Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

עיצוב הסיליקון הנקבובי סרטים כמו נשאים של גורם הגדילה העצבי

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

כאן, אנו מציגים לפרוטוקול תכנון, הרכיבו nanostructured הסיליקון הנקבובי (PSi) סרטים כמו ספקים מתכלה עבור גורם הגדילה העצבי (גורם הגדילה העצבי). בידול עצביים, תוצר של PC12 תאים ועכברים העזוב שורש גנגליון (DRG) נוירונים מאופיינים בעת טיפול עם נשאים PSi שנטענו גורם הגדילה העצבי.

Abstract

למרות הפוטנציאל הגדול של גורם הגדילה העצבי לטיפול במחלות ניווניות, ניהול טיפולית שלה מייצג אתגר משמעותי כמו החלבון לא עובר את מחסום הדם - מוח, בשל תכונותיו כימי, ולכן דורש לטווח ארוך משלוח למוח יש השפעה ביולוגית. עבודה זו מתארת פבריקציה נוספת של nanostructured PSi סרטים כמו מתכלה נשאים של גורם הגדילה העצבי לאספקה מתמשכת של חלבון זה רגישים. נשאים PSi מותאמים במיוחד כדי להשיג יעילות גבוהה הטעינה שחרור רצוף של גורם הגדילה העצבי לתקופה של ארבעה שבועות, תוך שמירה על פעילותו הביולוגית. ההתנהגות של נשאים גורם הגדילה העצבי-PSi כמערכת משלוח גורם הגדילה העצבי הוא ובדוקים במבחנה על-ידי בדיקת היכולת שלהם ליצור בידול עצביים, תוצר של תאים PC12 הפומבית DRG נוירונים. תא הכדאיות בנוכחות נושאות PSi מסודר ונטענת על-ידי גורם הגדילה העצבי מוערך. Bioactivity של גורם הגדילה העצבי שוחררו נושאות PSi לעומת הטיפול המקובלת של הממשלים גורם הגדילה העצבי חינם חוזרות. PC12 תאית התמיינות מנותח, המאופיינת על ידי מדידת שלושה פרמטרים מורפולוגיות שונות תאים; (i) מספר neurites חילוץ מ- soma האורך של neurites הכולל (ii) ו- (iii) מספר נקודות הסתעפות. PC12 תאים שטופלו נושאות גורם הגדילה העצבי-PSi מדגימים הבחנה עמוקה לאורך כל תקופת השחרור. יתר על כן, תאים עצביים DRG תרבותי עם נשאים גורם הגדילה העצבי-PSi להראות חניכה נרחב neurite, הדומה נוירונים שטופלו חוזרות הממשלים גורם הגדילה העצבי חינם. נשאי tunable למד להפגין את השתלים לטווח ארוך לשחרור גורם הגדילה העצבי עם פוטנציאל מרפא מחלות ניווניות.

Introduction

גורם הגדילה העצבי הוא חיוני בפיתוח ותחזוקה של נוירונים במערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית)1 , ממלאת תפקיד מכריע ההישרדות והתפקוד של נוירונים שימוש הקדמי הבזליים מערכת העצבים המרכזית (CNS)2. הפוטנציאל תרופתי גבוהה לטיפול במחלות ניווניות במרכז, כגון אלצהיימר, פרקינסון, נרחב הוכח, עם ניסויים קליניים כיום התקדמות3,4,5, 6. האתגר הגדול ביותר ב המשלוח של גורם הגדילה העצבי מערכת העצבים שוכן יכולתו לחצות את מחסום הדם מוח (BBB), כאשר ניתנת מערכתית7. יתר על כן, גורם הגדילה העצבי הרגישות להשפלה מהירה אנזימטי רינדור מחצית חיים קצר שלו ומגביל באופן משמעותי8,שלה לשימוש טיפולית9. לכן, אין אתגר קליניות לתכנן מערכות אספקה אשר מאפשרים שחרור ממושך ומבוקר של גורם הגדילה העצבי באופן בטוח. מערכות אספקה גורם הגדילה העצבי שונים, כולל מערכות מבוססות-פולימר, כבר למדתי10,11,12,13,14,15, 16 , 17. הפרופילים שחרור של מערכות אלה התאפיינו לעיתים קרובות פרץ הראשונית ברורים ולאחריו שחרור רציף איטי, איפה בשלב האחרון קצב השחרור היה נמוך באופן משמעותי בהשוואה פרץ הראשונית11 ,18,19. יתר על כן, איון של החלבון על ידי המוצרים השפלה חומצי פולימרים (למשל, חומצה poly(lactic-co-glycolic)) או אובדן של גורם הגדילה העצבי אתריים במהלך תהליך כימוס נצפו עם מערכות20.

Nanostructured PSi מאופיין על ידי מספר מאפיינים מושך, כולל את שטח גבוהה, נפח נקבוביות גדול, הביו tunable degradability בנוזלים שבגוף, predestining זה מבטיח סמים משלוח פלטפורמה21, 22,23,24,25,26,27,28. בחירה נכונה של תנאיה anodization מאפשר בקלות להתאים את PSi מאפיינים מבניים (למשל, נקבוביות, נקבוביות בגודל) תפירת סמים וטעינה של שחרור קינטיקה21,27. יתר על כן, מסלולים כימיים שונים נוחים מאפשרים לשנות את פני השטח של PSi ולא על ידי כך להמשיך לכוונן את קצב פירוק של לגרדום סי בתנאים פיזיולוגיים ושיעורי שחרור של סמים22,24, 29,30.

עבודה זו מתמקדת בעיצוב מערכת משלוח מבוססת-PSi לשחרור מבוקר ממושך של גורם הגדילה העצבי. השפעת גורם הגדילה העצבי-PSi נושאות על בידול עצביים, תוצר נבדק באמצעות תאים PC12, חלופה מועדפת DRG נוירונים. נדגים גורם הגדילה העצבי טעון שכרה אתריים שלה על ידי גרימת neurite תוצר ובידול עמוקה לאורך תקופה של חודש השחרור תוך ניהול יחידה.

Protocol

כל השיטות אושרו על ידי אתיקה הוועדה של אוניברסיטת בר-אילן.

1. ייצור של ספקים מחמצנים PSi (PSiO2)

  1. חותכים רקיק סי (צד בודד על פני < 100 > סאנסי בכבדות מסטול בורון, מסוג p, 0.95 mΩ·cm) דגימות 1.5 ס"מ × 1.5 ס מ באמצעות עט שקצהו יהלום.
  2. נישחק הדגימות סי תנור צינור ב 400 מעלות צלזיוס במשך שעתיים באוויר פתוח (חימום קצב: 25 ° C/דקה, קירור טבעית).
  3. לטבול את הדגימות סי בפתרון של חומצה הידרופלואורית מימית (HF) (48%), ddH2O ואתנול (99.9%) (1:1:3 v/v/v) עבור 5 דקות; לאחר מכן לשטוף את הדגימות עם אתנול שלוש פעמים, יבש תחת זרם חנקן.
    הערה: להכין ולאחסן פתרון HF plasticware בלבד, כמו HF מתמוסס זכוכית.
    התראה: HF הוא נוזל קורוזיבית מאוד, ואת זה צריך להיות מטופל בזהירות מרבית. במקרה של חשיפה, לשטוף ביסודיות עם מים ולטפל על האזור הפגוע HF הנוגדן ג'ל; מבקשים לטיפול רפואי באופן מיידי.
  4. הר המדגם סי בתא איכול טפלון, באמצעות רצועה של רדיד אלומיניום כמו הגב-קשר ואת סליל פלטינה כמו האלקטרודה מונה.
  5. לחרוט שכבה ההקרבה בפתרון 3:1 (v/v) של HF מימית, אתנול (99.9%) ב-30 s ב צפיפות זרם קבוע של אמא 250/cm2; ואז יש לשטוף פני השטח של PSi וכתוצאה מכך הסרט עם אתנול שלוש פעמים ויבשה תחת זרם חנקן.
  6. להמיס השכבה נקבובי נחרטו טרי ב פתרון NaOH מימית (0.1 M) למשך 2 דקות. לאחר מכן לשטוף עם אתנול שלוש פעמים ויבש תחת זרם חנקן.
  7. לטבול את הדגימה בפתרון של מימית HF (48%), ddH2O ואתנול (99.9%) (1:1:3 v/v) למשך 2 דקות. לאחר מכן לשטוף עם אתנול שלוש פעמים ויבש תחת זרם חנקן.
  8. Electrochemically לחרוט המדגם סי בפתרון 3:1 (v/v) של HF מימית, אתנול (99.9%) 20 s ב צפיפות זרם קבוע של אמא 250/cm2; ואז יש לשטוף פני השטח של PSi וכתוצאה מכך הסרט עם אתנול שלוש פעמים ויבשה תחת זרם חנקן.
  9. תרמית נישחק הדגימות PSi נחרטו טרי תנור צינור ב 800 ° C עבור h 1 באוויר פתוח (חימום קצב: 25 ° C/דקה, קירור טבעית) כדי ליצור לפיגום2 (PSiO2) SiO נקבובי.
  10. ספין-מעיל PSiO2 דגימות עם photoresist עבה חיובי ב- 4,000 סל ד עבור 1 דקות; ואז לאפות את הדגימות מצופה ב 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (חימום שיעור: 5 ° C/דקה, קירור טבעית).
  11. חותכים לקוביות את הדגימות2 PSiO לתוך דגימות 8 מ"מ × 8 מ"מ באמצעות מסור dicing.
  12. כדי להסיר את photoresist, להשרות את הדגימות קוביות אצטון עבור 3 h; לאחר מכן יש לשטוף ביסודיות עם אתנול ויבש תחת זרם חנקן.

2. טעינת PSiO2 עם גורם הגדילה העצבי

  1. כדי להכין את גורם הגדילה העצבי טעינת פתרון, לפזר 20 µg של מאתר β-גורם הגדילה העצבי ב 400 µL של 1:1 (v/v) פתרון של 0.01 M באגירה פוספט תמיסת (PBS) ו- ddH2O.
  2. הוסף µL 52 של הפתרון העמסה על המדגם2 PSiO ' תקופת דגירה של 2 h ב- RT בקערה רצ'ט.
    הערה: לשמור על לחות גבוהה לתוך המנה כדי למנוע ייבוש של הפתרון בתקופת הדגירה.
  3. לאסוף את הפתרון בראש המדגם על כימות עוקבות של גורם הגדילה העצבי תוכן בתוך המנשא2 PSiO.
    הערה: גורם הגדילה העצבי טעינה אל PSiO2 יש לבצעו מיד לפני השימוש המיועד, הפרוטוקול לא ניתן להשהות כאן בשל הסיכון של ייבוש דנטורציה של החלבון.

3. כימות של גורם הגדילה העצבי הטעינה מאת אליסה גורם הגדילה העצבי

  1. כדי להכין את הצלחת אליסה, להוסיף 100 µL של 0.5 נוגדן לכידת µg/mL (ארנב anti-hβ-גורם הגדילה העצבי) אחד, לאטום את הצלחת, דגירה ללון ב- RT.
  2. האחות הבארות להסיר נוזלים. ולשטוף את הצלחת ארבע פעמים באמצעות µL 300 שטיפת מאגר (0.05% Tween-20 ב- PBS) לכל טוב; לאחר בכביסה האחרונה היפוך את הצלחת להסיר את מאגר שיורית, כתם על מגבת נייר.
  3. להוסיף 300 µL בלוק מאגר (1% שור אלבומין (BSA) ב- PBS) מכל קידוח, תקופת דגירה של פחות 1 h RT. ואז האחות, לשטוף את הצלחת ארבע פעמים כפי שמתואר בשלב 3.2.
  4. כדי להכין עקומת כיול, לדלל גורם הגדילה העצבי טעינת פתרון (ראה שלב 2.1) ב diluent (0.05% Tween-20, BSA 0.1% ב- PBS) כדי 1 ng/mL. לאחר מכן לבצע דילולים טורי 2-fold מ 1 ננוגרם למ"ל לאפס כדי להשיג את הדגימות עקומת כיול.
  5. כדי להכין את הדגימות, לדלל הפתרון גורם הגדילה העצבי טעינה (מתוך שלב 2.1) והפתרון שנאספו לאחר טעינה (מתוך שלב 2.3) כוללות diluent ו- 1:10,000 בהתאמה, כדי להגיע בטווח ריכוזים של ערכת דיאגנוסטיקה בשימוש (16-1, 000 pg/mL).
  6. להוסיף 100 µL של דגימות מדולל, עקומת כיול לכל טוב שהפקידים ודוגמאות דגירה-RT עבור 2 h; ואז האחות, לשטוף את הצלחת ארבע פעמים כפי שמתואר בשלב 3.2.
  7. להוסיף 100 µL של µg/mL 1 זיהוי נוגדנים (biotinylated הארנב anti-hβ-גורם הגדילה העצבי) מכל קידוח, דגירה-RT כבר שעתיים. ואז האחות, לשטוף את הצלחת ארבע פעמים כפי שמתואר בשלב 3.2.
  8. לדלל אבידין-חזרת Peroxidase (HRP) 1:2,000, diluent, להוסיף µL 100 לכל טוב, תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT. כעת מחוק לגמרי, לשטוף את הצלחת ארבע פעמים כפי שמתואר בשלב 3.2.
  9. להוסיף 100 µL של פתרון המצע מכל קידוח, דגירה 25 דקות ב RT לפיתוח צבע. למדוד את ספיגת-405 ננומטר עם אורך גל תיקון שוכן בגובה 650 nm באמצעות קורא microplate.
  10. לקבוע ריכוז גורם הגדילה העצבי הפתרון הטעינה והן הפתרון טעינה לאחר שנאספו בהתבסס על עקומת כיול.
  11. כדי לחשב את המסה גורם הגדילה העצבי טעון בתוך מנשא2 PSiO, להחסיר המיסה גורם הגדילה העצבי הפתרון טעינה לאחר שנאספו מן המסה גורם הגדילה העצבי בטעינת פתרון. גורם הגדילה העצבי הטעינה היעילות מחושבת על-ידי המשוואה הבאה:
    Equation

4. במבחנה גורם הגדילה העצבי שחרור PSiO2

  1. דגירה של נשאים2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי 2 מ של PBS 0.01 M המכיל 1% (w/v) BSA ל- 0.02% (w/v) אזיד הנתרן ב 37 מעלות צלזיוס, תחת מסלולית עצבנות של 100 סל"ד.
  2. כל יומיים לאסוף את הפתרון ולהחליף אותו עם 2 מ של PBS טריים. להקפיא את הדגימות שנאספו שחרור של חנקן נוזלי ולאחסן ב-20 ° C עבור ניתוחים נוספים.
  3. השתמש וזמינותו גורם הגדילה העצבי אליסה זמינים מסחרית כדי לכמת גורם הגדילה העצבי תוכן הדגימות שחרור כמתואר בצעדים 3.1-3.9.
    הערה: בעת הכנת הדגימות שחרור על אליסה כימות, דילולים שונים צריכה להתבצע עבור נקודות זמן שונות לאורך תקופת השחרור (קרי, לזמן קודם נקודות צריך להיות מדולל יותר נקודות זמן מאוחר יותר). יתר על כן, עבור כל דגימה שחרור, לפחות שני דילולים שונים צריך לבצע, לכמת כדי להבטיח להגיע בטווח ריכוזים של ערכת דיאגנוסטיקה.
  4. לקבוע ריכוז גורם הגדילה העצבי הדגימות שחרור בהתבסס על עקומת כיול, מגרש גרף של שחרור גורם הגדילה העצבי המצטברת לאורך זמן.

5. כימות של במבחנה סי בליה ע י Inductively בשילוב פלזמה אטומי ספקטרוסקופית פליטה (ICP-AES)

  1. למהול 1 מ"ל של שחרור דגימות 1:10 במאגר שחרור (PBS 0.01 M המכיל 1% (w/v) BSA אזיד הנתרן 0.02% (w/v)) עבור אמצעי אחסון סך של 10 מ"ל.
  2. לפקח על פסגות פליטה האטום Si ב nm 212.4, 251.6, 288.2 על הדגימות מדולל.
  3. לקבוע ריכוז סי הדגימות מבוסס על עקומת כיול.
  4. כדי ליצור את הפרופיל השפלה סי, מבטאים סי תוכן בכל נקודה בזמן כאחוז של התוכן סי הכולל של נשאים (קרי, התוכן סי המצטברת לאורך תקופת השחרור).
    הערה: כדי להבטיח כימות מדויק של התוכן סי הכולל של נשאים, הם דוגמאות שחרור שנדגמו 1 חודש הבא מובילים השחרור ללמוד וניתח לריכוז סי באמצעות ICP-AES. סיכום התוכן סי המצטברת לאורך תקופת השחרור ואת התוכן סי הדגימות שלאחר שחרור מספק את 100% Si תוכן.

6. תא הכדאיות וצמיחה בנוכחות נושאות2 Psio טעון גורם הגדילה העצבי

  1. תרבית תאים עכברוש פאוכרומוציטומה (PC12)
    1. להכין את מדיום הגידול בסיסי על-ידי הוספת 10% הסוס סרום (HS), 5% סרום שור עוברית (FBS), 1%-גלוטמין, סטרפטומיצין פניצילין 1% ו- 0.2% שהוא גוסס לבינונית רוזל פארק מכון רפואי (RPMI).
    2. להכין בידול בינוני על-ידי הוספת 1% HS, 1%-גלוטמין, סטרפטומיצין פניצילין 1% ו- 0.2% שהוא גוסס לבינונית RPMI.
    3. לגדול תא ההשעיה (106 תאים) בבקבוקון תרבות2 75 ס מ עם 10 מ"ל של מדיום הגידול בסיסי במשך 8 ימים; כל יומיים להוסיף 10 מ של מדיום הגידול בסיסי הבקבוקון.
    4. כדי ליצור תרבית תאים PC12 הבדיל, להעביר התליה תא שפופרת צנטרפוגה; centrifuge תאים עבור 8 דקות ב 200 x גרם ו- RT. להשליך את תגובת שיקוע.
    5. להשעות את התאים 5 מ של מדיום הגידול בסיסי טריים, centrifuge מחדש את התאים עבור 5 דקות ב 200 x גרם ו- RT; למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של מדיום הגידול בסיסי.
    6. כדי להפריד תא אשכולות, וארוקן את התאים עשר פעמים באמצעות מזרק 23 גרם.
    7. לספור את התאים באמצעות מונה תא hemocytometer, זרע 104 תאים/cm2 עובד שטח על קולגן סוג l מצופה לוחות בנוכחות בידול בינוני.
    8. לאחר 24 שעות, להוסיף טריים מאתר β-גורם הגדילה העצבי (50 ng/mL) או נושא טעון גורם הגדילה העצבי PSiO2 לכל צלחת.
      הערה: ריכוז גבוה גורם הגדילה העצבי (> 50 ng/mL) מחזיקים את ההשפעה המדויק כמו ריכוז שצוין.
    9. לחדש את המדיום בידול כל יומיים.
    10. להערכת הכדאיות תא, להוסיף 10% (v/v) של הפתרון מחוון הכדאיות (מבוסס על resazurin) בנקודות זמן נציג ולאחר תקופת דגירה של 5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס; למדוד את ספיגת 490 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים.
  2. עכברים הגבי שורש תרבית תאים הגרעינים (DRG)
    1. כדי לבודד DRGs של שני עכברים C57bl בת שבוע 7, ראשית תרסס העכברים עם 70% אתנול, בחתך כדי להסיר את העור.
    2. לחתוך את הבסיס של הגולגולת ו שרירי דופן הבטן עד לחוט השדרה הוא חשוף.
    3. להסיר את עמוד השדרה על ידי ביצוע חתך ברמה של עצמות הירך ולנקות את הרקמות הסובבות.
    4. לחתוך את העמודה לתוך שלוש חתיכות; ואז חותכים כל חתיכה האמצע כדי ליצור שני חצאים אחפור בחוט השדרה.
    5. תחת התאום, לחלץ את כל הגרעינים DRG, לטבול אותם של האנק קר תמיסת מלח מאוזנת (HBSS).
    6. לנקות את רקמות החיבור שמסביב על ידי משתוקק את DRGs על צלחת פטרי ולהסיר בעדינות את קרומי המוח שיורית תחת התאום.
    7. מביצועם התאים DRG מאת המקננת בהם במשך 20 דקות ב- 1,000 U פפאין.
    8. Centrifuge את התאים עבור 4 דקות ב 400 x g. למחוק את תגובת שיקוע ולשמור בגדר התא.
    9. Resuspend בגדר בפתרון 10 מ"ג/מ"ל collagenase ו- 12 מ"ג/מ"ל dispase-II, תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C.
    10. Centrifuge התאים למשך 2 דקות ב x 400 גרם; למחוק את תגובת שיקוע ולשמור בגדר התא.
    11. Triturate בגדר תא ב 1 מ"ל של HBSS, גלוקוז 10 מ"מ, 5 מ"מ HEPES (pH 7.35) על ידי מעבר חוזרות באמצעות פיפטה מכווץ פסטר.
    12. בעדינות להוסיף את התאים dissociated בינוני L-15 המכיל 20% מבוסס-סיליקה בינוני colloidal להפרדה התא על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות; צנטריפוגה במשך 8 דקות ב x 1000 g. וארוקן את תגובת שיקוע ולשמור בגדר התא.
      הערה: המטרה של שלב זה היא להפריד בין ולטהר את תאים עצביים מפני פסולת עצב, תאי שוואן ו fibroblasts.
    13. Resuspend בגדר תא ב- mL 2 בינוני F-12; צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 1,000 x g; למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של F-12 בינונית.
    14. לספור את התאים ואת זרע 2 × 10 תאים4 -פולי-L-ליזין, laminin מצופה זכוכית התחתון 35 מ מ תרבות מנות, במדיום F-12 תרופתיים בתוספת 10% FBS.
      הערה: בתחילה, זרע תאי נפח קטן של בינוני (150-200 µL); בעקבות הדגירה 2 h ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף בינונית עבור אמצעי אחסון הסופי של 2 מ.
    15. בעדינות להוסיף את נושא2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי או טריים מאתר β-גורם הגדילה העצבי (50 ng/mL) לכל צלחת.
    16. לאחר יומיים, לתקן את התרבות התא על-ידי המקננת זה פתרון paraformaldehyde (PFA) 4% למשך 15 דקות ב RT; immunostain התרבות התא באמצעות של immunofluorescence נפוצות מכתים הליך31.
    17. תמונה של תרבית תאים עצביים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

7. תא בידול ניתוח

  1. PC12 תאים בידול אחוז בנוכחות נושאות2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי
    1. דגירה של נשאים2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי 2 מ של בידול, במדיום חממה humidified ב 37 מעלות צלזיוס המכילה 5% CO2.
    2. כל יומיים, לאסוף את הפתרון ולהחליף אותו עם 2 מיליליטר בינוני טריים. להקפיא את הדגימות שנאספו שחרור של חנקן נוזלי ולאחסן ב-20 ° C עבור ניתוחים נוספים.
    3. זרע תאים PC12 ב 12-ובכן מצופים קולגן הצלחות כמו הורה לו בסעיף 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. לאחר 24 שעות, להציג את הדגימות שחרור של נקודות זמן נציג (מתוך סעיף 5.1.2) לבארות שונים; שליטה וולס, הוסיפו טריים מאתר β-גורם הגדילה העצבי (50 ng/mL).
    5. לאחר 24 שעות, תמונה התאים באמצעות מיקרוסקופ אור.
    6. כדי לקבוע את אחוז תאים neurite מניבי, באופן ידני לספור תאים ייגמל neurites מבין המספר הכולל של תאים של תמונות (n = 5 מסגרות עבור כל טוב); מגרש גרף של אחוז תאים PC12 עם תוצר neurite לאורך זמן.
      הערה: תאים PC12 מובחן הופיעו כדי להיות מעוגל מבנה ללא neurites, ואילו תאים יכול להיות מזוהה על ידי המוצלח neurites (לפחות אחד שווה לקוטר סומה תא אורך מינימלי) או שינויים מורפולוגיים.
  2. ניתוח Morphometric של תאים PC12
    1. לניתוח עיבוד התמונה, לרכוש תמונות שלב של תאים בתרבית עד 3 ימים לאחר הטיפול עם גורם הגדילה העצבי (ריאגנט חינם או המוצר שחרור של נשאים2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי).
      הערה: בנקודות זמן מאוחר יותר (מעבר יום 5) התאים לפתח רשתות מורכבות מאוד, מניעת morphometric מדידות ברזולוציה תא בודד.
    2. להוריד את התמונה עיבוד התוכנית NeuronJ, ImageJ plug-in, המאפשרת neurite חצי אוטומטי מעקב ומדידת אורך.
    3. המר את קובץ תמונה 8 סיביות בתבנית, מדד פיקסלים מיקרומטר יחס באמצעות סרגל קנה מידה התמונה.
    4. קבע את קנה המידה באמצעות נתח | הפקודה קבע קנה מידה ולמדוד האורך של כל neurite.
    5. באופן ידני לספור מספר נקודות הסתעפות ואת המספר של neurites שמקורם סומא בכל תא.
      הערה: אורך neurite ממוצע 1 יום לאחר הטיפול גורם הגדילה העצבי הוא כ 30 מיקרומטר. המרחק נמדד neurite עשוי להיות לתפוצה רחבה.

Representative Results

סרטים PSi מחמצנים מיוצרים כמפורט בפרוטוקול. כשהפחד סי הוא נתון איכול אלקטרוכימי 20 s-250 mA/cm2 (איור 1ai), ואחריו חמצון תרמי ב 800 מעלות צלזיוס (איור 1aii) כדי לייצר לפיגום2 PSiO. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה (HR-SEM) תמונות של הסרט2 PSiO וכתוצאה מכך מוצגות באיור איור 1bג Micrograph להציג העליונה של הסרט (איור 1b) מתארת את טבעה מוצרים נקבובי מאוד עם נקבוביות של 40 ננומטר בקוטר. Micrograph חתך הרוחב של סרט cleaved (איור 1 c) מגלה עובי השכבה הנקבובי של 2.9 מיקרומטר, המאופיינת מקשרת נקבוביות גלילי.

PSiO2 הסרטים נטענים עם גורם הגדילה העצבי טעינת פתרון כמופיע באיור 1וואייי. גורם הגדילה העצבי ההעמסה הוא לכמת באמצעות גורם הגדילה העצבי אליסה על ידי מדידת ריכוז גורם הגדילה העצבי בפתרון טעינה לפני ואחרי הדגירה עם הסרטים2 PSiO. המסה הממוצעת של גורם הגדילה העצבי טעון לכל סרט2 PSiO נקבע כ 2.8 µg ± 0.2, המתאים יעילות גבוהה הטעינה של 90% (w/w) (נתונים לא מוצג31). כדי לבסס את הפרופיל שחרור גורם הגדילה העצבי של נשאים2 PSiO, הסרטים טעון מודגרת ב- PBS ב 37 מעלות צלזיוס, aliquots כל יומיים הם שנדגם לצורך כימות של ריכוז חלבון שפורסמו באמצעות גורם הגדילה העצבי אליסה. בנוסף, התוכן סי הדגימות שחרור הוא לכמת באמצעות ICP-AES, קינטיקה סחף סי של נשאים2 PSiO היא הוקמה. איור 2 מציג שחרורו גורם הגדילה העצבי, הפרופילים השפלה סי המקביל של נשאים נקבובי. פרסום מתמשכת של גורם הגדילה העצבי, ללא אפקט של פרץ, מושגת לתקופה של חודש. גורם הגדילה העצבי שחרור בשבוע הראשון הוא מהיר יותר (השיפוע = 0.442) לעומת שחרור ימים מאוחר יותר לאורך תקופת השחרור (שיפוע 0.043) הרבה יותר איטית. יצוין, כי לאורך כל תקופת השחרור חודש שלם, כמות גורם הגדילה העצבי שוחרר מספיקה עבור גרימת עמוקה התמיינות של תאים PC12, כמו שיתבאר מאוחר יותר. המצטברת גורם הגדילה העצבי שוחרר הוא נמצא כדי להיות במתאם טוב (R2 = 0.971) עם סי הנותרים תוכן, כפי שמוצג על שיבוץ של איור 2.

בשלב הבא, bioactivity של נשאים2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי מאופיין במבחנה, תאים PC12 ו- DRG נוירונים משמשים כמודלים בידול עצביים תוצר. תאים PC12, חלופה מועדפת DRG הנוירונים הם נזרע כמפורט בפרוטוקול. ראשית, תא הכדאיות בנוכחות נשאי2 PSiO נבדק ע י המקננת על תאים עם נקי (לא טעון) או שנטענו גורם הגדילה העצבי PSiO2; לוחות בקרה ותאים שטופלו PSiO מסודר2 הם השלימו עם גורם הגדילה העצבי חינם כל יומיים. אין cytotoxicity הוא ציין עם חשיפה של התאים כדי ומסודר או שנטענו גורם הגדילה העצבי PSiO2 נשאים (איור 3 א), הוכחת כי PSiO2 הוא מסתיימים עם קו תא זה. איור 3b מראה micrographs נציג HR-SEM של תאים PC12 שטופלו נושאות2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי. התאים שנצפו תמצית האופיינית neurites וטופס בענף רשתות עצביים. תוצאות דומות מתקבלים כאשר זריעה הפומבית DRG תאים עצביים בנוכחות נשאי2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי. תמונות קונאפוקלית של immunostained DRG תאים בתרבית עם נשאים2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי (איור 3e) להראות neurite נרחב החניכה, התארכות, הדומה הפקד חיובי (כלומר, נוירונים בתוספת חינם גורם הגדילה העצבי, ראה איור 3d), ואילו השלילי לשלוט (כלומר, לא מטופל הנוירונים, ראה איור 3 c), תערוכות גבול המסכן של תוצר neurite.

כדי להעריך את אחוז התמיינות תאים PC12 בנוכחות גורם הגדילה העצבי שוחררו נושאות2 PSiO, בידול הוא לכמת על ידי ספירת התאים עם תוצר neurite מתוך האוכלוסייה cell סך הכל. איור 4 מסכם את התוצאות מבחינת אחוז תאים בנקודות זמן שונות על פני תקופה בן 26 יום. בידול משמעותי ערכי האחוזים הם השיגו לאורך כל משך הזמן למדה. ראוי לציין, לאחר 26 ימים, גורם הגדילה העצבי שפורסמו יש המושרה הבידול של מעל 50%, אחוז בידול אשר הוא משמעותי גבוה יותר לעומת מחקרים קודמים עם נשאים מבוסס פולימר16. תוצאות אלו מצביעות על גורם הגדילה העצבי מילכוד בתוך המארח נקבובי לשמר את הפעילות הביולוגית של החלבון להשראת בידול עמוקה לתקופה של חודש ~ 1.

לבחון יותר את השפעת גורם הגדילה העצבי-PSiO2 נושאות על בידול עצביים, שלושה פרמטרים מורפולוגי האופיינית של התאים PC12 הבדיל נמדדים ברמת תא בודד: (i) מספר neurites חילוץ מ- (סומה ii neurites') סה כ אורך וכן (iii) מספר נקודות הסתעפות. התאים נחשבים עם גורם הגדילה העצבי טעונים PSiO2 ספקים או עם הממשל חוזרות של חינם גורם הגדילה העצבי (כל 2 ימים), פקד. איור 5a -c מציג את הניתוח morphometric של האוכלוסייה תא בימים 1 ו- 3. התאים PC12 שטופלו PSiO טעון גורם הגדילה העצבי2 מציגים ערכים morphometric אשר דומה לטיפול פקד עבור כל שלושת הפרמטרים שנבדקו. לאחר 3 ימים, הערכים של כל הפרמטרים מורפולוגי שנצפו לגדול באותו קצב הן נושאות2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי והן הטיפול שליטה של הממשל חוזרות של גורם הגדילה העצבי חינם.

Figure 1
איור 1: ייצור של PSiO2 סרטים. (א) ייצור ערכה של נשאים2 PSiO: (i) סיליקון וופל הוא נתון איכול אלקטרוכימי 20 s-mA/cm 2502, ואחריו חמצון תרמי (ii) ב 800 ° C כדי לייצר לפיגום2 PSiO, ו- (iii) גורם הגדילה העצבי טעינה על-ידי ספיחה פיסיקלית (שרטוט לא נמשכים לקנה המידה). (בג) Micrographs אלקטרון להציג העליונה ואת חתך רוחב של סרט2 PSiO אופיינית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: שחרור גורם הגדילה העצבי ופרופילים סי שחיקה של PSiO גורם הגדילה העצבי-טעון2 ספקים. היקף השפלה של נשאים2 PSiO מוצג השבר של התוכן סי הנותרים בכל נקודה בזמן מתוך התוכן סי הכולל של הסרט נקבובי. שיבוץ מציגה את הקשר בין המצטברת גורם הגדילה העצבי שוחרר לבין שנותרו סי תוכן. שגיאה ברים מייצגים SD, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: התא הכדאיות צמיחה בנוכחות PSiO טעון גורם הגדילה העצבי2 ספקים. (א) במבחנה cytotoxicity אפיון. הכדאיות של תאים PC12 נמדד בימים 1, 3 ו 7 בעקבות החשיפה שלהם מסודר (לא טעון) PSiO2 ספקים, PSiO טעון גורם הגדילה העצבי2 נשאים או גורם הגדילה העצבי חינם (50 ng/mL כל יומיים, בקרת לוחות). (b) אלקטרון micrographs PC12 תאים בתרבית עם גורם הגדילה העצבי טעונים PSiO2 ספקים עבור 9 ימים. פאנל שמאלי: זום-אין, המתארים neurite תוצר של סומא התא; לוח נכון: זום-אאוט, המציינת את הרשת העצבית מורכב נוצר. (ג-ה) מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות של immunostained DRG עצביים תא תרבות (2 ימים לאחר זריעה): (ג) לא מטופל תאים; (ד) תאים בתוספת חינם גורם הגדילה העצבי (50 ng/mL); (e) גורם הגדילה העצבי-PSiO2 ספקים. צביעת immunofluorescent של neurofilament H מאפשר הדמיה של התא וראשה של neurites outgrowing. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: PC12 תאים בידול ערכי האחוזים בתגובה לחשיפה גורם הגדילה העצבי שוחררו PSiO טעון גורם הגדילה העצבי נושאות2 בנקודות זמן נציג. בידול אחוז מבוטא כמספר של תאים עם תוצר neurite מתוך האוכלוסייה בתא סכום. בקרת הטיפול מתייחס לתאים בתוספת חינם גורם הגדילה העצבי (50 ng/mL). תמונות מיקרוסקופ אור נציג של התאים בנקודות זמן שונות מתוארים לאורך ציר ה-x; סרגל קנה מידה = מיקרומטר 25 עבור micrographs של ימים 2, 8, 14, 26 ו- 50 מיקרומטר עבור פקד micrograph. שגיאה ברים מייצגים SD, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ניתוח Morphometric של תאים PC12. שלושה פרמטרים מורפולוגי תאים PC12 נמדדים, ברמה תא בודד, ביום 1 ו-3 עקב חשיפה PSiO טעון גורם הגדילה העצבי2 נשאים או חוזרות מינהל חינם גורם הגדילה העצבי כל יומיים (שליטה); אורך (b) מספר () neurites' סה כ neurites חילוץ מתא סומה ו- (ג) מספר נקודות הסתעפות. שגיאה ברים מייצגים SD, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

Nanostructured מתכלה PSiO2 סרטים מפוברק, מועסקים ספקים עבור גורם הגדילה העצבי, המאפשר השקתו רציפה וממושכת, תוך שמירה על פעילותו הביולוגית. הפוטנציאל של PSiO2 לשרת כמו מערכת משלוח עבור גורם הגדילה העצבי הוא הפגין במבחנה על ידי הפגנת יכולתם לשחרר מינון גורם הגדילה העצבי זירוז בידול עצביים ולקדם המוצלח PC12 והתאים DRG נוירונים. הסרטים מהונדסים יכול לשמש כמאגר לטווח ארוך של גורם הגדילה העצבי עבור טיפול בעתיד בתוך vivo.

מאפיינים מבניים של הסרטים PSi מפוברק היו המותאמים במיוחד עבור גורם הגדילה העצבי המטען; צפיפות הזרם של תהליך אלקטרוכימי איכול הותאם להשיג גודל הנקבוביות של 40 ננומטר בקלות להכיל את גורם הגדילה העצבי, חלבון molecular weight של 26.5 kDa32 , קוטר האופיינית של ~ 4 nm33, בתוך המטריצה נקבובי. יתר על כן, חמצון תרמי של לגרדום נקבובי בוצע כדי לאפשר ספיחה פיסיקלית של גורם הגדילה העצבי על ידי משיכה אלקטרוסטטית של החלבון הטעון חיובית אל פני השטח PSi מחמצנים טעונים שלילית. הכימיה משטח של PSi מפעילה השפעה גדולה על היעילות הטעינה, ניתן לכוונן בקלות על מנת לשלוט טוב יותר את האינטראקציות בין המטען המטריקס נקבובי. אינטראקציות אלה לאחר מכן להכתיב את המבנה של מולקולות חלבון הספוחה ו שלהם35,34,bioactivity36. לסיכום, המערכת כוונן להשיג טעינה אופטימלית של גורם הגדילה העצבי על ידי בחירה מדוקדקת את הגודל המתאים נקבובית, המשטח האידיאלי טעינת הממס ואת השפעת וכתוצאה מכך כשואל הפרמטרים שהוזכרו ההעמסה חלבון יעילות. לכן, כל שינוי בפרמטרים פבריקציה נוספת (למשל, צפיפות זרם, תחריט זמן, סוג, ריכוז של dopant או אלקטרוליט), פלטות אלייזה או טעינת פתרון קומפוזיציה יכול להשפיע על יעילות ההעמסה ועל אתריים של חלבון טעון.

קצב שחרור תוכן מנה של מהמחשב המארח2PSi orPSiO בדרך כלל מוכתב על ידי שילוב של שני מנגנונים בו זמנית, out-דיפוזיה של מולקולות המטען והשפלות של לגרדום סי37. שחיקה של קצב התפרקות עוקבות מושפעים על ידי ההשרשה באתר, פתולוגיה שלה ועל המחלה המדינה28,38,39. היא הוקמה בשנת עבודה קודמות כי אם קצב שחרור שונים נדרש עבור יישום טיפולית מסוימת, פרופיל לשחרר אפשרות לשנותם ולאחר ממושך על ידי שינוי את הכימיה. משטח של PSi משטח38,40, 41. שינויים כימיים שונים, כגון חמצון תרמי, פחמון תרמי וטכניקות hydrosilylation, הוכחו לייצב את השטח PSi ומשפיעים שלה הסוגר ואת המטען שחרור35,42 ,43,44,45. יתר על כן, יביא הטעינה של גורם הגדילה העצבי לתוך נושאות על ידי קוולנטיות מצורף של מולקולות חלבון לגרדום סי בנתיבים שונים של פלטות אלייזה במהדורה ממושך יותר כי המנה הוא שוחרר רק כאשר. קשרים הדדיים שבורים או תמיכה סי מטריקס יורד21.

יתר על כן, בעקבות תהליך ייצור שלו, PSi שיכול להתבצע לתוך תצורות שונות מלבד סרטים רזה, כגון microparticles46, חלקיקים47 או ממברנות שעמד חופשי26, אשר יכול גם להיות מועסק נשאים עבור גורם הגדילה העצבי וצרכים לפגוש יישום מסוים.

כדי להיות הרלוונטית קלינית, התוכן גורם הגדילה העצבי של נשאים2 PSiO צריך להגיע לטווח של מינונים טיפולית. בהשיטה המתוארת בפרוטוקול, נושאות2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי יוכנסו נפח עקבית של 2 מ של תא מדיה או מאגר PBS, וכך הריכוז של הפתרון הטעינה, המסה גורם הגדילה העצבי בהתאמה טעון הותאמו להניב שוחרר ריכוז גורם הגדילה העצבי שהוא רלוונטי עבור מערכת שנבדקו במבחנה . כאשר בשיטה זו עבור מערכות שונות, כגון סביבות vivo לשעבר או ויוו , ריכוז גורם הגדילה העצבי טעינת פתרון צריך להיות גדל והוא מותאם על פי המינון הדרוש. לחלופין, ניתן לקבל תוכן גורם הגדילה העצבי גבוה יותר על ידי היכרות עם ספקים מרובים לכל אזור נבדק או באמצעות אזורים גדולים של PSiO2 דוגמאות.

יתר על כן, יש לציין כי מאוחר יותר נקודות זמן לאורך תקופת השחרור, ריכוז גורם הגדילה העצבי שפורסמו הם נמוכים בהרבה מאשר בנקודות זמן מוקדם יותר. העובדה כי שטף גורם הגדילה העצבי אינה קבועה לאורך זמן חייב להילקח בחשבון בעת תכנון המערכת בהתאם לצרכי יישום.

משלוח גורם הגדילה העצבי רבים פותחו ומערכות שדווחו בספרות, רובם נמצאים במערכות מבוססות-פולימר, הכוללת של פולימר סינטטי או טבעי conjugates10,11,12,15 , 16 , 17. מערכות אלו הראו יעילות מתמשכת שחרור פרופילים, עם זאת, תקופת השחרור מורחבים על פני תקופה של מספר ימים עם אפקט משמעותי פרץ. חלק פלטפורמות משלוח אלה סובלים מגבלות קריטיים כגון אובדן של bioactivity על התהליך כימוס, המחייב שימוש שונה ייצוב סוכנים18,48, כמו גם מתוחכם ומורכב טכניקות ייצור16. אחד האתגרים הגדולים ביותר בעיצוב מערכות אספקה חלבונים הוא היכולת לשמר את bioactivity של המולקולות על מילכוד בתוך מערכת המוביל. חלבונים או פפטידים ניתן לטעון לתוך PSi/PSiO2 -RT או אפילו בטמפרטורות נמוכות מבלי להשתמש חזקה ממיסים אורגניים, אשר הם שני גורמים חשובים בעת טעינת אלה מולקולות רגיש. מחקרים קודמים הראו כי PSi/PSiO2 פלטות אלייזה ממלאת תפקיד מכריע צמצום אפשרי דנטורציה של חלבונים טעון35,36. לכן, PSi/PSiO2 הוא nanomaterial יתרון פיתוח ותחזוקת מערכות אספקה עבור גורמי גדילה באופן כללי גורם הגדילה העצבי בפרט.

העבודה הנוכחית מתמקדת ניצול בשיטה זו כמו גישה טיפולית חדשה עבור ניהול ישיר של גורם הגדילה העצבי לתוך מערכת העצבים לטיפול פוטנציאלי של מחלות ניווניות. יכול להיות קטנטנים נושאות2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי במוח העכברים, היעילות של הפלטפורמה כמו שתלים לטווח ארוך למדה ויוו. יתר על כן, שילוב זה מבטיח נשאים עם biolistics לא פולשנית49,50 עשוי לאפשר אחד לנהל החלקיקים2 PSiO טעון גורם הגדילה העצבי ברזולוציה מרחבית מאוד את אזור מקומי באמצעות רומן פנאומטיים האקדח נימי לטיפול בהפרעות ניווניות, שבו נדרשת ייתכן והתרופות האמריקני. יתר על כן, גורם הגדילה העצבי יכולים לכוון את הצמיחה עצביים ב באופן הדרגתי כימי51, הדומה האקסון הדרכה מולקולות. לפיכך, נושאות2 PSiO טעון יכול לשמש attractant נקודות חמות כדי גורם הגדילה העצבי, להפנות את הצמיחה, משלים אחרים52,לבימוי רמזים53. בנוסף, נושאות2PSiO התפורות במיוחד כדי לקיים המסירה של גורם הגדילה העצבי לפרק מורחב הרבה זמן של עד מספר חודשים על ידי כוונון נוסף של ננו-מבנה2 PSiO וכימיה פני השטח שלו.

Disclosures

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

MS ו- ES להכיר את שירותי ליבה ותמיכה מהמרכז משאית אני Lokey מדעי החיים, הנדסה, התמיכה הכלכלית של ראסל ברי לננוטכנולוגיה בטכניון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiesmann, C., De Vos, A. Nerve growth factor: structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, (5), 748-759 (2001).
  2. Dreyfus, C. F. Effects of nerve growth factor on cholinergic brain neurons. Trends in Pharmacological Sciences. 10, (4), 145-149 (1989).
  3. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 9, (5), 246-257 (1998).
  4. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Encapsulated cell biodelivery of nerve growth factor to the basal forebrain in patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 33, (1), 18-28 (2012).
  5. Eyjolfsdottir, H., et al. Targeted delivery of nerve growth factor to the cholinergic basal forebrain of Alzheimer's disease patients: application of a second-generation encapsulated cell biodelivery device. Alzheimer's Research & Therapy. 8, (1), 30 (2016).
  6. Tuszynski, M. H., et al. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Nature Medicine. 11, (5), 551-555 (2005).
  7. Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain barrier to neurotrophins. Brain Research. 788, (1), 87-94 (1998).
  8. Thorne, R. G., Frey, W. H. Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system. Clinical Pharmacokinetics. 40, (12), 907-946 (2001).
  9. Tria, M. A., Fusco, M., Vantini, G., Mariot, R. Pharmacokinetics of nerve growth factor (NGF) following different routes of administration to adult rats. Experimental Neurology. 127, (2), 178-183 (1994).
  10. Bhang, S. H., et al. The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture. Biomaterials. 30, (1), 126-132 (2009).
  11. Camarata, P. J., Suryanarayanan, R., Turner, D. A., Parker, R. G., Ebner, T. J. Sustained release of nerve growth factor from biodegradable polymer microspheres. Neurosurgery. 30, (3), 313-319 (1992).
  12. Cooper, A., Bhattarai, N., Zhang, M. Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve tissue regeneration. Carbohydrate Polymers. 85, (1), 149-156 (2011).
  13. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 37 (2016).
  14. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7, (3), 1058-1066 (2015).
  15. Sridhar, R., et al. Electrosprayed nanoparticles and electrospun nanofibers based on natural materials: applications in tissue regeneration, drug delivery and pharmaceuticals. Chemical Society Reviews. 44, (3), 790-814 (2015).
  16. Valmikinathan, C. M., Defroda, S., Yu, X. Polycaprolactone and bovine serum albumin based nanofibers for controlled release of nerve growth factor. Biomacromolecules. 10, (5), 1084-1089 (2009).
  17. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, (17), 3765-3772 (2002).
  18. Cao, X., Shoichet, M. S. Delivering neuroactive molecules from biodegradable microspheres for application in central nervous system disorders. Biomaterials. 20, (4), 329-339 (1999).
  19. Saltzman, W. M., Mak, M. W., Mahoney, M. J., Duenas, E. T., Cleland, J. L. Intracranial Delivery of Recombinant Nerve Growth Factor: Release Kinetics and Protein Distribution for Three Delivery Systems. Pharmaceutical Research. 16, (2), 232-240 (1999).
  20. Zhu, G., Mallery, S. R., Schwendeman, S. P. Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly (lactide- co-glycolide). Nature Biotechnology. 18, 52 (2000).
  21. Anglin, E. J., Cheng, L., Freeman, W. R., Sailor, M. J. Porous silicon in drug delivery devices and materials. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (11), 1266-1277 (2008).
  22. Canham, L. T., et al. Derivatized mesoporous silicon with dramatically improved stability in simulated human blood plasma. Advanced Materials. 11, (18), 1505-1507 (1999).
  23. Chen, F., et al. Organosilica Nanoparticles with an Intrinsic Secondary Amine: An Efficient and Reusable Adsorbent for Dyes. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (18), 15566-15576 (2017).
  24. Godin, B., et al. Tailoring the degradation kinetics of mesoporous silicon structures through PEGylation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 94A. 4, (4), 1236-1243 (2010).
  25. Kempen, P. J., et al. Theranostic Mesoporous Silica Nanoparticles Biodegrade after Pro-Survival Drug Delivery and Ultrasound/Magnetic Resonance Imaging of Stem Cells. Theranostics. 5, (6), 631-642 (2015).
  26. Low, S. P., Voelcker, N. H., Canham, L. T., Williams, K. A. The biocompatibility of porous silicon in tissues of the eye. Biomaterials. 30, (15), 2873-2880 (2009).
  27. Salonen, J., Kaukonen, A. M., Hirvonen, J., Lehto, V. -P. Mesoporous silicon in drug delivery applications. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, (2), 632-653 (2008).
  28. Tzur-Balter, A., Shatsberg, Z., Beckerman, M., Segal, E., Artzi, N. Mechanism of erosion of nanostructured porous silicon drug carriers in neoplastic tissues. Nature Communications. 6, (2015).
  29. Salonen, J., Lehto, V. -P. Fabrication and chemical surface modification of mesoporous silicon for biomedical applications. Chemical Engineering Journal. 137, (1), 162-172 (2008).
  30. Tzur-Balter, A., Massad-Ivanir, N., Segal, E. Surface Engineered Porous Silicon-based Nanostructures for Cancer Therapy. MRS Proceedings. 1416, (2012).
  31. Zilony, N., et al. Prolonged controlled delivery of nerve growth factor using porous silicon nanostructures. Journal of Controlled Release. 257, 51-59 (2017).
  32. Young, M., Saide, J. D., Murphy, R. A., Arnason, B. G. Molecular size of nerve growth factor in dilute solution. Journal of Biological Chemistry. 251, (2), 459-464 (1976).
  33. Erickson, H. P. Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by. Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 11, (1), 32 (2009).
  34. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Thermal oxidation for controlling protein interactions with porous silicon. Langmuir. 26, (17), 14316-14322 (2010).
  35. McInnes, S. J., et al. Surface engineering of porous silicon to optimise therapeutic antibody loading and release. Journal of Materials Chemistry B. 3, (20), 4123-4133 (2015).
  36. Prestidge, C. A., et al. Loading and release of a model protein from porous silicon powders. Physica Status Solidi (A. 204, (10), 3361-3366 (2007).
  37. Tzur-Balter, A., Young, J. M., Bonanno-Young, L. M., Segal, E. Mathematical modeling of drug release from nanostructured porous Si: combining carrier erosion and hindered drug diffusion for predicting release kinetics. Acta Biomaterialia. 9, (9), 8346-8353 (2013).
  38. Nieto, A., et al. Surface Engineering of Porous Silicon Microparticles for Intravitreal Sustained Delivery of Rapamycin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (2), 1070-1080 (2015).
  39. Warther, D., et al. Porous silicon based intravitreal platform for dual-drug loading and controlled release towards synergistic therapy. Drug Delivery. 25, (1), 1537-1545 (2018).
  40. Li, W., et al. Tailoring Porous Silicon for Biomedical Applications: From Drug Delivery to Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 30, (24), 1703740 (2018).
  41. Yazdi, I. K., et al. Physicochemical properties affect the synthesis, controlled delivery, degradation and pharmacokinetics of inorganic nanoporous materials. Nanomedicine. 10, (19), 3057-3075 (2015).
  42. Fry, N. L., Boss, G. R., Sailor, M. J. Oxidation-Induced Trapping of Drugs in Porous Silicon Microparticles. Chemistry of Materials. 26, (8), 2758-2764 (2014).
  43. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Surface chemistry of porous silicon and implications for drug encapsulation and delivery applications. Advances in Colloid and Interface Science. 175, 25-38 (2012).
  44. Salonen, J., Mäkilä, E. Thermally Carbonized Porous Silicon and Its Recent Applications. Advanced Materials. 30, (24), (2018).
  45. Wang, M., et al. Influence of Surface Chemistry on the Release of an Antibacterial Drug from Nanostructured Porous Silicon. Langmuir. 31, (22), 6179-6185 (2015).
  46. Salonen, J., et al. Mesoporous silicon microparticles for oral drug delivery: loading and release of five model drugs. Journal of Controlled Release. 108, (2), 362-374 (2005).
  47. Park, J. -H., et al. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nature Materials. 8, (4), 331-336 (2009).
  48. Johnson, P. J., Skornia, S. L., Stabenfeldt, S. E., Willits, R. K. Maintaining bioactivity of NGF for controlled release from PLGA using PEG. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 86, (2), 420-427 (2008).
  49. Shefi, O., et al. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, (23), 6119-6123 (2006).
  50. Zilony, N., Tzur-Balter, A., Segal, E., Shefi, O. Bombarding Cancer: Biolistic Delivery of therapeutics using Porous Si Carriers. Scientific Reports. 3, 2499 (2013).
  51. Zuidema, J. M., Provenza, C., Caliendo, T., Dutz, S., Gilbert, R. J. Magnetic NGF-Releasing PLLA/Iron Oxide Nanoparticles Direct Extending Neurites and Preferentially Guide Neurites along Aligned Electrospun Microfibers. ACS Chemical Neuroscience. 6, (11), 1781-1788 (2015).
  52. Baranes, K., Moshe, H., Alon, N., Schwartz, S., Shefi, O. Neuronal Growth on l- and d-Cysteine Self-Assembled Monolayers Reveals Neuronal Chiral Sensitivity. ACS Chemical Neuroscience. 5, (5), 370-376 (2014).
  53. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (15), 1700267 (2017).
עיצוב הסיליקון הנקבובי סרטים כמו נשאים של גורם הגדילה העצבי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter