Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Проектирование пористого кремния фильмы как носители фактора роста нервов

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

Здесь мы представляем протокол для проектирования и изготовления наноструктурированных пористого кремния (PSi) фильмы как разложению перевозчиков для фактора роста нервов (ФРН). После лечения с перевозчиками загружен NGF PSi характеризуются нейрональных дифференциации и нарост PC12 клеток и мышей Спинной корень нейроны ганглии (DRG).

Abstract

Несмотря на большой потенциал NGF для лечение нейродегенеративных заболеваний его терапевтические администрация представляет собой значительный вызов как белок не пересекать гематоэнцефалический барьер, силу своих химических свойств и таким образом требует долгосрочного Доставка в мозг биологическое воздействие. Эта работа описывает изготовление наноструктурированных PSi фильмов как разложению носители NGF для устойчивой доставки этой чувствительной белка. PSi перевозчиков специально созданы для получения высокой загрузки эффективность и непрерывного освобождения ФРН в течение четырех недель, при сохранении своей биологической активности. Фун-PSi перевозчиков как система доставки NGF ведет расследование в пробирке путем изучения их возможность побудить нейрональных дифференциации и нарост PC12 клеток и диссоциированных нейронов DRG. Оценивается жизнеспособность клеток в присутствии аккуратным и фун загружен PSi перевозчиков. Биологическую ФРН, освобождены от перевозчиков PSi сравнивается с обычными лечения повторяющихся бесплатно NGF администраций. PC12 дифференцировки клеток, анализируется и характеризуется измерения трех различных морфологических параметров дифференцированных клеток; (i) количество невритов, извлечение из сома (ii всего невритов Длина и (iii количество точек ветвления. PC12 клетках, обработанных с перевозчиками фун-PSi продемонстрировать глубокое дифференциация на протяжении всего периода выпуска. Кроме того DRG нейрональные клетки культивировали с перевозчиками фун-PSi показывают обширные neurite посвящения, похож на нейроны лечат повторяющихся бесплатно NGF администраций. Изучал перестраиваемый перевозчиков продемонстрировать долгосрочный имплантатов для выпуска ФРН с терапевтическим потенциалом для нейродегенеративных заболеваний.

Introduction

Фактор роста НЕРВОВ имеет существенно важное значение для развития и поддержания нейронов в периферической нервной системы (ПНС)1 и играет решающую роль в обеспечении выживания и функции базального переднего холинергических нейронов в центральной нервной системы (ЦНС)2. Его высокий фармакологических потенциал для лечения Центральной нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, широко продемонстрировал, с клинические испытания в настоящее время прогресс3,4,5, 6. Самая большая проблема в доставке ФРН в ЦНС проживает в его неспособность пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), когда системно ведении7. Кроме того NGF восприимчивость к быстрому энзимной деградации делает его короткий период полураспада и значительно ограничивает его использование с лечебной целью8,9. Таким образом существует Невиданный вызов для разработки систем доставки, которые позволяют для продолжительного и контролируемых выпуска ФРН в безопасным способом. Различных систем доставки ФРН, включая полимерных систем, были изучены10,11,12,13,14,15, 16 , 17. выпуск профили этих систем часто характеризовались собственный первоначальный всплеск следуют медленно непрерывного освобождения, где в последней стадии выпуска составлял значительно низкими по сравнению с первоначальной взрыв11 ,18,19. Кроме того с этой системы20были замечены инактивации белка кислых продуктов распада полимеры (например, poly(lactic-co-glycolic) кислота) или утрата NGF отпорности во время процесса инкапсуляции.

Наноструктурированные PSi характеризуется несколькими привлекательными свойствами, включая его большую площадь поверхности, большой объем пористой, биосовместимость и перестраиваемые разлагаемость в жидкостях, трех его для перспективных наркотиков доставки платформы21, 22,23,24,25,26,27,28. Правильный подбор условий его анодирование позволяет легко настроить PSi структурные свойства (например, пористость и поры размер) для пошива наркотиков погрузки и выпуска кинетики21,27. Кроме того различные химические удобные маршруты позволяют изменить поверхность PSi и что далее настраивать скорость растворения Si леску в физиологических условиях и темпы выпуска препарата22,24, 29,30.

Эта работа сосредоточена на разработке системы доставки PSi для длительного контролируемого высвобождения NGF. Эффект перевозчиков фун-PSi на нейрональных дифференциации и нарост проверяется с использованием PC12 клеток и отделить DRG нейронов. Мы демонстрируем, что загружен ФРН сохранил свою биологическую, вызывая neurite нарост и глубокой дифференциации в течение периода 1-месяц выпуска в рамках единой администрации.

Protocol

Все методы были одобрены этики Комитет Бар-Иланского университета.

1. Изготовление окисленных PSi (2PSiO) перевозчиков

  1. Нарежьте Si пластин (односторонняя полированный на < 100 > лицо и сильно легированных бором, p тип, 0,95 mΩ·cm) 1,5 × 1,5 см образцы с использованием алмазов наконечником пера.
  2. Окисления Si образцы в трубчатая печь при температуре 400 ° C на 2 ч в атмосферном воздухе (скорость нагрева: 25 ° C/мин, естественного охлаждения).
  3. Погружать Si образцов в растворе водный фтористоводородную кислоту (HF) (48%), ddH2O и этанола (99,9%) (1:1:3 v/v/v) за 5 мин; затем промойте образцы с этанолом в три раза и высушить под струей азота.
    Примечание: Подготовить и хранить раствор HF в пластик только, как стекла HF растворяет.
    Предупреждение: ВЧ является сильнокоррозионные жидкости, и его следует подходить с крайней осторожностью. В случае воздействия тщательно промойте водой и лечить пораженный участок с ВЧ противоядие лари; немедленно обратитесь за медицинской помощью.
  4. Смонтируйте Si образца в ячейке травления политетрафторэтилена, с помощью полосы алюминиевой фольги обратно контакты и Платиновый катушки как счетчик электрода.
  5. Etch жертвенный слой в 3:1 (v/v) раствор водный ВЧ и этанола (99,9%) за 30 сек при постоянной плотности тока в 250 мА/см2; затем ополосните поверхность результате PSi фильм с этанолом в три раза и высушить под струей азота.
  6. Растворите свеже травленная пористый слой в водном растворе NaOH (0,1 М) 2 мин. Затем смыть с этанолом в три раза и высушить под струей азота.
  7. Погрузить образец в раствор водный HF (48%), ddH2O и этанола (99,9%) (v/1:1:3 v) за 2 мин. Затем смыть с этанолом в три раза и высушить под струей азота.
  8. Электрохимически etch Si образца в решении 3:1 (v/v) водный ВЧ и этанола (99,9%) для 20 s на постоянную плотность тока 250 мА/см2; затем ополосните поверхность результате PSi фильм с этанолом в три раза и высушить под струей азота.
  9. Термически окисляются свеже травленная PSi образцов в трубу печи при температуре 800 ° C за 1 ч в атмосферном воздухе (скорость нагрева: 25 ° C/мин, естественного охлаждения) сформировать пористых SiO2 (2PSiO) леску.
  10. Спин пальто PSiO2 образцы с позитивного фоторезиста толщиной при 4000 об/мин в течение 1 мин; затем выпекать покрытые образцы на 90 ° C на 2 мин (скорость нагрева: 5 ° C/мин, естественного охлаждения).
  11. Кости PSiO2 образцы в образцы 8 × 8 мм, с помощью перетасовки видел.
  12. Для удаления фоторезиста, выдержите нарезанные образцы в ацетоне в течение 3 ч; затем тщательно промыть с этанолом и высушить под струей азота.

2. Загрузка PSiO2 с фун

  1. Подготовить ФРН, Загрузка решение, растворяют 20 мкг мышиных β-ФРН в 400 мкл раствора 1:1 (v/v) 0,01 М фосфат амортизированное saline (PBS) и ddH2O.
  2. 52 мкл раствора погрузки поверх PSiO2 образца и проинкубируйте втечение 2 ч на RT в ограничен блюдо.
    Примечание: Поддерживать высокую влажность в блюдо для предотвращения высыхания раствора во время инкубации.
  3. Соберите раствор на вершине образец для последующих количественного определения содержания ФРН в пределах перевозчик2 PSiO.
    Примечание: Загрузка ФРН в PSiO2 должно выполняться непосредственно перед предполагаемого использования, протокол не может быть приостановлено здесь из-за риска высыхания и денатурации белка.

3. Количественная оценка нагрузки NGF NGF Элиса

  1. Чтобы подготовить пластину ELISA, добавьте 100 мкл 0,5 мкг/мл захвата антитела (кролик анти hβ ФРН) каждый хорошо, печать пластину и Инкубируйте на ночь на RT.
  2. Аспирационная скважин для удаления жидкости и мыть плиты, четыре раза, используя 300 мкл буфера мытья (0,05% Tween-20 в PBS) за хорошо; после последнего мыть Инвертируйте пластину для удаления остаточного буфера и пятно на бумажное полотенце.
  3. Добавить 300 мкл буфера блока (1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS) в каждой скважине и проинкубируйте по крайней мере 1 час на RT. Затем удалить и мыть плиты четыре раза, как описано в шаге 3.2.
  4. Для приготовления калибровочной кривой, разбавить NGF загрузки решения (см. шаг 2.1) в разбавителе (0,05% Tween-20, 0.1% BSA в PBS) 1 нг/мл. Затем выполните 2 раза серийных разведений от 1 нг/мл до нуля получить образцы калибровочной кривой.
  5. Подготовить образцы, разбавляют NGF загрузки решения (от шага 2.1) и собранных после загрузки решения (от шага 2.3) разбавителя картирование и мэм соответственно, чтобы достичь концентрации спектр ELISA комплекта в использовании (16-1000 пг/мл).
  6. В RT добавить 100 мкл разбавленного образцов и калибровочной кривой образцы для каждого в трех экземплярах и проинкубируйте втечение 2 ч; затем удалить и мыть плиты четыре раза, как описано в шаге 3.2.
  7. 100 мкл обнаружения антител 1 мкг/мл (биотинилированным кролик анти hβ ФРН) для каждой скважины и проинкубируйте 2 ч в рт. Затем удалить и мыть плиты четыре раза, как описано в шаге 3.2.
  8. Разбавить авидин-хрен пероксидазы (ПХ) стоматологов в разбавителе, 100 мкл на колодец и Инкубируйте 30 мин на RT. Теперь аспирационная и мыть плиты четыре раза, как описано в шаге 3.2.
  9. 100 мкл раствора субстрата в каждой скважине и инкубировать 25 мин на RT для развития цвета. Измерение поглощения в 405 нм с длиной волны коррекции заход в 650 нм, используя Считыватель микропланшетов.
  10. Определите концентрацию ФРН в загрузке решения и собранных после загрузки решения, основанного на калибровочной кривой.
  11. Чтобы вычислить NGF массы загруженной в пределах PSiO2 перевозчик, вычтите NGF масса собранных после загрузки решения от массы ФРН в загрузке решения. NGF загрузки эффективность рассчитывается по следующей формуле:
    Equation

4. в vitro NGF релиз от PSiO2

  1. Инкубируйте загружен NGF PSiO2 перевозчиков в 2 мл 0,01 М PBS, содержащей 1% (w/v) BSA и азид натрия 0,02% (w/v) при 37 ° C и под орбитальных агитации 100 об/мин.
  2. Каждые 2 дня собирать решения и заменить его с 2 мл свежего PBS. Заморозить собранных релиз образцов в жидком азоте и хранить при температуре-20 ° C для дальнейшего анализа.
  3. Использование коммерчески доступных assay NGF Элиса для количественного определения содержания ФРН в образцах релиз, как описано в шагах 3.1-3.9.
    Примечание: При подготовке выпуска образцы для квантификации ELISA, различных разведениях должны выполняться для различных временных точек вдоль периода выпуска (то есть, раньше времени точки следует разбавить гораздо больше, чем позднее время очков). Кроме того для каждого выпуска образца, по крайней мере два различных разведениях следует выполнить и количественно для обеспечения достижения концентрации спектр ELISA комплект.
  4. Определить концентрацию ФРН в релиз образцов, на основе калибровочной кривой и график выпуска накопительных ФРН с течением времени.

5. Количественная оценка в vitro Si эрозии индуктивно сочетании плазмы атомной эмиссионной спектроскопии (ICP-AES)

  1. Разбавьте 1 мл релиз образцов 1:10 в буфере выпуска (0,01 М PBS, содержащие азид натрия 0,02% (w/v) и 1% (w/v) BSA) для общим объемом 10 мл.
  2. Контролировать Si атомно пиков 212.4, 251.6 и 288.2 Нм для разреженных образцов.
  3. Определения Si концентрации в пробах, основанный на калибровочной кривой.
  4. Создать профиль деградации Si, Экспресс Si содержимое в каждый момент времени в процентах от общего содержания Si перевозчиков (т.е. совокупное содержание Si вдоль период выпуска).
    Примечание: Для обеспечения точной количественной оценки общего содержания Si перевозчиков, релиз образцы являются пробы 1 месяца после конечного выпуска исследования и проанализированы для Si концентрации с помощью ICP AES. Суммирование совокупное содержание Si вдоль период выпуска и Si содержание в пробах пост-релиз обеспечивает 100% Si контента.

6. ячейка жизнеспособность и рост присутствии загружен NGF Psio2 перевозчиков

  1. Культура клетки крыс феохромоцитома (PC12)
    1. Подготовьте основной рост среднего, добавляя 10% лошадь сыворотки (HS), 5% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% L-глютамином, пенициллин стрептомицина 1% и 0,2% амфотерицин Roselle парк медицинский институт (RPMI) средний.
    2. Подготовка среднего дифференциации, добавив 1% HS, 1% L-глютамином, стрептомицин, пенициллин 1% и 0,2% амфотерицин RPMI средний.
    3. Расти суспензию клеток (106 клеток) в 75 см2 культуры флакон с 10 мл базового роста средних 8 дней; каждые 2 дня добавить 10 мл базового роста средних в колбу.
    4. Для создания дифференцированной культуры клеток PC12, передача суспензию клеток для пластиковых пробирок; Центрифуга клетки для 8 минут при 200 x g и RT. Discard супернатант.
    5. Приостановить клетки в 5 мл свежего основной рост средних и повторно центрифуга клетки для 5 минут при 200 x g и RT; отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 3 мл базового роста среднего.
    6. Чтобы разделить кластеры клеток, аспирационная клетки, десять раз с помощью шприца 23 G.
    7. Подсчитать ячейки, используя счетчик клеток Горяева и семян 104 клетки/см2 Рабочая зона на коллаген типа l покрытием пластин в присутствии дифференциации среднего.
    8. После 24 часов Добавьте Свежий мышиных β-ФРН (50 нг/мл) или NGF загружен PSiO2 перевозчика за тарелку.
      Примечание: Более высокие концентрации ФРН (> 50 нг/мл) обладают точный эффект указанной концентрации.
    9. Возобновить дифференциации среднего каждые 2 дня.
    10. Чтобы оценить жизнеспособность клеток, добавить 10% (v/v) (на основе резазурина) раствора индикатора жизнеспособность на представителя время точек и проинкубируйте 5 ч при 37 ° C; Измерение оптической плотности на 490 Нм, используя спектрофотометр.
  2. Культура клетки мышей Спинной корень ганглиев (DRG)
    1. Чтобы изолировать КЗГ из двух 7-week-old мышей C57bl, сначала окунуть мышей с 70% этанола и надрезают чтобы удалить кожу.
    2. Вырезать основания черепа и подвергается мышц брюшной стенки до спинного мозга.
    3. Удаление позвоночника, делая разрез на уровне бедра и очистить окружающих тканей.
    4. Разрезать столбце на три части; Затем вырежьте каждый кусок в средней линии для создания двух половинок и пил из спинного мозга.
    5. В бинокль извлечь все DRG ганглиев и погрузить их в холодной Хэнк сбалансированного солевого раствора (HBSS).
    6. Чистота окружающей соединительной ткани, тоскует ДРГ на чашку Петри и аккуратно удалить остаточные мозговые оболочки под бинокль.
    7. Отделить DRG клетки путем инкубации их на 20 мин в 1000 U папаин.
    8. Центрифуга клетки для 4 мин на 400 x g. Отменить супернатант и сохранить клетки Пелле.
    9. Ресуспензируйте гранулы в 10 мг/мл коллагеназы и 12 мг/мл раствора dispase-II и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C.
    10. Центрифуга клетки для 2 мин на 400 x g; отменить супернатант и сохранить клетки Пелле.
    11. Нарезанных Пелле клеток в 1 мл HBSS, глюкоза 10 мм и 5 мм HEPES (рН 7,35) путем повторного прохода через суженные пипетка Пастера.
    12. Аккуратно добавьте диссоциированных клетки в L-15 среде, содержащей 20% на основе силики коллоидной средой для разделения клеток по плотности градиентного центрифугирования; Центрифуги для 8 мин на 1000 x g. Аспирационная супернатант и сохранить клетки Пелле.
      Примечание: Этот шаг призван разделить и очистить нейрональные клетки от аксональное мусора, Шванновские клетки фибробластов.
    13. Ресуспензируйте Пелле клеток в 2 мл F-12 среды; Центрифуги для 2 мин на 1000 x g; отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл F-12 среды.
    14. Подсчитать ячейки и семян 2 × 104 клетки на поли L-лизин и Ламинин покрытием стекла дно 35 мм культуры блюда, в F-12 антибиотик свободной среде с 10% FBS.
      Примечание: Первоначально, заполнение ячеек в небольшой объем среднего (150-200 мкл); После 2 ч инкубации при 37 ° C добавьте средство для заключительного тома 2 мл.
    15. Аккуратно добавьте2 перевозчик загружен NGF PSiO или свежие мышиных β-ФРН (50 нг/мл) на пластину.
    16. После 2 дней исправить культуры клеток, инкубации с 4% раствор параформальдегида (PFA) для 15 мин на RT; имунноконтраст культура клетки, с помощью общих иммунофлюоресценции пятная процедуру31.
    17. Изображение культуры нейрональных клеток с помощью конфокального микроскопа.

7. ячейки дифференциация анализ

  1. Процент дифференциация клеток PC12 присутствии загружен NGF PSiO2 перевозчиков
    1. Инкубируйте загружен NGF PSiO2 перевозчиков в 2 мл дифференциации среднего, в увлажненные инкубатора при 37 ° C, содержащих 5% CO2.
    2. Каждые 2 дня, собирать решения и заменить его с 2 мл свежей среды. Заморозить собранных релиз образцов в жидком азоте и хранить при температуре-20 ° C для дальнейшего анализа.
    3. Семя PC12 клетки в 12-ну коллаген покрытием плиты как предписано в разделе 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. После 24 часов вводить выпуск образцы репрезентативное время точек (раздел 5.1.2) для различных скважин; для контроля скважин Добавьте Свежий мышиных β-ФРН (50 нг/мл).
    5. После 24 часов изображение клетки с помощью световой микроскоп.
    6. Чтобы определить процент клеток neurite подшипник, вручную подсчитать количество ячеек, которые переросли невритов из общего числа клеток в изображениях (n = 5 кадров для каждой скважины); График количества PC12 клеток с neurite нарост с течением времени.
      Примечание: PC12 недифференцированные клетки, как представляется, имеют округлые структуры без невритов, в то время как дифференцированных клеток может быть идентифицирован нарост невритов (по крайней мере один из минимальная длина равна Сома диаметр ячеек) или морфологических изменений.
  2. Морфометрический анализ дифференцированных клеток PC12
    1. Для анализа обработки изображений приобрести фазы изображения культивируемых клеток до 3 дней после лечения с ФРН (как свободный реагента или выпуска продукта перевозчиков2 фун загружен PSiO).
      Примечание: В позднее время дальше (день 5) клетки развиваются весьма сложных сетей, предотвращая морфометрические измерения с разрешением одну ячейку.
    2. Скачайте программу обработки изображений NeuronJ, ImageJ плагин, который позволяет полуавтоматический neurite отслеживания и измерения длины.
    3. Преобразуйте файл изображения в 8-битный формат и измерения пиксель соотношение микрометра, используя панель масштаб изображения.
    4. Установите масштаб, используя анализ | Команда Задать масштаб и мера длины каждого neurite.
    5. Вручную Подсчитайте количество точек ветвления и количество невритов, происходящих из каждой ячейки сома.
      Примечание: Средняя neurite 1 день после лечения NGF длиной около 30 мкм. Длины измерений neurite может широко распространены.

Representative Results

Окислившиеся плёнки PSi изготавливаются, как описано в протоколе. Si пластин подвергается электрохимического травления для 20 s 250 мА/см2 (Рисунок 1АИ), следуют термического окисления при температуре 800 ° C (рис. 1aii) производить PSiO2 леску. С высоким разрешением, растровая электронная микроскопия (HR-SEM) изображения результате PSiO2 фильма приведены в рисунке 1bc. Микрофотография Топ просмотр фильма (рис. 1b) изображает его очень пористой природы с порами приблизительно 40 Нм в диаметре. Поперечного сечения Микрофотография рассеченного фильма (рис. 1 c) показывает пористый слой толщиной 2,9 мкм, характеризуется смежные цилиндрических поры.

2 фильмы PSiO загружаются с загрузки решение, как показано на рисунке 1aiiiФРН. Загрузка NGF количественно измерения концентрации ФРН в решении загрузки до и после инкубации с PSiO2 фильмов с помощью NGF Элиса. Средняя масса загруженного ФРН за PSiO2 фильм определяется как 2.8 ± 0,2 мкг, который соответствует высокой загрузки эффективность 90% (w/w) (данные не показаны31). Чтобы установить профиль NGF релиз от перевозчиков2 PSiO, загруженные фильмы инкубируют в PBS при 37 ° C и каждые 2 дня аликвоты отбираются для количественного определения концентрации выпустила протеина используя NGF Элиса. Кроме того содержание Si в пробах релиз количественно с помощью ICP AES и Si эрозии кинетики носителей2 PSiO устанавливается. Рисунок 2 изображает NGF выпуска и соответствующие профили деградации Si пористых перевозчиков. Устойчивый выпуска ФРН, без всплеска эффект, достигается в течение 1 месяца. Релиз ФРН в первой неделе быстрее (склон = 0.442) по сравнению с гораздо медленнее выпуска в более поздних дней вдоль периода выпуска (склон 0,043). Следует отметить, что на протяжении всего периода весь 1-месяц выпуска, количество NGF выпустила достаточно для стимулирования глубокой дифференциации клеток PC12, как будет обсуждаться позже. Накопительный ФРН выпустила находится в хорошей корреляции (R2 = 0,971) с оставшихся Si контента, как показано на врезные Рисунок 2.

Далее биологическую перевозчиков2 фун загружен PSiO характеризуется в пробирке, PC12 клетки и нейроны DRG, используются в качестве модели для нейронов дифференциации и нарост. PC12 клетки и диссоциированных нейронов DRG семенами, как описано в протоколе. Во-первых жизнеспособность клеток в присутствии2 перевозчиков PSiO рассматривается инкубации клеток с аккуратным (не загружены) или загружен NGF PSiO2; контроль пластин и клетках, обработанных с аккуратным PSiO2 дополняются бесплатный NGF каждые 2 дня. Не цитотоксичность наблюдается при экспозиции клеток в аккуратные или загружен NGF PSiO2 перевозчиков (Рисунок 3А), демонстрируя, что PSiO2 является биологически совместимым с этой линией клеток. Рисунок 3b показывает представитель HR-SEM микроскопии PC12 клеток, лечение с перевозчиками2 фун загружен PSiO. Наблюдаемые клетки экстракт невритов и формы характеристика разветвленных нейронных сетей. Аналогичные результаты получены при посева отделить DRG нейрональные клетки присутствии загружен NGF PSiO2 перевозчиков. Конфокальный изображения immunostained DRG клетки культивировали с перевозчиками2 фун загружен PSiO (Рисунок 3e) показывают обширные neurite посвящения и удлинение, похож на положительный контроль (то есть, нейроны, дополнена бесплатно ФРН, см. рис. 3d), в то время как отрицательный контроль (т.е., неочищенные нейронов, см. рис. 3 c), экспонаты бедных степени neurite нарост.

Чтобы оценить процент дифференциация клеток PC12 присутствии ФРН, освобождены от перевозчиков2 PSiO, дифференциация количественно путем подсчета клеток с neurite нарост из населения общей ячейки. Рисунок 4 кратко излагаются результаты с точки зрения доли дифференцированных клеток в разных временных точках в течение 26 дней. Протяжении изучал достигаются значительной дифференциации процентных значений. Особенно после 26 дней, выпущенные ФРН побудило дифференциация выше 50%, процент дифференциация, которая является значительно выше по сравнению с предыдущими исследованиями с перевозчиками на основе полимеров16. Эти результаты показывают, что провокация ФРН в узле пористых сохранились биологической активности белка для стимулирования глубокой дифференциации в течение ~ 1 месяц.

Для дальнейшего изучения влияния фун-PSiO2 перевозчиков на нейрональных дифференциации, три характерные морфологические параметры дифференцированных клеток PC12 измеряются на уровне отдельной ячейки: (i) количество невритов извлечение из сома ( II всего невритов Длина и (iii) количество точек ветвления. Клетки обрабатываются с фун загружен PSiO2 перевозчиков или повторяющихся отправления бесплатно ФРН (каждые 2 дня), как элемент управления. Рисунок 5a -c представляет морфометрический анализ популяции клеток в 1-3 день. PC12 клетках, обработанных с фун загружен PSiO2 показывают морфометрические значения, которые похожи на контроль лечения для всех трех проверенных параметров. После 3 дней значения всех морфологических параметров наблюдаются увеличить по той же ставке для перевозчиков2 фун загружен PSiO и контроля лечения повторяющихся администрации свободной NGF.

Figure 1
Рисунок 1: Изготовление PSiO2 фильмов. () схема изготовления несущих PSiO2 : (i) кремниевых пластин подвергается электрохимического травления для 20 s 250 мА/см2, следуют термического окисления (ii) при температуре 800 ° C производить PSiO2 леску и (iii) NGF загрузки физическая адсорбция (схемы не обращается к шкале). (b-c) Топ Просмотр и сечение электрона микроскопии характерным PSiO2 фильма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: NGF выпуска и Si эрозии профили загружен NGF PSiO2 перевозчиков. Степень деградации PSiO перевозчиков2 представлен как часть оставшихся Si содержание в каждой точке времени из общего содержания Si пористая пленка. Врезные показана взаимосвязь между накопительный ФРН выпущен и оставшиеся Si контента. Ошибка бары представляют SD, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Жизнеспособность клеток и рост присутствии загружен NGF PSiO2 перевозчиков. (a) в vitro характеристика цитотоксичности. Жизнеспособность клеток PC12 измеряется на 1, 3 и 7 дней после их подверженности аккуратно (не загружены) PSiO2 перевозчиков, NGF загружен PSiO2 перевозчиков или Бесплатные ФРН (50 нг/мл каждые 2 дня, управления пластины). (b) электронной микроскопии PC12 клетки культивировали с фун загружен PSiO2 перевозчиков за 9 дней. Левая панель: зум в, изображающая neurite нарост из сома клеток; Правая панель: zoom-out, указывающее весьма сложные нейронные сети сформирован. (c-e) Confocal микроскопии изображений immunostained DRG нейрональные клетки культуры (2 дней после посева): (c) не лечить клетки; (d) клетки, дополнена Бесплатные ФРН (50 нг/мл); (e) фун-PSiO2 перевозчиков. Immunofluorescent окрашивание neurofilament H позволяет визуализации ячейки сома и outgrowing невритов. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: PC12 клетки дифференциация процентных значений при воздействии ФРН, освобождены от фун загружен PSiO2 перевозчиков в точках репрезентативное время. Дифференциация процент выражается количество клеток с neurite нарост из населения общей ячейки. Контроль лечения ссылается на ячейки, дополнена бесплатным ФРН (50 нг/мл). Представитель световой микроскопии изображений клеток в разное время точках изображены вдоль оси x; шкалы бар = 25 мкм для микроскопии дней 2, 8, 14, 26 и 50 мкм для управления Микрофотография. Ошибка бары представляют SD, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ морфометрических дифференцированных клеток PC12. Измеряются три морфологические параметры дифференцированных клеток PC12, на уровне отдельной ячейки в день 1 и 3 следующие воздействия загружен NGF PSiO2 перевозчиков или повторяющихся отправления бесплатно NGF каждые 2 дня (контроль); () Общая невритов Длина (b) количество невритов извлечение из клеток сома и (c) количество точек ветвления. Ошибка бары представляют SD, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Разложению наноструктурированных PSiO2 пленки изготавливаются и работают в качестве носителей для ФРН, позволяющие его непрерывное и длительное выпуска, сохраняя свою биологическую активность. Потенциал PSiO2 в качестве системы доставки NGF продемонстрирован в пробирке , продемонстрировав свою способность освободить достаточно NGF дозировка побудить нейрональных дифференциации и поощрять нарост PC12 клетки и нейроны DRG. Инженерии пленки могут использоваться как долгосрочный водохранилищ NGF для будущего обращения в естественных условиях.

Структурные свойства готовых фильмов PSi были специально разработаны специально для NGF полезной нагрузки; плотность тока процесс электрохимического травления была скорректирована для получения размер пор приблизительно 40 Нм, которая бы легко разместить ФРН, белок с molecular weight 26.5 кДа32 и характерным диаметром ~ 4 Нм33, в пределах пористой матрицы. Кроме того термического окисления пористых лесов была выполнена для включения физической адсорбции NGF электростатического притяжения положительно заряженных белков на отрицательно заряженные окисленной поверхности PSi. Химии поверхности PSi оказывает значительное воздействие на эффективность загрузки и может быть легко настроен для того, чтобы лучше контролировать взаимодействие между полезной нагрузки и пористой матрицы. Эти взаимодействия впоследствии диктовать структуры адсорбированных белковых молекул и их биологическую34,35,36. В заключение система была скорректирована для получения оптимальной загрузки ФРН, тщательно выбирая соответствующий поры, характеристики поверхности и идеал, Загрузка растворителя и результирующий эффект диктует указанных параметров загрузки белка эффективность. Таким образом, любые изменения в параметрах изготовления (например, плотность тока, время травления, типа и концентрации примеси или электролита), химии поверхности или загрузки решения композиция может повлиять на эффективность загрузки и отпорности из загружен белка.

Уровень выхода полезной нагрузки от узла2orPSiO PSi обычно продиктована сочетанием двух одновременных механизмов, отток диффузии молекул полезной нагрузки и деградации лесов Si37. Эрозия и последующего распада ставка страдают от имплантации сайта, его патологии и болезни состояние28,38,39. Он был создан в предыдущей работе, что, если другой релиз скорость требуется для определенного терапевтического применения, релиз профиль может быть изменена и длительное, изменив химии поверхности PSi поверхности38,40, 41. Различные химические изменения, например термического окисления, тепловой карбонизации и hydrosilylation методы, было показано, для стабилизации поверхности PSi и влияют на его деградации и последующего грузоподъемность выпуска35,42 ,,4344,45. Кроме того, Загрузка ФРН в перевозчиков, ковалентных привязанность к Си леску через различные маршруты химии поверхности молекул белка должно привести к более длительной релиз потому, что полезная нагрузка освобождается только в тех случаях, когда ковалентные связи разрываются или Поддержка Si матрица деградации21.

Кроме того после процесса его изготовления, PSi может отображаться в различных конфигурациях помимо тонких пленок, такие как микрочастицы46, наночастицы47 или свободностоящая мембраны26, который также может использоваться в качестве перевозчиков для NGF и потребностей соответствуют конкретные приложения.

Для того чтобы быть клинически значимых, NGF содержимое в пределах2 перевозчиков PSiO должен достичь спектр терапевтических доз. В методе, указанных в протоколе, NGF загружен PSiO2 перевозчиков вводятся в последовательной объемом 2 мл ячейки СМИ или PBS буфер и, таким образом, концентрация загрузки решения и соответствующих NGF массы загруженной были скорректированы для получения выпустила NGF концентрации, которая имеет отношение к системе протестированных в пробирке . При использовании этого метода для различных систем, таких как ex vivo или в естественных условиях среды, концентрация ФРН загрузки решения следует увеличить и скорректированы с учетом необходимой дозы. Кроме того высокое содержание NGF можно получить путем введения нескольких перевозчиков в участку или использование больших областей PSiO2 образцов.

Кроме того следует отметить, что в позднее время точек вдоль период выпуска, выпущенные NGF концентрации значительно ниже, чем в более ранние моменты времени. Тот факт, что NGF потока не является постоянным с течением времени должны приниматься во внимание при проектировании системы с учетом потребностей приложения.

Многочисленные NGF доставки системы были разработаны и в литературе, большинство из них о полимерных систем, состоящих из синтетических или природных полимеров конъюгатов10,11,12,15 , 16 , 17. Эти системы показали эффективное устойчивый выпуска профилей, однако, период выпуска, занятых в течение нескольких дней с эффектом значительный пакетном. Некоторые из этих платформ доставки страдают от критических ограничений, таких как потеря отпорности процесс инкапсуляции, требующих использования различных стабилизирующих агентов18,48, а также сложные и сложные методы изготовления16. Одной из серьезных проблем в разработке систем доставки для белков является способность сохранить биологическую молекул после изобличения в системе перевозчика. Белки и пептиды могут быть загружены в PSi/PSiO2 на RT или даже при более низких температурах без использования сильных органических растворителей, которые являются как важными факторами при загрузке этих чувствительных биомолекул. Предыдущие исследования показали, что PSi/PSiO2 химии поверхности играет решающую роль в минимизации возможных денатурации загруженного белки35,36. Таким образом PSi/PSiO2 является выгодным наноматериал для разработки систем доставки для факторов роста в целом и ФРН в частности.

Текущая работа ориентирована на использование этого метода как новый терапевтический подход для прямого управления ФРН в ЦНС для потенциальных лечение нейродегенеративных заболеваний. Загружен NGF PSiO2 перевозчиков может быть имплантированы в мозг мышей и эффективность платформы как долгосрочный имплантаты учился в естественных условиях. Кроме того сочетая этот перспективный перевозчиков с неинвазивной биолистики49,50 может включить один распоряжаться загружен NGF PSiO2 частиц в весьма пространственным разрешением к локализованной области с помощью пневматических Роман капиллярные пистолет для лечение нейродегенеративных расстройств, где требуется пространственно-временных лекарствами. Кроме того NGF могут направить нейрональных рост в химической градиента образом51, аналогичны аксона ориентации молекул. Таким образом загруженного PSiO2 перевозчиков может служить в качестве приманки горячих точек для ФРН, направлять роста, дополняет другие направляющие сигналы52,53. Кроме того PSiO2перевозчиков может быть специально для поддержания доставки NGF для столь продлен срок до нескольких месяцев дальнейшие настройки PSiO2 наноструктур и его химии поверхности.

Disclosures

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

МС и ES признать основные услуги и поддержку от центра Морозко I. грузовик жизни науки и техники и финансовой поддержке Института Рассел Berrie нанотехнологий в Технионе.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiesmann, C., De Vos, A. Nerve growth factor: structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, (5), 748-759 (2001).
  2. Dreyfus, C. F. Effects of nerve growth factor on cholinergic brain neurons. Trends in Pharmacological Sciences. 10, (4), 145-149 (1989).
  3. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 9, (5), 246-257 (1998).
  4. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Encapsulated cell biodelivery of nerve growth factor to the basal forebrain in patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 33, (1), 18-28 (2012).
  5. Eyjolfsdottir, H., et al. Targeted delivery of nerve growth factor to the cholinergic basal forebrain of Alzheimer's disease patients: application of a second-generation encapsulated cell biodelivery device. Alzheimer's Research & Therapy. 8, (1), 30 (2016).
  6. Tuszynski, M. H., et al. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Nature Medicine. 11, (5), 551-555 (2005).
  7. Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain barrier to neurotrophins. Brain Research. 788, (1), 87-94 (1998).
  8. Thorne, R. G., Frey, W. H. Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system. Clinical Pharmacokinetics. 40, (12), 907-946 (2001).
  9. Tria, M. A., Fusco, M., Vantini, G., Mariot, R. Pharmacokinetics of nerve growth factor (NGF) following different routes of administration to adult rats. Experimental Neurology. 127, (2), 178-183 (1994).
  10. Bhang, S. H., et al. The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture. Biomaterials. 30, (1), 126-132 (2009).
  11. Camarata, P. J., Suryanarayanan, R., Turner, D. A., Parker, R. G., Ebner, T. J. Sustained release of nerve growth factor from biodegradable polymer microspheres. Neurosurgery. 30, (3), 313-319 (1992).
  12. Cooper, A., Bhattarai, N., Zhang, M. Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve tissue regeneration. Carbohydrate Polymers. 85, (1), 149-156 (2011).
  13. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 37 (2016).
  14. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7, (3), 1058-1066 (2015).
  15. Sridhar, R., et al. Electrosprayed nanoparticles and electrospun nanofibers based on natural materials: applications in tissue regeneration, drug delivery and pharmaceuticals. Chemical Society Reviews. 44, (3), 790-814 (2015).
  16. Valmikinathan, C. M., Defroda, S., Yu, X. Polycaprolactone and bovine serum albumin based nanofibers for controlled release of nerve growth factor. Biomacromolecules. 10, (5), 1084-1089 (2009).
  17. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, (17), 3765-3772 (2002).
  18. Cao, X., Shoichet, M. S. Delivering neuroactive molecules from biodegradable microspheres for application in central nervous system disorders. Biomaterials. 20, (4), 329-339 (1999).
  19. Saltzman, W. M., Mak, M. W., Mahoney, M. J., Duenas, E. T., Cleland, J. L. Intracranial Delivery of Recombinant Nerve Growth Factor: Release Kinetics and Protein Distribution for Three Delivery Systems. Pharmaceutical Research. 16, (2), 232-240 (1999).
  20. Zhu, G., Mallery, S. R., Schwendeman, S. P. Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly (lactide- co-glycolide). Nature Biotechnology. 18, 52 (2000).
  21. Anglin, E. J., Cheng, L., Freeman, W. R., Sailor, M. J. Porous silicon in drug delivery devices and materials. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (11), 1266-1277 (2008).
  22. Canham, L. T., et al. Derivatized mesoporous silicon with dramatically improved stability in simulated human blood plasma. Advanced Materials. 11, (18), 1505-1507 (1999).
  23. Chen, F., et al. Organosilica Nanoparticles with an Intrinsic Secondary Amine: An Efficient and Reusable Adsorbent for Dyes. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (18), 15566-15576 (2017).
  24. Godin, B., et al. Tailoring the degradation kinetics of mesoporous silicon structures through PEGylation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 94A. 4, (4), 1236-1243 (2010).
  25. Kempen, P. J., et al. Theranostic Mesoporous Silica Nanoparticles Biodegrade after Pro-Survival Drug Delivery and Ultrasound/Magnetic Resonance Imaging of Stem Cells. Theranostics. 5, (6), 631-642 (2015).
  26. Low, S. P., Voelcker, N. H., Canham, L. T., Williams, K. A. The biocompatibility of porous silicon in tissues of the eye. Biomaterials. 30, (15), 2873-2880 (2009).
  27. Salonen, J., Kaukonen, A. M., Hirvonen, J., Lehto, V. -P. Mesoporous silicon in drug delivery applications. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, (2), 632-653 (2008).
  28. Tzur-Balter, A., Shatsberg, Z., Beckerman, M., Segal, E., Artzi, N. Mechanism of erosion of nanostructured porous silicon drug carriers in neoplastic tissues. Nature Communications. 6, (2015).
  29. Salonen, J., Lehto, V. -P. Fabrication and chemical surface modification of mesoporous silicon for biomedical applications. Chemical Engineering Journal. 137, (1), 162-172 (2008).
  30. Tzur-Balter, A., Massad-Ivanir, N., Segal, E. Surface Engineered Porous Silicon-based Nanostructures for Cancer Therapy. MRS Proceedings. 1416, (2012).
  31. Zilony, N., et al. Prolonged controlled delivery of nerve growth factor using porous silicon nanostructures. Journal of Controlled Release. 257, 51-59 (2017).
  32. Young, M., Saide, J. D., Murphy, R. A., Arnason, B. G. Molecular size of nerve growth factor in dilute solution. Journal of Biological Chemistry. 251, (2), 459-464 (1976).
  33. Erickson, H. P. Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by. Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 11, (1), 32 (2009).
  34. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Thermal oxidation for controlling protein interactions with porous silicon. Langmuir. 26, (17), 14316-14322 (2010).
  35. McInnes, S. J., et al. Surface engineering of porous silicon to optimise therapeutic antibody loading and release. Journal of Materials Chemistry B. 3, (20), 4123-4133 (2015).
  36. Prestidge, C. A., et al. Loading and release of a model protein from porous silicon powders. Physica Status Solidi (A. 204, (10), 3361-3366 (2007).
  37. Tzur-Balter, A., Young, J. M., Bonanno-Young, L. M., Segal, E. Mathematical modeling of drug release from nanostructured porous Si: combining carrier erosion and hindered drug diffusion for predicting release kinetics. Acta Biomaterialia. 9, (9), 8346-8353 (2013).
  38. Nieto, A., et al. Surface Engineering of Porous Silicon Microparticles for Intravitreal Sustained Delivery of Rapamycin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (2), 1070-1080 (2015).
  39. Warther, D., et al. Porous silicon based intravitreal platform for dual-drug loading and controlled release towards synergistic therapy. Drug Delivery. 25, (1), 1537-1545 (2018).
  40. Li, W., et al. Tailoring Porous Silicon for Biomedical Applications: From Drug Delivery to Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 30, (24), 1703740 (2018).
  41. Yazdi, I. K., et al. Physicochemical properties affect the synthesis, controlled delivery, degradation and pharmacokinetics of inorganic nanoporous materials. Nanomedicine. 10, (19), 3057-3075 (2015).
  42. Fry, N. L., Boss, G. R., Sailor, M. J. Oxidation-Induced Trapping of Drugs in Porous Silicon Microparticles. Chemistry of Materials. 26, (8), 2758-2764 (2014).
  43. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Surface chemistry of porous silicon and implications for drug encapsulation and delivery applications. Advances in Colloid and Interface Science. 175, 25-38 (2012).
  44. Salonen, J., Mäkilä, E. Thermally Carbonized Porous Silicon and Its Recent Applications. Advanced Materials. 30, (24), (2018).
  45. Wang, M., et al. Influence of Surface Chemistry on the Release of an Antibacterial Drug from Nanostructured Porous Silicon. Langmuir. 31, (22), 6179-6185 (2015).
  46. Salonen, J., et al. Mesoporous silicon microparticles for oral drug delivery: loading and release of five model drugs. Journal of Controlled Release. 108, (2), 362-374 (2005).
  47. Park, J. -H., et al. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nature Materials. 8, (4), 331-336 (2009).
  48. Johnson, P. J., Skornia, S. L., Stabenfeldt, S. E., Willits, R. K. Maintaining bioactivity of NGF for controlled release from PLGA using PEG. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 86, (2), 420-427 (2008).
  49. Shefi, O., et al. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, (23), 6119-6123 (2006).
  50. Zilony, N., Tzur-Balter, A., Segal, E., Shefi, O. Bombarding Cancer: Biolistic Delivery of therapeutics using Porous Si Carriers. Scientific Reports. 3, 2499 (2013).
  51. Zuidema, J. M., Provenza, C., Caliendo, T., Dutz, S., Gilbert, R. J. Magnetic NGF-Releasing PLLA/Iron Oxide Nanoparticles Direct Extending Neurites and Preferentially Guide Neurites along Aligned Electrospun Microfibers. ACS Chemical Neuroscience. 6, (11), 1781-1788 (2015).
  52. Baranes, K., Moshe, H., Alon, N., Schwartz, S., Shefi, O. Neuronal Growth on l- and d-Cysteine Self-Assembled Monolayers Reveals Neuronal Chiral Sensitivity. ACS Chemical Neuroscience. 5, (5), 370-376 (2014).
  53. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (15), 1700267 (2017).
Проектирование пористого кремния фильмы как носители фактора роста нервов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter