Här presenterar vi ett protokoll för att designa och tillverka nanostrukturerade porösa kisel (PSi) filmer som nedbrytbara bärare för nervtillväxtfaktor (NGF). Neuronal differentiering och utväxt av PC12 celler och möss dorsalrotsganglier ganglion (DRG) nervceller kännetecknas vid behandling med NGF-loaded PSi transportörer.
Trots den stora potentialen av NGF för behandling av neurodegenerativa sjukdomar, dess terapeutiska administration utgör en betydande utmaning som proteinet inte korsar blod – hjärnbarriären, på grund av dess kemiska egenskaper, och kräver därför långsiktiga leverans till hjärnan för att ha en biologisk effekt. Detta arbete beskriver tillverkning av nanostrukturerade PSi filmer som nedbrytbara bärare av NGF för fortsatt leverans av detta känsliga protein. PSi bärarna är skräddarsydda för att erhålla hög lastning effekt och kontinuerlig frisättning av NGF för en period på fyra veckor, samtidigt som dess biologiska aktivitet. Beteendet av NGF-PSi bärarna som en NGF leveranssystem är undersökta i vitro genom att undersöka deras förmåga att inducera neuronal differentiering och utväxt av PC12 celler och dissocierade DRG nervceller. Cellernas viabilitet i närvaro av snyggt och NGF-loaded PSi flygbolag utvärderas. Bioaktiviteten av NGF släppt från PSi bärarna jämförs med den konventionella behandlingen av repetitiva gratis NGF förvaltningar. PC12 celldifferentiering analyseras och kännetecknas av mätning av tre olika morfologiska parametrar av differentierade celler; (i) antalet neuriter extraktion från soma (ii) det totala neuriter längd och (iii) antalet förgrenade poäng. PC12 celler behandlas med NGF-PSi bärarna visar en djupgående differentiering under hela release. DRG neuronala celler odlade med NGF-PSi bärarna visar dessutom en omfattande neurite initiation, liknande till nervceller behandlas med repetitiva gratis NGF förvaltningar. De studera avstämbara transportörerna visar de långsiktiga implantat för NGF release med en terapeutisk potential för neurodegenerativa sjukdomar.
NGF är avgörande för utveckling och underhåll av nervceller i perifera nervsystemet (PNS)1 och spelar en avgörande roll för överlevnad och funktion av basala framhjärnan kolinerga nervceller i centrala nervsystemet (CNS)2. Dess höga farmakologiska potential för att behandla centrala neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons, har påvisats allmänt, med kliniska prövningar för närvarande i framsteg3,4,5, 6. Den största utmaningen i leveransen av NGF till CNS bosatt i sin oförmåga att passera blod-hjärnbarriären (BBB), när systemiskt administrerat7. Dessutom NGF känslighet för snabb enzymatiska nedbrytningen återger dess korta halveringstid och avsevärt begränsar dess terapeutiskt bruk8,9. Därför finns det en otillfredsställda utmaning att utforma leveranssystem som möjliggör en långvarig och kontrollerad frisättning av NGF på ett säkert sätt. Olika NGF leveranssystem, inklusive polymer-baserade system, har varit studerade10,11,12,13,14,15, 16 , 17. release profiler av dessa system var ofta kännetecknas av en distinkt inledande explosion följt av en långsam kontinuerlig frisättning, där i senare skede release var betydligt låg i jämförelse med den ursprungliga burst11 ,18,19. Dessutom observerades inaktivering av proteinet av sura nedbrytningsprodukterna av polymerer (t.ex., poly(lactic-co-glycolic) syra) eller förlust av NGF bioaktivitet under processen inkapsling med detta system20.
Nanostrukturerade PSi kännetecknas av flera tilltalande egenskaper, inklusive dess höga yta, stor porösa volym, biokompatibilitet och avstämbara nedbrytbarhet i kroppsvätskor, predestining det för en lovande drogen leverans plattform21, 22,23,24,25,26,27,28. Rätt val av villkoren för dess anodisering kan enkelt justera PSi strukturella egenskaper (t.ex., porositet och por-storlek) för att skräddarsy läkemedel lastning och pressmeddelande kinetik21,27. Dessutom tillåta olika bekväma kemiska rutter att ändra ytan av PSi och genom att ytterligare justera upplösningshastigheten av Si ställningen under fysiologiska betingelser och release räntesatserna för de drog22,24, 29,30.
Detta arbete fokuserar på att utforma ett PSi-baserade leveranssystem för långvarig kontrollerad frisättning av NGF. Effekten av NGF-PSi transportörer på neuronal differentiering och utväxt undersöks med PC12 celler och dissocierade DRG nervceller. Vi visar att den laddade NGF har behållit dess bioaktivitet genom att inducera neurite utväxt och djupgående differentiering under en 1-månads utgåva period inom en enstaka administrering.
Nedbrytbara nanostrukturerade PSiO2 filmerna är fabricerade och anställd som bärare för NGF, vilket möjliggör kontinuerlig och långvarig släpptes samtidigt behålla dess biologiska aktivitet. Den PSiO2 potential att fungera som ett leveranssystem för NGF är visat in vitro- genom att visa sin förmåga att frigöra tillräckliga NGF doseringen förmå neuronal differentiering och främja utväxt av PC12 celler och DRG nervceller. De bakåtkompilerade filmerna kan användas som långsiktiga reservoarer av NGF för framtida behandling i vivo.
Strukturella egenskaperna för de påhittade PSi-filmerna var skräddarsydda för NGF nyttolast; strömtäthet av elektrokemisk etsning processen justerades för att erhålla porstorlek av ungefärligt 40 nm som skulle rymma NGF, ett protein med en molecular weight av 26,5 kDa32 och en karakteristisk diameter på ~ 4 nm33, inom den porös matrisen. Dessutom framfördes Termisk oxidation av porösa schavotten för att möjliggöra fysisk adsorption av NGF av elektrostatisk attraktion av positivt laddade protein till negativt laddade oxiderat PSi ytan. PSi ytan kemi utövar en större effekt på lastning effekten och kan enkelt ställas in för att bättre styra interaktioner mellan nyttolasten och porös matris. Dessa interaktioner diktera därefter av adsorberat proteinmolekyler struktur och deras bioaktivitet34,35,36. Sammanfattningsvis, justerades systemet för att erhålla optimal lastning av NGF genom att noggrant välja lämplig porstorlek, ytegenskaper och ideal lastning lösningsmedel och den resulterande effekten av nämnda parametrar diktat protein lastning effekt. Därför, förändring i fabrication parametrar (t.ex., strömtäthet, etsning tid, typ och koncentration av dopade eller elektrolyt), ytkemi eller lastning lösning sammansättning kan påverka lastning effekt och bioaktivitet av den inlästa protein.
Andelen utsläpp av en nyttolast från PSi orPSiO2värden styrs generellt av en kombination av två samtidiga mekanismer, ut diffusion av nyttolast molekylerna och nedbrytningen av de Si byggnadsställning37. Av erosion och efterföljande upplösningshastighet påverkas av implanteringsstället, dess patologi och sjukdom stat28,38,39. Det fastställdes i tidigare arbete att om en annan Frisättningshastigheten krävs för ett visst terapeutiska program, frige profilen kan ändras och långvarig genom att ändra ytkemi av PSi ytan38,40, 41. Olika kemiska modifieringar, såsom Termisk oxidation, termisk förkolning och hydrosilylation tekniker, har visat att stabilisera PSi ytan och påverka dess nedbrytning och därav nyttolast release35,42 ,43,44,45. Övrigt lastning av NGF till bärarna av kovalent fastsättning av proteinmolekyler till Si schavotten via olika ytkemi rutter bör resultera i en mer långvarig utgivningen eftersom nyttolasten släpps endast när de kovalenta bindningar bryts eller det stödja Si matrix är degraderad21.
Dessutom efter dess tillverkningsprocessen, PSi kan återge i olika konfigurationer förutom tunna filmer, såsom mikropartiklar46, nanopartiklar47 eller fristående membran26, som också kan användas som bärare för NGF och uppfyller specifika applikationsbehov.
För att vara kliniskt relevant, bör NGF innehållet inom PSiO2 lufttrafikföretagen nå terapeutiska dosintervallet. I den metod som beskrivs i protokollet, NGF-loaded PSiO2 bärarna införs en enhetlig volym av 2 mL cell media eller PBS-bufferten och därmed koncentrationen av lastning lösningen och respektive NGF massan laddade justerades för att ge en släppte NGF koncentration som är relevant för testade in vitro- system. När du använder denna metod för olika system, såsom ex vivo eller in-vivo miljöer, bör koncentrationen av den NGF buffertlösning ökade och justeras enligt den nödvändiga dosen. Alternativt kan högre NGF innehåll fås genom att införa flera bärare per testade område eller med hjälp av större områden av PSiO2 prover.
Det bör dessutom noteras att de släppt NGF-koncentrationerna i senare tidpunkter längs perioden release, är mycket lägre än i tidigare tidpunkter. Det faktum att NGF flux inte är konstant över tiden måste beaktas när man utformar systemet enligt applikationsbehov.
Talrika NGF leverans system har utvecklats och rapporterats i litteraturen, de flesta av dem är polymerbaserade system, bestående av syntetiska eller naturliga polymer konjugat10,11,12,15 , 16 , 17. dessa system har visat effektiv frisättningen användarprofiler, dock release perioden sträckte sig över flera dagar med en betydande burst effekt. Några av dessa leveransplattformar lider av kritiska begränsningar såsom förlust av bioaktivitet vid inkapsling processen, som kräver användning av olika stabiliserande agenter18,48, samt sofistikerade och komplexa Fabrication teknik16. En av de största utmaningarna i utforma leveranssystem för proteiner är förmågan att bevara bioaktiviteten av molekylerna vid entrapment inom flygbolaget systemet. Proteiner eller peptider kan laddas i PSi/PSiO2 på RT eller även vid lägre temperaturer utan att använda starka organiska lösningsmedel, som är båda viktiga faktorer när du laddar dessa känsliga biomolekyler. Tidigare studier har visat att PSi/PSiO2 ytkemi spelar en avgörande roll i att minimera möjliga denaturering av den Ladda proteiner35,36. Därför är PSi/PSiO2 en fördelaktig nanomaterial för utveckla leveranssystem för tillväxtfaktorer i allmänhet och NGF i synnerhet.
Det nuvarande arbetet är inriktat på att utnyttja denna metod som en nya behandlingsmetoder för direkt förvaltning av NGF i CNS för potentiell behandling av neurodegenerativa sjukdomar. NGF-loaded PSiO2 transportörer kan implanteras i möss hjärnor och effekten av plattformen som långsiktiga implantat är studerade i vivo. Dessutom kan kombinerar detta lovande bärare med icke-invasiva biolistics49,50 aktivera något att administrera NGF-loaded PSiO2 partiklarna i en hög rumslig upplösning till en lokaliserad område med hjälp av en pneumatisk roman Kapillär pistol för behandling av neurodegenerativa sjukdomar, där en spatiotemporal drug administration krävs. NGF kan dessutom direkt neuronal tillväxt i en kemisk toning sätt51, liknar axon vägledning molekyler. Således, de laddade PSiO2 bärarna kan fungera som lockmedel hot spots att NGF, direkt tillväxt, kompletterar andra styra cues52,53. Dessutom kan PSiO2bärarna skräddarsys specifikt för att upprätthålla leverans av NGF för en mycket-utökad tidsperiod på upp till flera månader genom att ytterligare trimma PSiO2 nanostrukturen och dess ytkemi.
The authors have nothing to disclose.
MS och ES bekräftar grundutbudet och stöd från lastbil I. Lokey Center för Life Science, Engineering och ekonomiskt stöd från Russell Berrie nanoteknik institutet vid Technion.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |