit im Fortschritt3,4,5nachgewiesen, 6. Die größte Herausforderung bei der Bereitstellung von NGF an die CNS wohnt in seiner Unfähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke (BBB), wenn Sie systemisch verabreicht7. Darüber hinaus NGF Anfälligkeit für schnelle enzymatische Abbau macht seiner kurze Halbwertszeit und deutlich begrenzt seine therapeutische Verwendung8,9. Daher ist eine unbefriedigte Herausforderung, Delivery-Systeme zu entwerfen, die für eine längere und kontrollierte Freisetzung von NGF auf sichere Weise zu ermöglichen. Verschiedenen NGF-Delivery-Systeme, einschließlich der Polymer-basierten Systemen wurden studierte10,11,12,13,14,15, 16 , 17. die Veröffentlichung Profile dieser Systeme zeichneten sich oft durch eine ausgeprägte ersten Ausbruch folgte durch eine langsame kontinuierliche Freisetzung, wo in der zweiten Stufe die Freisetzungsrate erheblich geringer im Vergleich zu den ersten Ausbruch11 ,18,19. Darüber hinaus wurden die Inaktivierung des Proteins durch die sauren Abbauprodukte der Polymere (z.B., poly(lactic-co-glycolic) Säure) oder Verlust der NGF Bioaktivität bei der Kapselung mit dieser Systeme20beobachtet.

Nanostructured PSi zeichnet sich durch mehrere ansprechende Eigenschaften, wie hohe Fläche, poröse großvolumige, Biokompatibilität und abstimmbaren Abbaubarkeit in Körperflüssigkeiten, für eine viel versprechende Medikamente Lieferung Plattform21wachsenden, 22,23,24,25,26,27,28. Richtige Auswahl der Anodisierung Bedingungen kann mühelos die PSi strukturellen Eigenschaften (z.B., Porosität und Pore Größe) für Schneiderei Medikament be- und Freigabe Kinetik21,27einstellen. Darüber hinaus erlauben bequeme chemische Wanderrouten, ändern Sie die Oberfläche des PSi und damit weiter optimieren die Auflösegeschwindigkeit Si Gerüst unter physiologischen Bedingungen und die Freisetzungsraten der Droge22,24, 29,30.

Diese Arbeit konzentriert sich auf eine PSi-basiertes Liefersystem für längere kontrollierte Freisetzung von NGF zu entwerfen. Die Wirkung der NGF-PSi Träger auf neuronale Differenzierung und Auswuchs wird mit PC12 Zellen untersucht und DRG-Neuronen zu trennen. Wir zeigen, dass die geladenen NGF die Bioaktivität bewahrt hat, durch Induktion Neuriten Auswuchs und Tiefe Differenzierung über einen 1-Monats-Zeitraum innerhalb einer einzigen Verwaltung.

Protocol

Alle Methoden sind durch die Ethik-Ausschuss der Bar Ilan Universität genehmigt worden.

1. Herstellung von oxidierten PSi (beteiligte2) Träger

  1. Schneiden Sie einen Si-Wafer (einseitig polierte auf < 100 > Gesicht und stark Bor-dotierte, p-schaltend, 0,95 mΩ·cm) in 1,5 cm × 1,5 cm Muster mit einem Stift diamantbestückte.
  2. Die Si-Proben in einem Rohrofen bei 400 ° C für 2 Stunden in der Luft oxidieren (Heizung Rate: 25 ° C/min, natürliche Kühlung).
  3. Tauchen Sie die Si-Proben in einer Lösung von wässrige Flusssäure (HF) (48 %), DdH2O und Ethanol (99,9 %) (1:1:3 V/V/V) für 5 min; dann abspülen der Proben mit Ethanol dreimal und Trocknen unter einer Stickstoff-Stream.
    Hinweis: Vorbereiten und HF-Lösung in Plastikware nur, wie HF löst sich Glas zu speichern.
    Achtung: HF ist eine stark ätzende Flüssigkeit, und es sollte mit äußerster Sorgfalt behandelt werden. Im Falle einer Exposition gründlich mit Wasser abspülen und den betroffenen Bereich mit HF Gegenmittel Gel zu behandeln; Suchen Sie sofort medizinische Versorgung.
  4. Montieren Sie die Si Probe in einer Polytetrafluorethylen-Ätzen-Zelle mit einem Streifen aus Aluminiumfolie als ein Rücken-Kontakt und eine Platin Spule als Gegenelektrode.
  5. Etch Opferschicht in einer 3:1 (V/V) Lösung von wässrigen HF und Ethanol (99,9 %) für 30 s bei einer konstanten Stromdichte von 250 mA/cm2; dann spülen Sie die Oberfläche des daraus resultierenden PSi film mit Ethanol dreimal und trocken unter einer Stickstoff-Stream.
  6. Die frisch geätzt poröse Schicht in einer wässrigen NaOH-Lösung (0,1 M) für 2 min auflösen. Dann mit Ethanol dreimal spülen und Trocknen unter einer Stickstoff-Stream.
  7. Eintauchen der Probe in einer Lösung von wässrigen HF (48 %), DdH2O und Ethanol (99,9 %) (1:1:3 V/V) 2 min. lang. Dann mit Ethanol dreimal spülen und Trocknen unter einer Stickstoff-Stream.
  8. Elektrochemisch Ätzen die Si-Probe in einer 3:1 (V/V) Lösung von wässrigen HF und Ethanol (99,9 %) für 20 s bei einer konstanten Stromdichte von 250 mA/cm2; dann spülen Sie die Oberfläche des daraus resultierenden PSi film mit Ethanol dreimal und trocken unter einer Stickstoff-Stream.
  9. Thermisch oxidieren die frisch geätzt PSi Proben in einem Rohrofen bei 800 ° C für 1 h in der Luft (Heizung Rate: 25 ° C/min, natürliche Kühlung) zu einem porösen SiO2 (beteiligte2) Gerüst bilden.
  10. Spin-Mantel orientierter2 Proben mit einer positiven dicken Fotolack bei 4.000 u/min für 1 min; dann die beschichteten Proben bei 90 ° C für 2 min backen (Heizung Rate: 5 ° C/min, natürliche Kühlung).
  11. Würfeln Sie die beteiligte2 Proben in 8 mm × 8 mm Proben mit einer Würfeln.
  12. Um den Fotolack entfernen, Einweichen Sie die gewürfelten Proben in Aceton für 3 h; dann gründlich mit Ethanol spülen und Trocknen unter einer Stickstoff-Stream.

2. Laden beteiligte2 mit NGF

  1. Zur Vorbereitung der NGF laden Lösung lösen Sie 20 µg der murinen β-NGF in 400 µL 1:1 (V/V) Lösung von 0,01 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und DdH2O auf.
  2. 52 µL der Laden-Lösung auf die beteiligte2 Probe hinzufügen und 2 h bei RT in einer verschlossenen Schüssel inkubieren.
    Hinweis: Hohe Luftfeuchtigkeit in der Schale zu verhindern Austrocknung der Lösung während der Inkubation.
  3. Sammeln Sie die Lösung auf der Oberseite der Probe für die anschließenden Quantifizierung der NGF Inhalt innerhalb der Beteiligte2 Träger.
    Hinweis: Das Protokoll kann nicht hier angehalten werden, wegen der Gefahr der Trocknung und Denaturierung des Proteins, NGF laden in orientierter2 sollte unmittelbar vor der beabsichtigten Verwendung durchgeführt werden.

3. Quantifizierung der NGF Verladung von NGF ELISA

  1. Zur Vorbereitung der ELISA-Platte fügen Sie 100 µL 0,5 µg/mL Capture Antikörper (Kaninchen Anti-Hβ-NGF) jeweils gut, die Dichtplatte und Inkubation über Nacht bei RT hinzu
  2. Aspirieren Sie die Brunnen um Flüssigkeit zu entfernen und waschen Sie die Platte viermal mit 300 µL Waschpuffer (0,05 % Tween 20 in PBS) pro Bohrloch; invertieren Sie nach der letzten Wäsche die Platte, um verbleibende Puffer zu entfernen und auf einem Papiertuch Tupfen.
  3. Jedes gut 300 µL Blockpuffer (1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS) hinzufügen und mindestens 1 h bei RT inkubieren Dann abzusaugen und Waschen der Plattenrandes viermal, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  4. Zur Vorbereitung einer Kalibrationskurve NGF laden Lösung verdünnen (siehe Punkt 2.1) im Verdünnungsmittel (0,05 % Tween-20, 0,1 % BSA mit PBS-Puffer) bis 1 ng/mL. Führen Sie dann 2-fold serielle Verdünnungen von 1 ng/mL auf Null, um die Kalibrierung Kurve Proben zu erhalten.
  5. Zur Vorbereitung der Proben verdünnen Sie NGF laden Lösung (aus Schritt 2.1) und die gesammelten Post-laden-Lösung (aus Schritt 2.3) in Verdünnungsmittel 1: 100.000 und 1: 10.000 bzw., um die Konzentrationen Reichweite von ELISA-Kit im Einsatz (16-1.000 Pg/mL).
  6. Hinzufügen von 100 µL der verdünnten Proben und Kalibrierung Kurve Proben jeweils gut in dreifacher Ausfertigung und 2 h bei RT inkubieren; dann abzusaugen und Waschen der Plattenrandes viermal, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  7. Jedes gut 100 µL 1 µg/mL Detektionsantikörper (biotinylierte Kaninchen Anti-Hβ-NGF) hinzu und 2 h bei RT inkubieren. Dann abzusaugen und Waschen der Plattenrandes viermal, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  8. Avidin-Meerrettich Peroxidase (HRP) 1:2,000 im Verdünnungsmittel verdünnen, 100 µL pro Bohrloch hinzufügen und 30 min bei RT inkubieren Jetzt aspirieren Sie und waschen Sie die Platte viermal wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  9. Jedes gut fügen Sie 100 µL Substratlösung hinzu und inkubieren Sie 25 min bei RT auf die Farbentwicklung. Messen Sie die Absorption bei 405 nm Wellenlänge Korrektur eingestellt bei 650 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.
  10. NGF-Konzentration in der Laden-Lösung und die gesammelten Post-laden-Lösung anhand der Eichkurve zu bestimmen.
  11. Zum Berechnen der NGF Masse innerhalb orientierter2 Träger geladen subtrahieren Sie NGF Masse in der gesammelten Post-laden-Lösung aus der NGF Masse beim Laden der Lösung. NGF laden Wirksamkeit wird durch die folgende Gleichung berechnet:
    Equation

4. in-vitro- NGF Haftentlassung beteiligte2

  1. Inkubieren Sie die NGF geladen orientierter2 Träger in 2 mL 0,01 M PBS mit 1 % (w/V) BSA und 0,02 % (w/V) Natriumazid bei 37 ° C und unter orbital Agitation von 100 u/min.
  2. Sammeln Sie alle 2 Tage die Lösung und ersetzen Sie es mit 2 mL frische PBS. Die gesammelten Release-Samples in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-20 ° C für weitere Analysen zu speichern.
  3. Verwenden Sie die im Handel erhältlichen NGF ELISA-Assay NGF Inhalte in die Release-Samples wie in 3.1-3.9 beschrieben zu quantifizieren.
    Hinweis: Wenn Sie die Release-Samples für ELISA Quantifizierung vorbereiten, sollte verschiedene Verdünnungen zu verschiedenen Zeitpunkten entlang der Release-Zeit (d. h., frühere Zeit, die Punkte viel mehr als späteren Zeitpunkten verdünnt werden sollte) durchgeführt werden. Darüber hinaus für jede Veröffentlichung Probe sollten mindestens zwei verschiedenen Verdünnungen durchgeführt und dafür erreichen die Konzentrationen verschiedener ELISA-Kit quantifiziert.
  4. Bestimmen Sie NGF-Konzentration in der Release-Samples anhand der Eichkurve und zeichnen Sie ein Diagramm der kumulative NGF Veröffentlichung im Laufe der Zeit.

(5) Quantifizierung der in-vitro- Si Erosion durch induktiv gekoppelten Plasma Atomic Emission-Spektroskopie (ICP-AES)

  1. Verdünnen Sie 1 mL der Freigabe Proben 01:10 in Release Puffer (0,01 M PBS mit 1 % (w/V) BSA und 0,02 % (w/V) Natriumazid) für ein Gesamtvolumen von 10 mL.
  2. Si atomic Emission Peaks bei 212,4, 251.6 und 288.2 nm für die verdünnten Proben zu überwachen.
  3. Si-Konzentration in den Proben anhand einer Kalibrationskurve zu bestimmen.
  4. Um die Si-Abbau-Profil zu erstellen, drücken Sie Si-Gehalt zu jedem Zeitpunkt als prozentualer Anteil der gesamten Si-Gehalt der Träger (d. h. der kumulativen Si-Gehalt entlang der Freigabedauer).
    Hinweis: Um genaue Quantifizierung der gesamten Si-Gehalt der Träger zu gewährleisten, sind Release-Samples Stichprobe 1 Monat nach der Endpunkt der Freisetzung zu studieren und auf Si-Konzentration mit ICP-AES analysiert. Zusammenfassung der kumulativen Si-Gehalt entlang der Freigabedauer und der Si-Gehalt in der Post-Release-Samples stellt 100 % der Si-Gehalt.

6. Zelle Rentabilität und Wachstum in Anwesenheit von NGF geladen orientierter2 Träger

  1. Ratte Phäochromozytom (PC12) Zellkultur
    1. Bereiten Sie das grundlegende Wachstumsmedium durch Zugabe von 10 % Pferd Serum (HS), 5 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,2 % Amphotericin Roselle Park medizinische Institute (RPMI) Medium.
    2. Bereiten Sie Differenzierung Medium durch Zugabe von 1 % HS, 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,2 % Amphotericin RPMI Medium.
    3. Wachsen Sie Zellsuspension (106 Zellen) in eine 75 cm2 Kultur Flasche mit 10 mL der grundlegenden Wachstumsmedium für 8 Tage; alle 2 Tage hinzugeben 10 mL grundlegende Wachstumsmedium in den Kolben.
    4. Um differenzierte PC12 Zellkultur zu generieren, übertragen Sie die Zellsuspension auf einem Zentrifugenröhrchen; Zentrifugieren Sie Zellen für 8 min bei 200 X g und RT. Entsorgen des Überstands.
    5. Die Zellen in 5 mL frisches grundlegende Wachstumsmedium aussetzen und erneut Zentrifugieren der Zellen für 5 min bei 200 X g und RT; den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 3 mL grundlegende Wachstumsmedium.
    6. Separate Zellcluster aspirieren Sie die Zellen, die zehnmal mit einer 23 G Spritze.
    7. Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hemocytometer Zelle Zählers und Samen 104 Zellen/cm2 Arbeitsbereich auf Kollagen Typ l beschichtete Platten in Anwesenheit von Differenzierung Medium.
    8. Fügen Sie nach 24 Stunden frisch murinen β-NGF (50 ng/mL) oder NGF geladen PSiO2 Träger pro Platte hinzu.
      Hinweis: Höhere NGF-Konzentrationen (> 50 ng/mL) besitzen genaue die Wirkung wie der angegebenen Konzentration.
    9. Erneuern Sie die Differenzierung Medium alle 2 Tage.
    10. Zu evaluieren Zellviabilität, fügen Sie 10 % (V/V) von der Lebensfähigkeit Indikatorlösung (Resazurin-basiert) zu repräsentativen Zeitpunkten und 5 h bei 37 ° C inkubieren; Messung der Extinktion bei 490 nm mit einem Spektralphotometer.
  2. Mäuse Dorsal Root Ganglien (DRG) Zellkultur
    1. DRGs aus zwei 7 Wochen alten C57bl Mäusen isolieren, zuerst begießen die Mäuse mit 70 % Ethanol und einen Einschnitt in die Haut zu entfernen.
    2. Schneiden Sie die Basis des Schädels und die Muskeln der Bauchwand, bis das Rückenmark ausgesetzt ist.
    3. Entfernen Sie der Wirbelsäule zu, indem man einen Schnitt auf der Ebene der Oberschenkelknochen und reinigen Sie das umliegende Gewebe zu.
    4. Schneiden Sie die Spalte in drei Stücke; dann geschnitten Sie jedes Stück in der Mittellinie, schälen, das Rückenmark und erzeugen zwei Hälften.
    5. Unter dem Binokular extrahieren alle DRG Ganglien und tauche sie ein in eine kalte Hank ausgeglichene Salzlösung (HBSS).
    6. Reinigen Sie das umgebende Bindegewebe Sehnen der DRGs auf eine Petrischale und entfernen Sie vorsichtig die restliche Hirnhaut unter dem Binokular.
    7. Distanzieren Sie die DRG-Zellen durch Inkubation sie für 20 min in 1.000 U von Papain.
    8. Zentrifugieren Sie die Zellen für 4 min bei 400 X g. Verwerfen Sie den Überstand und halten Sie die Zelle Pellet.
    9. Aufschwemmen Sie das Pellet in einer 10 mg/mL Kollagenase und 12 mg/mL-Dispase-II-Lösung und 20 min bei 37 ° c inkubieren
    10. Zentrifugieren Sie die Zellen für 2 min bei 400 X g; verwerfen Sie den Überstand und halten Sie die Zelle Pellet.
    11. Genannte Zelle Pellet in 1 mL HBSS, Glukose 10 mM und 5 mM HEPES (pH 7,35) durch wiederholte Passage durch einen verengten Pasteurpipette.
    12. Fügen Sie die dissoziierten Zellen sanft L-15 Medium mit 20 % der Silica-basierten kolloidales Medium für Zellseparation durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung hinzu; Zentrifuge für 8 min bei 1.000 X g. Aspirieren Sie überstand und halten Sie die Zelle Pellet.
      Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist, zu trennen und zu reinigen, die Nervenzellen vor axonalen Trümmer, Schwann-Zellen und Fibroblasten.
    13. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL f-12 Medium; Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g; den Überstand verwerfen und erneut das Pellet in 1 mL f-12 Medium.
    14. Zählen der Zellen und 2 × 104 Samenzellen auf Poly-L-Lysin und Laminin beschichtet unten 35 mm Kultur Glasschalen, in einem f-12 antibiotikafreien Medium ergänzt mit 10 % FBS.
      Hinweis: Saatgut zunächst die Zellen in einem kleinen Volumen des Mediums (150-200 µL); Fügen Sie nach 2 h Inkubation bei 37 ° C Medium, einem Endvolumen von 2 mL.
    15. Fügen Sie sanft die NGF geladen orientierter2 Träger oder frische murinen β-NGF (50 ng/mL) pro Platte.
    16. Beheben Sie nach 2 Tagen die Zellkultur von mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung für 15 min bei RT Inkubation; Immunostain der Zellkultur mit einem gemeinsamen Immunfluoreszenz Färbung Verfahren31.
    17. Bild der neuronalen Zellkulturen mit einem konfokalen Mikroskop.

(7) Zellanalyse Differenzierung

  1. PC12 Zellen Differenzierung Prozentsatz im Beisein von NGF geladen orientierter2 Träger
    1. Inkubieren Sie die NGF geladen orientierter2 Träger in 2 mL Differenzierung Medium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.
    2. Alle 2 Tage, sammeln Sie die Lösung zu und ersetzen Sie es mit 2 mL frisches Medium. Die gesammelten Release-Samples in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-20 ° C für weitere Analysen zu speichern.
    3. Samen PC12 Zellen in 12-Well Kollagen-beschichteten Platten wie in Abschnitt 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. Nach 24 h vorstellen der Release-Samples von repräsentativen Zeitpunkten (von Abschnitt 5.1.2) zu den verschiedenen Brunnen; Fügen Sie für Kontroll-Vertiefungen frische murinen β-NGF (50 ng/mL).
    5. Nach 24 h Bild, die Zellen mit einem Lichtmikroskop.
    6. Um den Prozentsatz der Neurit tragenden Zellen bestimmen, manuell zählen Zellen, die Neuriten aus der Gesamtzahl der Zellen in die Bilder zu klein geworden war (n = 5 Frames für jedes gut); Zeichnen Sie ein Diagramm der Anteil an PC12 Zellen mit Neuriten Auswuchs im Laufe der Zeit.
      Hinweis: Undifferenzierte PC12 Zellen schien Struktur ohne Neuriten, gerundet haben, während die differenzierte Zellen durch Auswuchs von Neuriten (mindestens eine Mindestlänge gleich der Zelle Soma Durchmesser) oder morphologische Veränderungen identifiziert werden können.
  2. Morphometrische Analyse von differenzierten PC12 Zellen
    1. Erwerben Sie für Verarbeitung Bildanalyse Phasenbilder von kultivierten Zellen bis zu 3 Tage nach der Behandlung mit NGF (als freie Reagenz oder das Freigabe-Produkt der NGF geladen orientierter2 Träger).
      Hinweis: Zu späteren Zeitpunkten (abgesehen von Tag 5) entwickeln die Zellen hochkomplexe Netzwerke, morphometrische Messungen an einer einzelnen Zelle Auflösung zu verhindern.
    2. Download Bildbearbeitungsprogramm NeuronJ, eine ImageJ-Plug-in ermöglicht eine halbautomatische Neuriten Ablaufverfolgung und Längenmessung.
    3. Konvertieren Sie die Image-Datei in ein 8-Bit-Format und Maßnahme Pixel Mikrometer-Verhältnis mit dem Bild Skala Bar.
    4. Legen Sie den Maßstab mit Analyze | Befehl Set Varia und Messen Sie die Länge der einzelnen Neuriten.
    5. Manuell zählen Sie die Anzahl der Verzweigungen Punkte und die Anzahl der Neuriten aus jeder Zelle Soma.
      Hinweis: Eine durchschnittliche Neuriten Länge beträgt 1 Tag nach der NGF Behandlung ca. 30 µm. Die gemessenen Neuriten Längen können weit verbreitet.

Representative Results

Oxidierte PSi Filme werden hergestellt, wie im Protokoll beschrieben. Die Si-Wafer unterliegt einer elektrochemischen Ätzen für 20 s bei 250 mA/cm2 (Abbildung 1ai), gefolgt von thermischen Oxidation bei 800 ° C (Abbildung 1aii), ein orientierter2 Gerüst zu produzieren. Hochauflösenden Rasterelektronenmikroskopie erscheinen (HR-SEM) Bilder von der daraus resultierenden orientierter2 Film in Bild 1 bc. Draufsicht Aufnahme des Films (Abbildung 1 b) zeigt seine hochporöse Natur mit Poren ca. 40 nm im Durchmesser. Cross-sectional Schliffbild eines gespalten Films (Abbildung 1 c) zeigt eine poröse Schichtdicke von 2,9 µm, gekennzeichnet durch Vernetzung von zylindrischen Poren.

Die beteiligte2 Filme werden mit der NGF Lösung zu laden, wie in Abbildung 1Aiiigeladen. NGF laden wird quantifiziert mittels NGF ELISA durch Messung der NGF-Konzentrationen in der Laden-Lösung vor und nach der Inkubation mit orientierter2 Filme. Die durchschnittliche Masse des geladenen NGF pro beteiligte2 Film ist als 2,8 ± 0,2 µg bestimmt, die eine hohe Belastung Wirksamkeit von 90 % (w/w) (Daten nicht gezeigt31) entspricht. Um die NGF Freisetzungsprofil aus den orientierter2 Trägern zu etablieren, werden die geladenen Filme mit PBS-Puffer bei 37 ° C inkubiert und alle 2 Tage Aliquote sind für die Quantifizierung von die freigegebenen Proteinkonzentration mittels ELISA NGF abgetastet. Darüber hinaus wird der Si-Gehalt in der Release-Samples quantifiziert mit ICP-AES und Si Erosion Kinetik der Beteiligte2 Träger gegründet. Abbildung 2 zeigt die NGF-Version und die entsprechenden Si Abbau Profile der porösen Träger. Ein verzögerter Freisetzung von NGF, ohne Burst-Effekt, wird für einen Zeitraum von 1 Monat erreicht. NGF-Release in der ersten Woche ist schneller (Steigung = 0.442) im Vergleich zu eine viel langsamere Freigabe in späteren Tagen entlang der Freigabedauer (Steigung 0,043). Es sei darauf hingewiesen, dass während der gesamten Release 1 Monat Zeit ausreicht, die Höhe der NGF veröffentlicht zur Induktion Tiefe Differenzierung von PC12 Zellen, wie später erläutert wird. Die kumulative NGF veröffentlicht erweist sich in eine gute Korrelation (R2 = 0,971) mit der restlichen Si Inhalt, wie in den Einschub der Abbildung 2dargestellt.

Als nächstes die Bioaktivität der NGF geladen orientierter2 Träger zeichnet sich in Vitro, PC12 Zellen und DRG-Neuronen dienen als Modelle für neuronale Differenzierung und Auswuchs. Das ausgesät PC12 Zellen und dissoziierten DRG-Neuronen, wie im Protokoll beschrieben. Zunächst wird Zellviabilität im Beisein der Beteiligte2 Träger durch Inkubation der Zellen mit ordentlichen (nicht geladen) oder NGF geladen orientierter2geprüft; Steuerplatten und Zellen mit ordentlich orientierter2 behandelt werden alle 2 Tage mit kostenlosen NGF ergänzt. Keine Zytotoxizität wird beobachtet, unter Einwirkung der Zellen, die pur oder NGF geladen orientierter2 Träger (Abb. 3a), zeigen, dass beteiligte2 mit dieser Zelllinie biokompatibel ist. Abbildung 3 b zeigt repräsentative HR-SEM Mikrographen PC12 Zellen mit NGF geladen orientierter2 Träger behandelt. Die beobachteten Zellen Extrakt Neuriten und Form charakteristisch verzweigte neuronale Netze. Ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn die Aussaat DRG neuronale Zellen in Anwesenheit von NGF geladen orientierter2 Träger getrennt. Konfokale Bilder von Immunostained DRG Zellen kultiviert mit NGF geladen orientierter2 Trägern (Abbildung 3e) zeigen eine umfangreiche Neuriten Initiierung und Dehnung, ähnlich wie die Positivkontrolle (d.h., Neuronen mit kostenlosen ergänzt NGF, siehe Abbildung 3d), während die negativen Steuern (d. h.unbehandelten Neuronen, siehe Abbildung 3 c), weist eine schlechte Ausmaß der Neurit Auswuchs.

Um PC12 Zellen Differenzierung Prozentsatz im Beisein von NGF befreit die beteiligte2 Träger zu bewerten, ist Differenzierung durch zählen der Zellen mit Neuriten Auswuchs aus der gesamten Zellpopulation quantifiziert. Abbildung 4 fasst die Ergebnisse in Bezug auf den Anteil von differenzierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten über einen Zeitraum von 26 Tagen. Deutliche Differenzierung Prozentwerte werden während der gesamten Studium erreicht. Insbesondere hat veröffentlichten NGF nach 26 Tagen, Differenzierung von über 50 %, ein Prozentsatz der Differenzierung induziert, die deutlich höher zu früheren Studien mit Polymer-basierten Träger16verglichen wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NGF Einschluss in den porösen Host die biologische Aktivität des Proteins zur Induktion Tiefe Differenzierung für einen Zeitraum von ~ 1 Monat erhalten.

Um die Wirkung von NGF-orientierter2 Träger auf neuronale Differenzierung eingehender zu untersuchen, werden drei charakteristische morphologische Parameter der differenzierten PC12 Zellen auf der Ebene der einzelnen Zelle gemessen: (i) die Anzahl der Neuriten aus der Soma (extrahieren (II) die gesamten Neuriten Länge und (Iii) die Anzahl der Verzweigungspunkten. Die Zellen werden mit NGF geladen orientierter2 Träger oder wiederholte Verabreichung von freien NGF (alle 2 Tage), als ein Steuerelement behandelt. Abbildung 5a -c präsentiert die morphometrische Analyse der Zellpopulation am Tag 1 und 3. Die PC12 Zellen behandelt mit der NGF geladen orientierter2 zeigen morphometrische Werte, die die Steuerung der Behandlung für alle drei getesteten Parameter ähnlich sind. Nach 3 Tagen sind die Werte aller morphologischen Parameter beobachtet, um mit der gleichen Rate für die NGF geladen orientierter2 Träger und die Behandlung der sich wiederholenden Verwaltung der freien NGF erhöhen.

Figure 1
Abbildung 1: Herstellung von orientierter2 Filme. (a) Fertigung Schema der Beteiligte2 Träger: (i) Silizium-Wafer unterliegt einer elektrochemischen Ätzen für 20 s bei 250 mA/cm2, gefolgt von (Ii) thermische Oxidation bei 800 ° C, leski2 beteiligte und (Iii) Laden von NGF zu produzieren physikalische Adsorption (Schaltpläne zeichnen nicht maßstabsgetreu). (b-c) Draufsicht und Querschnitt Elektron Mikrographen eine charakteristische orientierter2 Film. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: NGF Release und Si Erosion Profile von NGF geladen orientierter2 Trägern. Das Ausmaß des Abbaus der Beteiligte2 Träger präsentiert sich als der Anteil der verbleibenden Si-Gehalt auf jeden Zeitpunkt aus der gesamten Si-Gehalt des porösen Films. Der Inset zeigt die Korrelation zwischen der kumulative NGF freigesetzt und verbleibende Si Inhalte. Fehler Balken repräsentieren SD, n = 3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Zellviabilität und Wachstum in Anwesenheit von NGF geladen orientierter2 Träger. (a) In-vitro- Zytotoxizität Charakterisierung. PC12 Zellen Lebensfähigkeit ist gemessen an 1, 3 und 7 Tagen nach ihrer Exposition gegenüber ordentlich (nicht geladen) beteiligte2 Träger, NGF geladen orientierter2 Träger oder kostenlose NGF (50 ng/mL alle 2 Tage, Steuerplatten). (b) Elektron Mikrographen PC12 Zellen kultiviert mit NGF geladen orientierter2 Träger für 9 Tage. Links: ein Zoom-in, Darstellung Neuriten Auswuchs aus der Zelle Soma; rechts: ein Zoom-Out, unter Angabe der hochkomplexen neuronalen Netzwerks gebildet. (c-e) Konfokale Mikroskopie Bilder von Immunostained DRG neuronale Zellkultur (2 Tage nach der Aussaat): (c) unbehandelten Zellen; (d) Zellen ergänzt mit gratis NGF (50 ng/mL); (e) NGF-orientierter2 Träger. Immunofluorescent Färbung der Neurofilamente H ermöglicht Bildgebung der Zelle Soma und outgrowing Neuriten. Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: PC12 Zellen Differenzierung Prozentwerte bei Kontakt mit NGF aus NGF geladen orientierter2 Träger zu repräsentativen Zeitpunkten freigesetzt. Differenzierung-Prozentsatz wird als die Anzahl der Zellen mit Neuriten Auswuchs aus der gesamten Zellpopulation ausgedrückt. Kontrolle der Behandlung bezieht sich auf Zellen ergänzt mit kostenlosen NGF (50 ng/mL). Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten werden entlang der x-Achse dargestellt; Maßstabsleiste = 25 µm für Aufnahmen von Tag 2, 8, 14, 26 und 50 µm für Kontrolle Schliffbild. Fehler Balken repräsentieren SD, n = 3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: morphometrische Analyse von differenzierten Zellen PC12. Drei morphologische Parameter der differenzierten PC12 Zellen gemessen werden auf die einzelne Zellenebene am Tag 1 und 3 Wirkstoffexposition NGF geladen orientierter2 Träger oder wiederholte Verabreichung von NGF kostenlos alle 2 Tage (Kontrolle); (ein) total Neuriten Länge (b) Anzahl der Neuriten extrahieren aus der Zelle Soma und (c) Anzahl der Verzweigungspunkten. Fehler Balken repräsentieren SD, n = 3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Abbaubare nanostrukturierten orientierter2 Filme sind hergestellt und als Träger für NGF, so dass für seine kontinuierliche und verlängerte Freigabe, seine biologischen Aktivität unter Beibehaltung eingesetzt. In Vitro demonstriert das Potenzial der Beteiligte2 , dienen als ein Fördersystem für NGF ist durch den Nachweis ihrer Fähigkeit zur Freigabe ausreichend NGF Dosierung induzieren neuronale Differenzierung und Förderung Auswuchs der PC12 Zellen und DRG-Neuronen. Die entwickelten Filme dient als langfristige Stauseen von NGF für zukünftige Behandlung in Vivo.

Die strukturellen Eigenschaften der gefertigten PSi Filme wurden speziell für NGF Nutzlast zugeschnitten; die Stromdichte von der elektrochemischen Ätzvorgang wurde angepasst, um Porengröße ca. 40 erhalten nm, die leicht, wenn der NGF, ein Protein mit einer Molecular weight von 26,5 kDa32 und einen charakteristischen Durchmesser von ~ 4 nm33 berücksichtigen würde, innerhalb der poröse Matrix. Darüber hinaus wurde thermische Oxidation des porösen Gerüstes durchgeführt, um physikalische Adsorption von NGF ermöglichen durch elektrostatische Anziehung des positiv geladenen Proteins, die negativ geladenen oxidierte PSi-Oberfläche. Die Oberflächenchemie der PSi übt einen großen Einfluss auf die Wirksamkeit laden und kann leicht eingestellt werden, um die Wechselwirkungen zwischen der Nutzlast und der poröse Matrix besser kontrollieren. Diese Wechselwirkungen bestimmen anschließend die Struktur der adsorbierten Protein-Moleküle und deren Bioaktivität34,35,36. Abschließend wurde das System angepasst, um optimale Beladung von NGF zu erhalten durch eine sorgfältige Auswahl der geeignete Porengröße, Oberflächeneigenschaften und der ideale laden Lösungsmittel und der daraus resultierende Effekt der genannten Parameter diktiert das Protein-laden Wirksamkeit. Daher Änderungen in der Fertigung-Parameter (z.B., Stromdichte, Radierung Zeit, Art und Konzentration der Dotierstoff oder Elektrolyt), Oberflächenchemie oder laden Lösung Zusammensetzung beeinflussen kann, die Belastung Wirksamkeit und Bioaktivität von der geladene Protein.

Die Freisetzungsrate eine Nutzlast von PSi OrPSiO2Host ist in der Regel durch eine Kombination von zwei gleichzeitigen Mechanismen, out Diffusion von der Nutzlast-Molekülen und den Abbau der Si Gerüst37diktiert. Die Erosion und anschließende Auflösungsgeschwindigkeit sind Implantationsort, der Pathologie und Krankheit Staat28,38,39betroffen. In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass wenn eine unterschiedliche Freisetzungsrate für eine bestimmte therapeutische Anwendung erforderlich ist, kann das Freisetzungsprofil geändert und verlängert durch Ändern der Oberflächenchemie der PSi Oberfläche38,40, 41. Verschiedene chemische Modifikationen, wie thermische Oxidation, thermische Karbonisierung und Hydrosilylierung Techniken haben gezeigt, dass die PSi-Oberfläche zu stabilisieren und beeinflussen seine Degradierung und daraus resultierende Nutzlast Freigabe35,42 ,43,44,45. Darüber hinaus sollten Laden der NGF in den Trägern durch kovalente Bindung die Proteinmoleküle an Si Gerüst über verschiedene Wege der Oberflächenchemie in einer längeren Version führen, da die Nutzlast nur freigegeben wird, wenn die kovalente Bindungen gebrochen sind oder die Unterstützung von Si-Matrix ist abgebaut,21.

Darüber hinaus kann im Anschluss an den Fertigungsprozess PSi gerendert werden in verschiedenen Konfigurationen neben Dünnfilme, z. B. Mikropartikel46, Nanopartikel47 oder freistehende Membranen26, die auch als Träger eingesetzt werden können NGF und erfüllen spezifische Anwendungsanforderungen.

Um klinisch relevant zu sein, sollte der NGF Inhalt innerhalb der Beteiligte2 Träger die Reichweite von therapeutischen Dosen. In der im Protokoll beschriebenen Methode die NGF geladen orientierter2 Träger in eine einheitliche Lautstärke von 2 mL der Zelle Medien eingebracht werden oder PBS-Puffer und damit die Konzentration der Laden-Lösung und die jeweiligen NGF Masse geladen wurden angepasst, um die Ausbeute eines NGF-Konzentration, die relevant für das getestete in-Vitro -System veröffentlicht. Bei der Verwendung dieser Methode für verschiedene Systeme, wie z. B. Ex Vivo oder in-Vivo -Umgebungen, sollte die Konzentration der NGF laden Lösung erhöht und die benötigte Dosis angepasst. Alternativ kann höhere NGF Inhalt durch die Einführung mehrerer Träger pro geprüften Bereich oder über größere Flächen orientierter2 Proben einzuholen.

Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass in späteren Zeitpunkten entlang der Freigabedauer, die freigegebenen NGF-Konzentrationen deutlich niedriger als bei früheren Zeitpunkten sind. Die Tatsache, dass der NGF-Fluss im Laufe der Zeit nicht konstant ist muss berücksichtigt werden, wenn das System nach Anwendung Bedürfnissen entwerfen.

Zahlreiche NGF Lieferung Systeme wurden entwickelt und beschrieben, die meisten von ihnen sind Polymer-basierten Systemen, bestehend aus synthetischen oder natürlichen Polymeren Konjugate10,11,12,15 , 16 , 17. diese Systeme haben gezeigt, wirksam verzögerter Freisetzung Profile jedoch die Freigabedauer erstreckte sich über einen Zeitraum von mehreren Tagen mit einem erheblichen Burst-Effekt. Einige dieser Lieferung Plattformen leiden unter kritischen Einschränkungen z. B. Verlust der Bioaktivität auf die Kapselung Prozess, der Nutzung der verschiedenen stabilisierenden Agenten18,48, sowie anspruchsvolle und komplexe Fertigung-Techniken-16. Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung von Trägersystemen für Proteine ist die Fähigkeit, die Bioaktivität der Moleküle bei Einschluss in die Carrier-System zu erhalten. Proteine oder Peptide können geladen werden in PSi/beteiligte2 bei RT oder auch bei niedrigeren Temperaturen ohne starke organische Lösungsmitteln, die beide wichtigen Faktoren sind, wenn diese empfindlichen Biomoleküle zu laden. Frühere Studien haben gezeigt, dass PSi/beteiligte2 Oberflächenchemie eine entscheidende Rolle spielt bei der Minimierung von möglichen Denaturierung von den geladenen Proteine35,36. PSi/beteiligte2 ist daher, insbesondere eine vorteilhafte Nanomaterialien für die Entwicklung von Trägersystemen für Wachstumsfaktoren im allgemeinen und NGF.

Die derzeitige Arbeit konzentriert sich auf die Verwendung dieser Methode als einen neuen therapeutischen Ansatz für die direkte Verwaltung der NGF in das ZNS für potenzielle Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen. Die NGF geladen orientierter2 Träger in den Gehirnen der Mäuse implantiert werden können und die Wirksamkeit der Plattform als langfristige Implantate ist studierte in Vivo. Darüber hinaus kann Kombination von diesen vielversprechenden Träger mit nicht-invasiven Biolistics49,50 die NGF geladen orientierter2 Partikel in eine hohe räumliche Auflösung zu einem lokalisierten Bereich mit einem pneumatischen Roman verwalten ermöglichen Kapillare Waffe zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, denen eine räumlich-zeitliche Medikamentengabe erforderlich ist. Darüber hinaus kann NGF neuronale Wachstum in einem chemischen Gradienten Weise51, ähnlich wie Axon Guidance Moleküle leiten. Somit können die geladene beteiligte2 Träger als Lockstoff-Hot-Spots zu NGF, Wachstum, ergänzend zu anderen Regie Cues52,53direkt dienen. Darüber hinaus können beteiligte2Träger speziell zugeschnitten werden, um die Lieferung von NGF für eine viel verlängert Frist von bis zu mehreren Monaten aufrecht zu erhalten, durch weitere tuning-orientierter2 Nanostruktur und ihrer Oberflächenchemie.

Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

MS und ES bestätigen die Kernleistungen und Unterstützung vom LKW I. Lokey Zentrum für Life Science und Engineering und die finanzielle Unterstützung des Instituts Russell Berrie Nanotechnologie am Technion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

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Gestaltung von porösem Silizium Filme als Träger von Nerve Growth Factor
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Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

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