Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Utforme porøse Silicon filmer som bærere av Nerve vekst faktor

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

Her presenterer vi en protokoll å design og dikte nanostructured porøse silisium (PSi) filmer som nedbrytbart bærer for nerve vekst faktor (NGF). Neuronal differensiering og utvekst av PC12 celler og mus dorsal root ganglion (DRG) neurons kjennetegnes ved behandling med NGF lastet PSi bærere.

Abstract

Til tross for det store potensialet av NGF for behandling av nevrodegenerative sykdommer, terapeutiske administrasjonen representerer en betydelig utfordring som protein ikke krysse blod - hjerne barrieren, grunn av kjemiske egenskaper, og dermed krever langsiktige levering til hjernen har en biologisk effekt. Dette verket beskriver fabrikasjon av nanostructured PSi filmer som nedbrytbart bærere av NGF for vedvarende levering av denne sensitive protein. PSi bærere er spesielt tilpasset for å få høy lasting effekt og kontinuerlig utgivelsen av NGF for en periode på fire uker, mens bevare sin biologiske aktivitet. Atferden til NGF-PSi bærere som et NGF leveringssystem er undersøkt i vitro ved å undersøke deres evne til å indusere neuronal differensiering og utvekst av PC12 celler og dissosiert DRG neurons. Cellen levedyktighet i nærvær av pen og NGF lastet PSi bærere evalueres. Bioactivity av NGF fra PSi bærere sammenlignet med konvensjonelle behandling av repeterende gratis NGF administrasjoner. PC12 celledifferensiering er analysert og preget av måling av tre ulike morfologiske parametere av differensierte celler; (i) antall neurites trekke fra soma (ii) total neurites lengde og (iii) antall branching punkt. PC12-cellene behandles med NGF-PSi bærere viser en dyp differensiering gjennom utgivelsen perioden. Videre Vis DRG neuronal celler kultivert med NGF-PSi bærere en omfattende neurite innvielse, ligner på neurons behandlet med repeterende gratis NGF administrasjoner. De studerte tunable bærere viser langsiktige implantater for NGF utgivelse med terapeutiske muligheter for nevrodegenerative sykdommer.

Introduction

NGF er viktig for utvikling og vedlikehold av neurons i perifere nervesystemet (PNS)1 og spiller en avgjørende rolle i overlevelse og basale forebrain cholinergic neurons i sentralnervesystemet (CNS)2. Dens høy farmakologiske potensial for behandling av sentrale nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers og Parkinsons, har blitt mye demonstrert, med kliniske studier i gang3,4,5, 6. Den største utfordringen i levering av NGF til CNS ligger i sin manglende evne til å krysse blod-hjernebarrieren (BBB), når systemisk administrert7. Videre NGF mottakelighet for rask enzymatisk degradering gjengir halveringstiden kort og grenser betydelig sin terapeutisk bruk8,9. Derfor er det et udekket utfordring å designe leveringssystemer som tillater en langvarig og kontrollert utgivelsen av NGF på en sikker måte. Ulike NGF leveringssystemer, inkludert polymer-baserte systemer har vært studert10,11,12,13,14,15, 16 , 17. utgivelsen profiler av disse systemene ble karakterisert av en distinkt første burst etterfulgt av en langsom kontinuerlig utgivelse, der i den siste fasen utgivelsen hastigheten var betydelig lav i forhold til den første burst11 ,18,19. Videre inaktivering av protein av de Sure nedbrytningsprodukter av polymerer (f.eks, poly(lactic-co-glycolic) acid) eller tap av NGF bioactivity under prosessen med innkapsling ble observert med denne systemer20.

Nanostructured PSi er preget av flere tiltalende egenskaper, inkludert høy areal, store porøse volum, biocompatibility og tunable nedbrytbarhet i kroppsvæsker, predestining det for en lovende stoffet levering plattform21, 22,23,24,25,26,27,28. Riktig valg av anodization vilkår kan enkelt justere PSi strukturelle egenskapene (f.eks, porøsitet og pore størrelse) for skreddersy stoff lasting og utgivelsen kinetics21,27. Videre tillate ulike praktisk kjemiske ruter endre overflaten av PSi, og ved at finjustere oppløsning frekvensen av Si stillaset under fysiologiske forhold og utgivelse priser av narkotika22,24, 29,30.

Dette arbeidet fokuserer på å designe en PSi-baserte levering system for langvarig kontrollert utgivelsen av NGF. Effekten av NGF-PSi operatører på neuronal differensiering og resultatet er undersøkt ved hjelp av PC12 celler og dissosiert DRG neurons. Vi viser at den lastet NGF har beholdt sin bioactivity ved å indusere neurite utvekst og dyp differensiering gjennom en 1-måned løslate periode innen en enkelt administrasjon.

Protocol

Alle metoder har blitt godkjent av etikk-komiteen av Bar Ilan University.

1. fabrikasjon av oksidert PSi (PSiO2) operatører

  1. Skjær en Si wafer (enkelt side polert i < 100 > ansiktet og tungt Boron-dopet, p-type, 0,95 mΩ·cm) i 1,5 cm x 1,5 cm prøver ved en diamant filtpenn.
  2. Oksidere Si prøvene i en tube ovn på 400 ° C for 2t i luften (oppvarming rate: 25 ° C/min, naturlig nedkjøling).
  3. Fordype Si eksemplene i vandig flussyre (HF) (48%), ddH2O og etanol (99,9%) (1:1:3 v/v/v) i 5 min; deretter skyll prøvene med etanol tre ganger og tørr under en nitrogen strøm.
    Merk: Forbereder og lagre HF løsning i plasticware, som HF oppløser glass.
    FORSIKTIG: HF er en svært korroderende væske, og det bør behandles med ekstrem forsiktighet. Ved eksponering, skyll grundig med vann og behandle det berørte området med HF motgift gel; søke for medisinsk behandling umiddelbart.
  4. Montere Si prøven i en polytetrafluoroethylene etsing celle, med en stripe av aluminiumsfolie som en tilbake-kontakt og en platina coil som counter elektroden.
  5. Etch en oppofrende lag i en 3:1 (v/v) løsning av vandig HF og etanol (99,9%) for 30 s på en konstant nåværende tetthet av 250 mA/cm2; og skyll overflaten av resulterende PSi film med etanol tre ganger og tørr under en nitrogen strøm.
  6. Oppløse fersk etset porøse laget i en vandig NaOH løsning (0.1 M) i 2 minutter. Skyll med etanol tre ganger og tørr under en nitrogen strøm.
  7. Fordype prøven i en løsning av vandig HF (48%), ddH2O og etanol (99,9%) (1:1:3 v/v) i 2 minutter. Skyll med etanol tre ganger og tørr under en nitrogen strøm.
  8. Electrochemically etch Si prøven i en 3:1 (v/v) løsning av vandig HF og etanol (99,9%) for 20 s på en konstant nåværende tetthet av 250 mA/cm2; og skyll overflaten av resulterende PSi film med etanol tre ganger og tørr under en nitrogen strøm.
  9. Termisk oksidere fersk etset PSi prøvene i et rør ovn på 800 ° C 1t i luften (oppvarming rate: 25 ° C/min, naturlig nedkjøling) å danne en porøs SiO2 (PSiO2) stillaset.
  10. Spin-coat PSiO2 prøver med en positiv tykk photoresist ved 4000 rpm for 1 min; deretter bake belagt prøvene ved 90 ° C i 2 minutter (oppvarming rate: 5 ° C/min, naturlig nedkjøling).
  11. Terninger PSiO2 prøvene i 8 mm × 8 mm-prøver ved en dicing så.
  12. For å fjerne photoresist, suge terninger prøvene i aceton 3 h; Skyll grundig med etanol og tørr under en nitrogen strøm.

2. lasting PSiO2 med NGF

  1. For å forberede NGF lasting løsning, oppløse 20 µg av murine β-NGF i 400 µL i 1:1 (v/v) løsning av 0,01 M fosfat-bufret saltvann (PBS) og ddH2O.
  2. Legg til 52 µL av lasting løsningen på PSiO2 prøven og ruge 2 h på RT i avkortet parabol.
    Merk: Opprettholde høy luftfuktighet i retten å hindre tørke opp løsningen under inkubasjon.
  3. Samle løsningen på utvalget for påfølgende kvantifisering av NGF innhold i PSiO2 transportøren.
    Merk: NGF lasting i PSiO2 skal utføres umiddelbart før den tiltenkte bruken, protokollen kan pauses her på grunn av risikoen for tørking og denaturering av protein.

3. kvantifisering av NGF lasting av NGF-ELISA

  1. For å forberede ELISA platen, legge 100 µL 0,5 µg/mL fange antistoff (kanin anti-hβ-NGF) hver Vel, forsegle platen og ruge over natten på RT.
  2. Sug opp brønnene for å fjerne væske og vaske platen fire ganger med 300 µL av vaskebuffer (0,05% Tween-20 i PBS) per bra; Snu platen opp ned for å fjerne gjenværende buffer og blot på et tørkepapir etter siste vask.
  3. Legger 300 µL blokk bufferen (1% bovin serum albumin (BSA) i PBS) hver brønn og ruge minst 1t på RT. Deretter Sug opp og vaske platen fire ganger som beskrevet i trinn 3.2.
  4. For å forberede en kalibreringskurven, fortynne NGF laste løsning (se trinn 2.1) i fortynner (0,05% Tween-20, 0,1% BSA i PBS) til 1 ng/mL. Deretter utføre 2-fold føljetong fortynninger fra 1 ng/mL til null for å få kalibrering kurve prøvene.
  5. For å forberede prøvene, fortynne NGF lasting løsningen (fra trinn 2.1) og samlet etter lasting løsningen (fra trinn 2.3) i fortynningsmiddel 1:100,000 og 1:10,000, for å nå området konsentrasjoner av ELISA kit i bruk (16-1000 pg/mL).
  6. Legge til 100 µL av fortynnede prøver og kalibreringskurven hver godt i tre eksemplarer og ruge på RT for 2t; deretter Sug opp og vaske platen fire ganger som beskrevet i trinn 3.2.
  7. Tilsett 100 µL 1 µg/mL oppdagelsen antistoff (biotinylated kanin anti-hβ-NGF) hver brønn og ruge på RT 2 h. Deretter Sug opp og vaske platen fire ganger som beskrevet i trinn 3.2.
  8. Fortynn Avidin-pepperrot Peroxidase (HRP) 1:2,000 i fortynningsmiddel, legge til 100 µL per brønn og ruge i 30 min på RT. Nå Sug opp og vaske platen fire ganger som beskrevet i trinn 3.2.
  9. Legge til 100 µL av substratløsningen i hver brønn og ruge 25 min på RT for farge utvikling. Måle absorbansen ved 405 nm med bølgelengde korreksjon satt på 650 nm likner en microplate.
  10. Bestemme NGF konsentrasjon i både lasting løsningen og samlet etter lasting løsning basert på kalibreringskurven.
  11. For å beregne NGF masse lastet innen PSiO2 bærer, trekker du NGF masse i samlet etter lasting løsningen fra NGF massen i lasting løsning. NGF lasting effekt beregnes med følgende ligning:
    Equation

4. in vitro NGF utgivelse fra PSiO2

  1. Inkuber NGF lastet PSiO2 operatører i 2 mL 0,01 M PBS som inneholder 1% (w/v) BSA og 0.02% (w/v) Natriumazid på 37 ° C og under orbital agitasjon på 100 rpm.
  2. Hver 2 dager samle løsningen og erstatte den med 2 mL frisk PBS. Fryse samlet utgivelsen prøvene i flytende nitrogen og lagre på 20 ° C for videre analyser.
  3. Bruke kommersielt tilgjengelige NGF ELISA analysen for å kvantifisere NGF innhold i utgivelsen prøvene som beskrevet i trinnene 3.1-3.9.
    Merk: Når forbereder utgivelsen prøvene ELISA kvantifisering, ulike fortynninger skal utføres for forskjellige tidspunkt langs utgivelsen perioden (dvs. tidligere tid poeng bør fortynnet mye mer enn senere tidspunkt). Videre for hver utgivelse prøve, skal minst to forskjellige fortynninger utføres og kvantifisert slik nådde området konsentrasjoner av ELISA kit.
  4. Bestemme NGF konsentrasjon i utgivelsen prøvene basert på kalibreringskurven og lage en grafisk fremstilling av akkumulative NGF release over tid.

5. kvantifisering av i vitro Si erosjon av Induktivt kombinert Plasma Atomic utslipp spektroskopi (ICP-AES)

  1. Fortynne 1 mL av utgivelsen prøver 1:10 i utgivelsen buffer (0,01 M PBS som inneholder 1% (w/v) BSA og 0.02% (w/v) Natriumazid) for et totalt volum på 10 mL.
  2. Overvåke Si atomic utslipp topper på 212.4, 251.6 og 288.2 nm for fortynnede prøvene.
  3. Bestemme Si konsentrasjon i prøver basert på en kalibreringskurven.
  4. For å etablere Si fornedrelse profilen, uttrykke Si innhold på hver tidspunkt som en prosentandel av Si innholdet av bærere (dvs. kumulative Si innholdet langs utgivelsen perioden).
    Merk: For å sikre nøyaktig kvantifisering av Si innholdet av bærere, utgivelsen prøvene er samplet 1 måned etter slutten-punktet i utgivelsen studere og analysert for Si konsentrasjon bruke ICP-AES. Summere kumulative Si innholdet langs utgivelsen perioden og Si innholdet i etter løslatelse eksemplene gir 100% Si innhold.

6. celle levedyktighet og vekst i nærvær av NGF lastet Psio2 operatører

  1. Rat pheochromocytoma (PC12) cellekultur
    1. Forberede grunnleggende vekstmediet ved å legge 10% hest serum (HS), 5% fosterets bovin serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin streptomycin og 0,2% amfotericin til Roselle Park Medical Institute (RPMI) medium.
    2. Forberede differensiering medium ved å legge til 1% HS, 1% L-glutamin, 1% penicillin streptomycin og 0,2% amfotericin til RPMI medium.
    3. Vokse celle suspensjon (106 celler) i en 75 cm2 kultur kolbe med 10 mL grunnleggende oppblomstringen medium for 8 dager. hver 2 dager legge 10 mL av grunnleggende oppblomstringen medium til kolbe.
    4. Vil generere differensiert PC12 cellekultur, overføre celle suspensjon slik sentrifuge; sentrifuge celler for 8 min 200 x g og RT. Forkast nedbryting.
    5. Suspendere cellene i 5 mL av fersk grunnleggende oppblomstringen medium og re sentrifuge celler for 5 min på 200 x g og RT; Forkast nedbryting og resuspend celle pellet i 3 mL av grunnleggende vekst medium.
    6. Sug opp cellene ti ganger bruker en 23 G sprøyte separate celle klynger.
    7. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer celle teller og frø 104 celler/cm2 -arbeidsområdet på kollagen type l belagt plater i nærvær av differensiering medium.
    8. Etter 24 timer, legger du fersk murine β-NGF (50 ng/mL) eller NGF lastet PSiO2 bærer per plate.
      Merk: Høyere NGF konsentrasjoner (> 50 ng/mL) har den nøyaktige effekten som angitt konsentrasjonen.
    9. Fornye differensiering mediet hver 2 dager.
    10. For å vurdere celle levedyktighet, legger til 10% (v/v) av levedyktighet indikator løsningen (resazurin-basert) representant tidspunkt og ruge 5 h på 37 ° C; måle absorbans ved 490 nm bruker et spektrofotometer.
  2. Mus Dorsal Root Ganglion (DRG) cellekultur
    1. For å isolere DRGs fra to 7-uke-gamle C57bl mus, først douse mus med 70% etanol og gjøre et snitt å fjerne huden.
    2. Kutte av bunnen av skallen og bukveggen musklene til ryggmargen er utsatt.
    3. Fjern ryggraden ved å gjøre et kutt på nivå med femurs og rengjør det omringer tissues.
    4. Skjær kolonnen i tre stykker; Deretter kuttet hver brikke i midtlinjen til å generere to halvdeler og skallet ut ryggmargen.
    5. Under kikkerter, trekke ut alle DRG Ganglion og fordype seg i en kald Hanks balansert salt løsning (HBSS).
    6. Rengjør omkringliggende bindevev av lengter DRGs på en Petriskål og fjern gjenværende meninges under kikkerter.
    7. Distansere DRG cellene av rugende dem for 20 min i 1000 U av papain.
    8. Sentrifuge celler for 4 min 400 x g. Forkaste nedbryting og holde celle pellets.
    9. Resuspend pellet i en 10 mg/mL collagenase og 12 mg/mL dispase-II løsning og Inkuber etter 20 min på 37 ° C.
    10. Sentrifuge cellene i 2 minutter på 400 x g; forkaste nedbryting og holde celle pellets.
    11. Triturate celle pellet i 1 mL av HBSS, 10 mM glukose og 5 mM HEPES (pH 7.35) av gjentatte passasje gjennom en trange Pasteur pipette.
    12. Forsiktig legge dissosiert cellene til L-15 medium som inneholder 20% av silisium-baserte kolloidalt medium for cellen separasjon av tetthet gradert sentrifugering; sentrifuger i 8 min 1000 x g. Sug opp nedbryting og holde celle pellets.
      Merk: Målet med dette trinnet er å skille og renser neuronal celler fra axonal rusk, Schwann cellene og fibroblaster.
    13. Resuspend celle pellet i 2 mL F-12 medium; sentrifuger i 2 minutter på 1000 x g; Forkast nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av F-12 medium.
    14. Telle celler og frø 2 × 104 celler i poly-L-lysine og laminin belagt glass bunn 35 mm kultur retter, i et F-12 antibiotika-fri medium med 10% FBS.
      Merk: I utgangspunktet frø cellene i en liten mengde medium (150-200 µL); etter 2t inkubasjon på 37 ° C, legger du til middels for et siste volum 2 ml.
    15. Forsiktig legge til NGF-lastet PSiO2 operatør eller frisk murine β-NGF (50 ng/mL) per plate.
    16. Etter 2 dager, løse cellekultur av rugende den med en 4% paraformaldehyde (PFA) løsning i 15 min på RT; immunostai cellekultur ved hjelp av en vanlig immunofluorescence flekker prosedyren31.
    17. Bilde neuronal cellekultur med AC confocal mikroskop.

7. celle differensiering analyse

  1. PC12 celler differensiering prosent i nærvær av NGF lastet PSiO2 operatører
    1. Inkuber NGF lastet PSiO2 operatører i 2 mL differensiering medium en fuktet inkubator på 37 ° C som inneholder 5% CO2.
    2. Hver 2 dager, samle løsningen og erstatte den med 2 mL av fersk medium. Fryse samlet utgivelsen prøvene i flytende nitrogen og lagre på 20 ° C for videre analyser.
    3. Frø PC12 celler i 12-vel kollagen belagte plater som beskrevet i kapittel 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. Etter 24 timer, introdusere utgivelsen prøvene av representant tidspunkt (fra delen 5.1.2) forskjellige fordelt; kontroll brønner, legger du fersk murine β-NGF (50 ng/mL).
    5. Etter 24 timer, bilde cellene med lys mikroskop.
    6. For å finne ut prosentandelen av neurite-bærende celler, manuelt telle celler som hadde vokst neurites av antall celler i bilder (n = 5 rammer for hver brønn); lage en grafisk fremstilling av PC12 celler med neurite utvekst over tid.
      Merk: Udifferensierte PC12 celler syntes å ha rundet struktur uten neurites, mens differensierte celler kan identifiseres ved utvekst av neurites (minst en av minimum lengde på cellen soma diameter) eller morfologiske endringer.
  2. Morphometric analyse av differensierte PC12 celler
    1. For bilde prosessering analyse, hente fase bilder av kultivert celler opp til 3 dager etter behandling med NGF (som gratis reagens eller som utgivelsen produktet av NGF lastet PSiO2 bærere).
      Merk: På senere tidspunkt (utover dag 5) cellene utvikle komplekse nettverk, forebygge morphometric mål med en enkeltcelle oppløsning.
    2. Last ned bilde behandling programmet NeuronJ, en ImageJ plug-in, som muliggjør en halvautomatisk neurite sporing og måling av lengden.
    3. Konvertere bildefilen til en 8-biters format og måle pixel mikrometer forhold ved hjelp av bildet skala bar.
    4. Angi skalaen bruker analyser | Angi skalaen kommandoen og måle lengden på hver neurite.
    5. Manuelt Tell antall branching punkt og antall neurites fra hver celle soma.
      Merk: En gjennomsnittlig neurite lengde 1 dag etter NGF behandling er ca 30 µm. Målt neurite lengder kan distribueres.

Representative Results

Oksidert PSi-filmer er laget som beskrevet i protokollen. Si kjeks er utsatt for elektrokjemiske etsing for 20 s 250 mA/cm2 (figur 1ai), etterfulgt av termisk oksidasjon på 800 ° C (figur 1aii) å produsere en PSiO2 stillaset. Høyoppløselig skanning elektronmikroskop (HR-SEM) bilder av resulterende PSiO2 filmen vises i figur 1bc. Oversiden mikroskop-bilde av filmen (figur 1b) viser sin svært porøs naturen med porene i ca 40 nm i diameter. Tverrsnittsstudier mikroskop-bilde av en cleaved film (figur 1 c) avslører porøse lagtykkelse på 2,9 µm, preget av sammenhengende sylindriske porene.

PSiO2 filmene er lastet med NGF lasting løsning som vist i figur 1aiii. NGF lasting er kvantifisert ved hjelp av NGF-ELISA ved å måle NGF konsentrasjonen i lasting løsningen før og etter inkubasjon med PSiO2 filmene. Gjennomsnittlig masse lastet NGF per PSiO2 film bestemmes som 2,8 ± 0,2 µg, som tilsvarer en høy lasting effekten av 90% (w/w) (data ikke vist31). For å etablere NGF utgivelse profilen fra PSiO2 bærere, lastet filmene er ruges i PBS på 37 ° C og hver 2 dager dele samples for kvantifisering av utgitt protein konsentrasjonen med NGF ELISA. I tillegg Si innholdet i utgivelsen prøvene er kvantifisert bruker ICP-AES og Si erosjon kinetics av PSiO2 bærere er etablert. Figur 2 viser at NGF og tilsvarende Si fornedrelse profiler porøse bærere. En vedvarende utgivelsen av NGF, uten burst effekt, er oppnådd for en periode på 1 month. NGF utgivelse i den første uken er raskere (skråningen = 0.442) sammenlignet med en mye tregere utgivelse i senere dager langs utgivelsen perioden (stigningstallet 0.043). Det bør bemerkes at gjennom hele 1-måned løslate perioden, mengden av NGF utgitt er tilstrekkelig til å indusere dyp differensiering av PC12 celler, som vil bli diskutert senere. Akkumulative NGF utgitt er funnet i en god sammenheng (R2 = 0.971) med gjenværende Si innhold, som vist i rammemargen i figur 2.

Deretter bioactivity NGF-lastet PSiO2 bærere er preget i vitro, PC12 celler og DRG neurons brukes som modeller for neuronal differensiering og resultatet. PC12 celler og dissosiert DRG neurons er seeded som beskrevet i protokollen. Først undersøkes celle levedyktighet i nærvær av PSiO2 bærere av rugende cellene med pen (ikke lastet) eller NGF lastet PSiO2; kontroll plater og cellene behandlet med ryddig PSiO2 er supplert med gratis NGF hver 2 dager. Ingen cytotoksisitet er observert ved eksponering av cellene å ryddig eller NGF lastet PSiO2 bærere (figur 3a), viser at PSiO2 er biokompatible med celle linjen. Figur 3b viser representant HR-SEM micrographs av PC12-cellene behandles med NGF lastet PSiO2 bærere. Den observerte celler ekstra neurites og form karakteristiske forgrenet nevrale nettverk. Lignende resultater er oppnådd når seeding dissosiert DRG neuronal celler i nærvær av NGF lastet PSiO2 bærere. AC confocal bilder av immunostained DRG celler kulturperler med NGF lastet PSiO2 bærere (figur 3e) viser en omfattende neurite initiering og elongation, lik positiv kontroll (dvs., nerveceller med gratis NGF, se figur 3d), mens negative kontroll (dvs., ubehandlet neurons, se Figur 3 c), viser en dårlig omfanget av neurite utvekst.

For å evaluere PC12 celler differensiering prosent i nærvær av NGF fra PSiO2 bærere, er differensiering kvantifisert ved å telle celler med neurite utvekst av total-celle befolkningen. Figur 4 oppsummerer resultatene ut prosentandelen av differensierte celler på ulike tidspunkt over en 26-dagers periode. Betydelig differensiering prosentverdier er oppnådd under hele studert. Spesielt etter 26 dager, har befridd NGF indusert differensiering av over 50%, differensiering prosent som er betydelig høyere enn tidligere studier med polymer-baserte bærere16. Disse resultatene indikerer at NGF entrapment i porøse verten bevart den biologiske aktiviteten av protein for å indusere dyp differensiering for en periode på ~ 1 måned.

For å ytterligere undersøke effekten av NGF-PSiO2 operatører på neuronal differensiering, tre karakteristiske morfologiske parametere differensiert PC12 cellene er målt på enkeltcelle nivå: (i) antall neurites trekke fra soma ( II) den totale neurites' lengden og (iii) antall branching punkt. Cellene behandles med NGF lastet PSiO2 bærere eller repeterende administrasjon av gratis NGF (hver 2 dager), som en kontroll. Figur 5a -c presenterer morphometric analyse av befolkningen celle dager 1 og 3. PC12 cellene behandlet med NGF lastet PSiO2 viser morphometric verdier som ligner på kontrollen behandling for alle tre testet parametere. Etter 3 dager, er verdiene av alle morfologiske parametere observert for å øke i samme tempo for både NGF-lastet PSiO2 bærere og kontroll behandling av repeterende administrasjon av gratis NGF.

Figure 1
Figur 1: Fabrikasjon av PSiO2 filmer. (a) fabrikasjon ordningen med PSiO2 bærere: (i) Silicon wafer underlegges elektrokjemiske etsing for 20 s på 250 mA/cm2, etterfulgt av (ii) termisk oksidasjon på 800 ° C til å produsere en PSiO2 stillaset, og (iii) NGF lasting av fysisk adsorpsjon (skjematisk tegnes ikke skala). (ABC) Topp-visning og tverrsnitt elektron micrographs en karakteristisk PSiO2 film. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: NGF utgivelse og Si erosjon profiler av NGF lastet PSiO2 bærere. Omfanget av nedbrytning av PSiO2 bærere vises som brøkdel av på Si innhold på hvert punkt av Si innholdet av porøse filmen. Rammemargen viser sammenhengen mellom akkumulative NGF utgitt og gjenværende Si innhold. Feil barer representerer SD, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Celle levedyktighet og vekst i nærvær av NGF lastet PSiO2 operatører. (a) In vitro cytotoksisitet karakterisering. PC12 celler levedyktigheten måles på 1, 3 og 7 dager etter sin eksponering til pen (ikke lastet) PSiO2 operatører, NGF lastet PSiO2 bærere eller gratis NGF (50 ng/mL hver 2 dager, kontroll plater). (b) elektron micrographs PC12 celler kulturperler med NGF lastet PSiO2 operatører for 9 dager. Venstre: en zoome inn, viser neurite resultatet fra cellen soma; høyre side: en zoome ut, som angir det komplekse nevrale nettverket dannet. (c-e) AC confocal mikroskopi bilder av immunostained DRG neuronal celle kultur (2 dager etter seeding): (c) ubehandlet celler. (d) celler med gratis NGF (50 ng/mL); (e) NGF-PSiO2 bærere. Immunofluorescent farging av neurofilament H kan imaging celle soma og outgrowing neurites. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: PC12 celler differensiering prosentverdier ved eksponering til NGF fra NGF-lastet PSiO2 operatører på representant tidspunkt. Differensiering prosent uttrykkes som antall celler med neurite utvekst av total-celle befolkningen. Kontroll behandling refererer til celler med gratis NGF (50 ng/mL). Representant * lys bilder av cellene på ulike tidspunkt vises langs x-aksen. skala bar = 25 µm for micrographs på dager 2, 8, 14: 26 og 50 µm for kontroll mikroskop-bilde. Feil barer representerer SD, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Morphometric analyse av differensierte PC12 celler. Tre morfologiske parametere av differensierte PC12 celler er målt, på én cellenivå, på dag 1 og 3 følgende eksponering for NGF lastet PSiO2 bærere eller repeterende administrasjon av gratis NGF hver 2 dager (kontroll); (en) total neurites lengde (b) nummer neurites trekke fra cellen soma og (c) antall branching punkt. Feil barer representerer SD, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Nedbrytbart nanostructured PSiO2 filmer er fabrikkert og ansatt som bærer for NGF, slik at for kontinuerlig og langvarig utgivelsen, samtidig som det beholder sin biologiske aktivitet. Potensialet av PSiO2 som et leveringssystem for NGF er vist i vitro ved å demonstrere sin evne til å gi tilstrekkelig NGF dose for å indusere neuronal differensiering og fremme utvekst av PC12 celler og DRG neurons. Foretatt filmene kan brukes som langsiktig reservoarer av NGF for behandling i vivo.

Strukturelle egenskapene for fabrikkerte PSi filmene var skreddersydd for NGF nyttelast; den nåværende tettheten av elektrokjemiske etsing ble justert for å få porestørrelse ca 40 nm som ville lett romme NGF, et protein med et molecular weight av 26.5 kDa32 og karakteristiske diameter ~ 4 nm33, innenfor porøse matrise. Videre ble termisk oksidasjon av porøse skafottet utført for å aktivere fysiske adsorpsjon av NGF av elektrostatisk attraksjon de positivt ladede protein negativt ladde oksidert PSi overflaten. Overflatekjemi av PSi har en stor effekt på lasting effekten og stilles enkelt inn for å bedre kontrollere samspillet mellom nyttelast og porøs matrix. Disse interaksjoner diktere senere strukturen i adsorbert protein molekyler og deres bioactivity34,35,36. Avslutningsvis ble systemet justert for å få optimal lasting av NGF med omhu velge riktig porestørrelse, overflate egenskaper og ideelt lasting løsemiddel og den resulterende effekten av parametere dikterer protein lasting effekt. Derfor noen endring i parameterne fabrikasjon (f.eks, nåværende tetthet, etsing tid, type og konsentrasjonen av dopant eller elektrolytt), overflatekjemi eller lasting løsning komposisjon kan påvirke lasting effekt og bioactivity av den lastet protein.

Utgivelsen frekvensen av en nyttelast fra PSi orPSiO2verten bestemmes vanligvis av en kombinasjon av to samtidige mekanismer, ut spredning av nyttelast molekyler og nedbrytning av Si stillaset37. Erosjon og påfølgende oppløsning rate påvirkes av implantasjon området, sin patologi og sykdom staten28,38,39. Den ble etablert i tidligere arbeid at hvis en annen utgivelse hastighet er nødvendig for en bestemt terapeutisk program, utgivelsen profilen kan endres og langvarig ved å endre overflatekjemi av PSi overflaten38,40, 41. Ulike kjemiske modifikasjoner, som termisk oksidasjon, termisk karbonisering og hydrosilylation teknikker, har vist seg å stabilisere PSi overflaten og påvirke sin fornedrelse og påfølgende nyttelast utgivelsen35,42 ,43,44,45. Videre lasting av NGF i bærere av kovalente vedlegg av protein molekyler til Si stillaset via ulike overflatekjemi ruter skal resultere i en mer langvarig fordi nyttelast gis bare ut når kovalente bindinger er ødelagt eller støtter Si matrix er degradert21.

Videre, etter sitt fabrikasjon prosessen, PSi kan bli gjengitt i forskjellige konfigurasjoner foruten tynne filmer, som microparticles46, nanopartikler47 eller frittstående membraner26, som kan også brukes som bærer for NGF og møte spesifikke behov.

For å være klinisk relevante, bør NGF innholdet i PSiO2 operatører komme spekter av terapeutiske doser. I metoden beskrevet i protokollen NGF lastet PSiO2 bærere innføres i en konsistent volum 2 ml av cellen media eller PBS buffer og dermed konsentrasjonen av lasting løsningen og respektive NGF massen lastet ble justert for å gi en lansert NGF konsentrasjon som er relevant for testet i vitro systemet. Når du bruker denne metoden for forskjellige systemer som ex vivo eller i vivo miljøer, bør konsentrasjonen av NGF lasting løsning økt og justert etter den nødvendige dosen. Høyere NGF innhold kan også fås ved å innføre flere operatører per testet område eller større områder av PSiO2 prøver.

Videre bør det bemerkes at i senere tid punkter langs utgivelsen perioden, utgitt NGF konsentrasjonen er mye lavere enn i tidligere tidspunkt. Det faktum at NGF fluks ikke er konstant over tid må tas i betraktning når du utformer systemet etter behov.

Mange NGF levering systemer er utviklet og rapportert i litteraturen, de fleste av dem er polymer-baserte systemer, som består av syntetiske eller polymer conjugates10,11,12,15 , 16 , 17. disse systemene har vist effektiv vedvarende release profiler, men utgivelsen perioden varte over flere dager med en betydelig utbrudd. Noen av disse levering plattformer lider av kritisk begrensninger som tap av bioactivity til innkapsling prosessen, krever bruk av ulike stabiliserende agenter18,48, samt sofistikerte og komplekse fabrikasjon teknikker16. En av de største utfordringene i å utforme leveringssystemer for proteiner er muligheten til å bevare bioactivity av molekyler på entrapment innenfor carrier systemet. Proteiner eller peptider kan lastes inn i PSi/PSiO2 på RT eller selv ved lavere temperaturer uten bruk av sterke, organiske løsningsmidler som er begge viktige faktorer når du legger disse sensitive biomolecules. Tidligere studier har vist at PSi/PSiO2 overflatekjemi spiller en avgjørende rolle i å minimere mulig denaturering av lastet proteiner35,36. Derfor er PSi/PSiO2 en gunstig nanomaterial for å utvikle leveringssystemer for vekst faktorer generelt og NGF spesielt.

Arbeidet er fokusert på å utnytte denne metoden som en ny terapeutisk tilnærming for direkte administrasjon av NGF i CNS for potensielle behandling av nevrodegenerative sykdommer. NGF lastet PSiO2 bærere kan bli implantert i mus hjernen og virkningen av plattformen som langsiktig implantater er studert i vivo. Videre kan kombinerer dette lovende operatører med ikke-invasiv biolistics49,50 gjøre en å administrere NGF lastet PSiO2 partikler i en svært romlig oppløsning til et lokalisert ved hjelp av en roman pneumatiske kapillær pistol for behandling av nevrodegenerative lidelser, der det kreves en spatiotemporal narkotika-administrasjon. Videre kan NGF direkte dannes hemmer nevronal vekst i en kjemisk gradient måte51, ligner på axon veiledning molekyler. Dermed kan lastet PSiO2 bærere tjene som attractant aktiveringspunkt til NGF, til direkte vekst, utfyllende til andre dirigere stikkordene52,53. I tillegg kan PSiO2bærere spesielt avpasset for å opprettholde levering av NGF for en mye-utvidet tidsperiode i opptil flere måneder ved ytterligere tuning PSiO2 nanostructure og dens overflatekjemi.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

MS og ES erkjenner kjernetjenestene og støtte fra lastebil I. Lokey Center for Life Science og Engineering og økonomisk støtte for Russell Berrie nanoteknologi Institute ved Technion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiesmann, C., De Vos, A. Nerve growth factor: structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, (5), 748-759 (2001).
  2. Dreyfus, C. F. Effects of nerve growth factor on cholinergic brain neurons. Trends in Pharmacological Sciences. 10, (4), 145-149 (1989).
  3. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 9, (5), 246-257 (1998).
  4. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Encapsulated cell biodelivery of nerve growth factor to the basal forebrain in patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 33, (1), 18-28 (2012).
  5. Eyjolfsdottir, H., et al. Targeted delivery of nerve growth factor to the cholinergic basal forebrain of Alzheimer's disease patients: application of a second-generation encapsulated cell biodelivery device. Alzheimer's Research & Therapy. 8, (1), 30 (2016).
  6. Tuszynski, M. H., et al. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Nature Medicine. 11, (5), 551-555 (2005).
  7. Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain barrier to neurotrophins. Brain Research. 788, (1), 87-94 (1998).
  8. Thorne, R. G., Frey, W. H. Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system. Clinical Pharmacokinetics. 40, (12), 907-946 (2001).
  9. Tria, M. A., Fusco, M., Vantini, G., Mariot, R. Pharmacokinetics of nerve growth factor (NGF) following different routes of administration to adult rats. Experimental Neurology. 127, (2), 178-183 (1994).
  10. Bhang, S. H., et al. The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture. Biomaterials. 30, (1), 126-132 (2009).
  11. Camarata, P. J., Suryanarayanan, R., Turner, D. A., Parker, R. G., Ebner, T. J. Sustained release of nerve growth factor from biodegradable polymer microspheres. Neurosurgery. 30, (3), 313-319 (1992).
  12. Cooper, A., Bhattarai, N., Zhang, M. Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve tissue regeneration. Carbohydrate Polymers. 85, (1), 149-156 (2011).
  13. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 37 (2016).
  14. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7, (3), 1058-1066 (2015).
  15. Sridhar, R., et al. Electrosprayed nanoparticles and electrospun nanofibers based on natural materials: applications in tissue regeneration, drug delivery and pharmaceuticals. Chemical Society Reviews. 44, (3), 790-814 (2015).
  16. Valmikinathan, C. M., Defroda, S., Yu, X. Polycaprolactone and bovine serum albumin based nanofibers for controlled release of nerve growth factor. Biomacromolecules. 10, (5), 1084-1089 (2009).
  17. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, (17), 3765-3772 (2002).
  18. Cao, X., Shoichet, M. S. Delivering neuroactive molecules from biodegradable microspheres for application in central nervous system disorders. Biomaterials. 20, (4), 329-339 (1999).
  19. Saltzman, W. M., Mak, M. W., Mahoney, M. J., Duenas, E. T., Cleland, J. L. Intracranial Delivery of Recombinant Nerve Growth Factor: Release Kinetics and Protein Distribution for Three Delivery Systems. Pharmaceutical Research. 16, (2), 232-240 (1999).
  20. Zhu, G., Mallery, S. R., Schwendeman, S. P. Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly (lactide- co-glycolide). Nature Biotechnology. 18, 52 (2000).
  21. Anglin, E. J., Cheng, L., Freeman, W. R., Sailor, M. J. Porous silicon in drug delivery devices and materials. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (11), 1266-1277 (2008).
  22. Canham, L. T., et al. Derivatized mesoporous silicon with dramatically improved stability in simulated human blood plasma. Advanced Materials. 11, (18), 1505-1507 (1999).
  23. Chen, F., et al. Organosilica Nanoparticles with an Intrinsic Secondary Amine: An Efficient and Reusable Adsorbent for Dyes. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (18), 15566-15576 (2017).
  24. Godin, B., et al. Tailoring the degradation kinetics of mesoporous silicon structures through PEGylation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 94A. 4, (4), 1236-1243 (2010).
  25. Kempen, P. J., et al. Theranostic Mesoporous Silica Nanoparticles Biodegrade after Pro-Survival Drug Delivery and Ultrasound/Magnetic Resonance Imaging of Stem Cells. Theranostics. 5, (6), 631-642 (2015).
  26. Low, S. P., Voelcker, N. H., Canham, L. T., Williams, K. A. The biocompatibility of porous silicon in tissues of the eye. Biomaterials. 30, (15), 2873-2880 (2009).
  27. Salonen, J., Kaukonen, A. M., Hirvonen, J., Lehto, V. -P. Mesoporous silicon in drug delivery applications. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, (2), 632-653 (2008).
  28. Tzur-Balter, A., Shatsberg, Z., Beckerman, M., Segal, E., Artzi, N. Mechanism of erosion of nanostructured porous silicon drug carriers in neoplastic tissues. Nature Communications. 6, (2015).
  29. Salonen, J., Lehto, V. -P. Fabrication and chemical surface modification of mesoporous silicon for biomedical applications. Chemical Engineering Journal. 137, (1), 162-172 (2008).
  30. Tzur-Balter, A., Massad-Ivanir, N., Segal, E. Surface Engineered Porous Silicon-based Nanostructures for Cancer Therapy. MRS Proceedings. 1416, (2012).
  31. Zilony, N., et al. Prolonged controlled delivery of nerve growth factor using porous silicon nanostructures. Journal of Controlled Release. 257, 51-59 (2017).
  32. Young, M., Saide, J. D., Murphy, R. A., Arnason, B. G. Molecular size of nerve growth factor in dilute solution. Journal of Biological Chemistry. 251, (2), 459-464 (1976).
  33. Erickson, H. P. Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by. Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 11, (1), 32 (2009).
  34. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Thermal oxidation for controlling protein interactions with porous silicon. Langmuir. 26, (17), 14316-14322 (2010).
  35. McInnes, S. J., et al. Surface engineering of porous silicon to optimise therapeutic antibody loading and release. Journal of Materials Chemistry B. 3, (20), 4123-4133 (2015).
  36. Prestidge, C. A., et al. Loading and release of a model protein from porous silicon powders. Physica Status Solidi (A. 204, (10), 3361-3366 (2007).
  37. Tzur-Balter, A., Young, J. M., Bonanno-Young, L. M., Segal, E. Mathematical modeling of drug release from nanostructured porous Si: combining carrier erosion and hindered drug diffusion for predicting release kinetics. Acta Biomaterialia. 9, (9), 8346-8353 (2013).
  38. Nieto, A., et al. Surface Engineering of Porous Silicon Microparticles for Intravitreal Sustained Delivery of Rapamycin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (2), 1070-1080 (2015).
  39. Warther, D., et al. Porous silicon based intravitreal platform for dual-drug loading and controlled release towards synergistic therapy. Drug Delivery. 25, (1), 1537-1545 (2018).
  40. Li, W., et al. Tailoring Porous Silicon for Biomedical Applications: From Drug Delivery to Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 30, (24), 1703740 (2018).
  41. Yazdi, I. K., et al. Physicochemical properties affect the synthesis, controlled delivery, degradation and pharmacokinetics of inorganic nanoporous materials. Nanomedicine. 10, (19), 3057-3075 (2015).
  42. Fry, N. L., Boss, G. R., Sailor, M. J. Oxidation-Induced Trapping of Drugs in Porous Silicon Microparticles. Chemistry of Materials. 26, (8), 2758-2764 (2014).
  43. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Surface chemistry of porous silicon and implications for drug encapsulation and delivery applications. Advances in Colloid and Interface Science. 175, 25-38 (2012).
  44. Salonen, J., Mäkilä, E. Thermally Carbonized Porous Silicon and Its Recent Applications. Advanced Materials. 30, (24), (2018).
  45. Wang, M., et al. Influence of Surface Chemistry on the Release of an Antibacterial Drug from Nanostructured Porous Silicon. Langmuir. 31, (22), 6179-6185 (2015).
  46. Salonen, J., et al. Mesoporous silicon microparticles for oral drug delivery: loading and release of five model drugs. Journal of Controlled Release. 108, (2), 362-374 (2005).
  47. Park, J. -H., et al. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nature Materials. 8, (4), 331-336 (2009).
  48. Johnson, P. J., Skornia, S. L., Stabenfeldt, S. E., Willits, R. K. Maintaining bioactivity of NGF for controlled release from PLGA using PEG. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 86, (2), 420-427 (2008).
  49. Shefi, O., et al. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, (23), 6119-6123 (2006).
  50. Zilony, N., Tzur-Balter, A., Segal, E., Shefi, O. Bombarding Cancer: Biolistic Delivery of therapeutics using Porous Si Carriers. Scientific Reports. 3, 2499 (2013).
  51. Zuidema, J. M., Provenza, C., Caliendo, T., Dutz, S., Gilbert, R. J. Magnetic NGF-Releasing PLLA/Iron Oxide Nanoparticles Direct Extending Neurites and Preferentially Guide Neurites along Aligned Electrospun Microfibers. ACS Chemical Neuroscience. 6, (11), 1781-1788 (2015).
  52. Baranes, K., Moshe, H., Alon, N., Schwartz, S., Shefi, O. Neuronal Growth on l- and d-Cysteine Self-Assembled Monolayers Reveals Neuronal Chiral Sensitivity. ACS Chemical Neuroscience. 5, (5), 370-376 (2014).
  53. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (15), 1700267 (2017).
Utforme porøse Silicon filmer som bærere av Nerve vekst faktor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter