Her presenterer vi en protokoll å design og dikte nanostructured porøse silisium (PSi) filmer som nedbrytbart bærer for nerve vekst faktor (NGF). Neuronal differensiering og utvekst av PC12 celler og mus dorsal root ganglion (DRG) neurons kjennetegnes ved behandling med NGF lastet PSi bærere.
Til tross for det store potensialet av NGF for behandling av nevrodegenerative sykdommer, terapeutiske administrasjonen representerer en betydelig utfordring som protein ikke krysse blod – hjerne barrieren, grunn av kjemiske egenskaper, og dermed krever langsiktige levering til hjernen har en biologisk effekt. Dette verket beskriver fabrikasjon av nanostructured PSi filmer som nedbrytbart bærere av NGF for vedvarende levering av denne sensitive protein. PSi bærere er spesielt tilpasset for å få høy lasting effekt og kontinuerlig utgivelsen av NGF for en periode på fire uker, mens bevare sin biologiske aktivitet. Atferden til NGF-PSi bærere som et NGF leveringssystem er undersøkt i vitro ved å undersøke deres evne til å indusere neuronal differensiering og utvekst av PC12 celler og dissosiert DRG neurons. Cellen levedyktighet i nærvær av pen og NGF lastet PSi bærere evalueres. Bioactivity av NGF fra PSi bærere sammenlignet med konvensjonelle behandling av repeterende gratis NGF administrasjoner. PC12 celledifferensiering er analysert og preget av måling av tre ulike morfologiske parametere av differensierte celler; (i) antall neurites trekke fra soma (ii) total neurites lengde og (iii) antall branching punkt. PC12-cellene behandles med NGF-PSi bærere viser en dyp differensiering gjennom utgivelsen perioden. Videre Vis DRG neuronal celler kultivert med NGF-PSi bærere en omfattende neurite innvielse, ligner på neurons behandlet med repeterende gratis NGF administrasjoner. De studerte tunable bærere viser langsiktige implantater for NGF utgivelse med terapeutiske muligheter for nevrodegenerative sykdommer.
NGF er viktig for utvikling og vedlikehold av neurons i perifere nervesystemet (PNS)1 og spiller en avgjørende rolle i overlevelse og basale forebrain cholinergic neurons i sentralnervesystemet (CNS)2. Dens høy farmakologiske potensial for behandling av sentrale nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers og Parkinsons, har blitt mye demonstrert, med kliniske studier i gang3,4,5, 6. Den største utfordringen i levering av NGF til CNS ligger i sin manglende evne til å krysse blod-hjernebarrieren (BBB), når systemisk administrert7. Videre NGF mottakelighet for rask enzymatisk degradering gjengir halveringstiden kort og grenser betydelig sin terapeutisk bruk8,9. Derfor er det et udekket utfordring å designe leveringssystemer som tillater en langvarig og kontrollert utgivelsen av NGF på en sikker måte. Ulike NGF leveringssystemer, inkludert polymer-baserte systemer har vært studert10,11,12,13,14,15, 16 , 17. utgivelsen profiler av disse systemene ble karakterisert av en distinkt første burst etterfulgt av en langsom kontinuerlig utgivelse, der i den siste fasen utgivelsen hastigheten var betydelig lav i forhold til den første burst11 ,18,19. Videre inaktivering av protein av de Sure nedbrytningsprodukter av polymerer (f.eks, poly(lactic-co-glycolic) acid) eller tap av NGF bioactivity under prosessen med innkapsling ble observert med denne systemer20.
Nanostructured PSi er preget av flere tiltalende egenskaper, inkludert høy areal, store porøse volum, biocompatibility og tunable nedbrytbarhet i kroppsvæsker, predestining det for en lovende stoffet levering plattform21, 22,23,24,25,26,27,28. Riktig valg av anodization vilkår kan enkelt justere PSi strukturelle egenskapene (f.eks, porøsitet og pore størrelse) for skreddersy stoff lasting og utgivelsen kinetics21,27. Videre tillate ulike praktisk kjemiske ruter endre overflaten av PSi, og ved at finjustere oppløsning frekvensen av Si stillaset under fysiologiske forhold og utgivelse priser av narkotika22,24, 29,30.
Dette arbeidet fokuserer på å designe en PSi-baserte levering system for langvarig kontrollert utgivelsen av NGF. Effekten av NGF-PSi operatører på neuronal differensiering og resultatet er undersøkt ved hjelp av PC12 celler og dissosiert DRG neurons. Vi viser at den lastet NGF har beholdt sin bioactivity ved å indusere neurite utvekst og dyp differensiering gjennom en 1-måned løslate periode innen en enkelt administrasjon.
Nedbrytbart nanostructured PSiO2 filmer er fabrikkert og ansatt som bærer for NGF, slik at for kontinuerlig og langvarig utgivelsen, samtidig som det beholder sin biologiske aktivitet. Potensialet av PSiO2 som et leveringssystem for NGF er vist i vitro ved å demonstrere sin evne til å gi tilstrekkelig NGF dose for å indusere neuronal differensiering og fremme utvekst av PC12 celler og DRG neurons. Foretatt filmene kan brukes som langsiktig reservoarer av NGF for behandling i vivo.
Strukturelle egenskapene for fabrikkerte PSi filmene var skreddersydd for NGF nyttelast; den nåværende tettheten av elektrokjemiske etsing ble justert for å få porestørrelse ca 40 nm som ville lett romme NGF, et protein med et molecular weight av 26.5 kDa32 og karakteristiske diameter ~ 4 nm33, innenfor porøse matrise. Videre ble termisk oksidasjon av porøse skafottet utført for å aktivere fysiske adsorpsjon av NGF av elektrostatisk attraksjon de positivt ladede protein negativt ladde oksidert PSi overflaten. Overflatekjemi av PSi har en stor effekt på lasting effekten og stilles enkelt inn for å bedre kontrollere samspillet mellom nyttelast og porøs matrix. Disse interaksjoner diktere senere strukturen i adsorbert protein molekyler og deres bioactivity34,35,36. Avslutningsvis ble systemet justert for å få optimal lasting av NGF med omhu velge riktig porestørrelse, overflate egenskaper og ideelt lasting løsemiddel og den resulterende effekten av parametere dikterer protein lasting effekt. Derfor noen endring i parameterne fabrikasjon (f.eks, nåværende tetthet, etsing tid, type og konsentrasjonen av dopant eller elektrolytt), overflatekjemi eller lasting løsning komposisjon kan påvirke lasting effekt og bioactivity av den lastet protein.
Utgivelsen frekvensen av en nyttelast fra PSi orPSiO2verten bestemmes vanligvis av en kombinasjon av to samtidige mekanismer, ut spredning av nyttelast molekyler og nedbrytning av Si stillaset37. Erosjon og påfølgende oppløsning rate påvirkes av implantasjon området, sin patologi og sykdom staten28,38,39. Den ble etablert i tidligere arbeid at hvis en annen utgivelse hastighet er nødvendig for en bestemt terapeutisk program, utgivelsen profilen kan endres og langvarig ved å endre overflatekjemi av PSi overflaten38,40, 41. Ulike kjemiske modifikasjoner, som termisk oksidasjon, termisk karbonisering og hydrosilylation teknikker, har vist seg å stabilisere PSi overflaten og påvirke sin fornedrelse og påfølgende nyttelast utgivelsen35,42 ,43,44,45. Videre lasting av NGF i bærere av kovalente vedlegg av protein molekyler til Si stillaset via ulike overflatekjemi ruter skal resultere i en mer langvarig fordi nyttelast gis bare ut når kovalente bindinger er ødelagt eller støtter Si matrix er degradert21.
Videre, etter sitt fabrikasjon prosessen, PSi kan bli gjengitt i forskjellige konfigurasjoner foruten tynne filmer, som microparticles46, nanopartikler47 eller frittstående membraner26, som kan også brukes som bærer for NGF og møte spesifikke behov.
For å være klinisk relevante, bør NGF innholdet i PSiO2 operatører komme spekter av terapeutiske doser. I metoden beskrevet i protokollen NGF lastet PSiO2 bærere innføres i en konsistent volum 2 ml av cellen media eller PBS buffer og dermed konsentrasjonen av lasting løsningen og respektive NGF massen lastet ble justert for å gi en lansert NGF konsentrasjon som er relevant for testet i vitro systemet. Når du bruker denne metoden for forskjellige systemer som ex vivo eller i vivo miljøer, bør konsentrasjonen av NGF lasting løsning økt og justert etter den nødvendige dosen. Høyere NGF innhold kan også fås ved å innføre flere operatører per testet område eller større områder av PSiO2 prøver.
Videre bør det bemerkes at i senere tid punkter langs utgivelsen perioden, utgitt NGF konsentrasjonen er mye lavere enn i tidligere tidspunkt. Det faktum at NGF fluks ikke er konstant over tid må tas i betraktning når du utformer systemet etter behov.
Mange NGF levering systemer er utviklet og rapportert i litteraturen, de fleste av dem er polymer-baserte systemer, som består av syntetiske eller polymer conjugates10,11,12,15 , 16 , 17. disse systemene har vist effektiv vedvarende release profiler, men utgivelsen perioden varte over flere dager med en betydelig utbrudd. Noen av disse levering plattformer lider av kritisk begrensninger som tap av bioactivity til innkapsling prosessen, krever bruk av ulike stabiliserende agenter18,48, samt sofistikerte og komplekse fabrikasjon teknikker16. En av de største utfordringene i å utforme leveringssystemer for proteiner er muligheten til å bevare bioactivity av molekyler på entrapment innenfor carrier systemet. Proteiner eller peptider kan lastes inn i PSi/PSiO2 på RT eller selv ved lavere temperaturer uten bruk av sterke, organiske løsningsmidler som er begge viktige faktorer når du legger disse sensitive biomolecules. Tidligere studier har vist at PSi/PSiO2 overflatekjemi spiller en avgjørende rolle i å minimere mulig denaturering av lastet proteiner35,36. Derfor er PSi/PSiO2 en gunstig nanomaterial for å utvikle leveringssystemer for vekst faktorer generelt og NGF spesielt.
Arbeidet er fokusert på å utnytte denne metoden som en ny terapeutisk tilnærming for direkte administrasjon av NGF i CNS for potensielle behandling av nevrodegenerative sykdommer. NGF lastet PSiO2 bærere kan bli implantert i mus hjernen og virkningen av plattformen som langsiktig implantater er studert i vivo. Videre kan kombinerer dette lovende operatører med ikke-invasiv biolistics49,50 gjøre en å administrere NGF lastet PSiO2 partikler i en svært romlig oppløsning til et lokalisert ved hjelp av en roman pneumatiske kapillær pistol for behandling av nevrodegenerative lidelser, der det kreves en spatiotemporal narkotika-administrasjon. Videre kan NGF direkte dannes hemmer nevronal vekst i en kjemisk gradient måte51, ligner på axon veiledning molekyler. Dermed kan lastet PSiO2 bærere tjene som attractant aktiveringspunkt til NGF, til direkte vekst, utfyllende til andre dirigere stikkordene52,53. I tillegg kan PSiO2bærere spesielt avpasset for å opprettholde levering av NGF for en mye-utvidet tidsperiode i opptil flere måneder ved ytterligere tuning PSiO2 nanostructure og dens overflatekjemi.
The authors have nothing to disclose.
MS og ES erkjenner kjernetjenestene og støtte fra lastebil I. Lokey Center for Life Science og Engineering og økonomisk støtte for Russell Berrie nanoteknologi Institute ved Technion.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |