Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Utforma porösa Silicon filmer som bärare av nervtillväxtfaktor

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att designa och tillverka nanostrukturerade porösa kisel (PSi) filmer som nedbrytbara bärare för nervtillväxtfaktor (NGF). Neuronal differentiering och utväxt av PC12 celler och möss dorsalrotsganglier ganglion (DRG) nervceller kännetecknas vid behandling med NGF-loaded PSi transportörer.

Abstract

Trots den stora potentialen av NGF för behandling av neurodegenerativa sjukdomar, dess terapeutiska administration utgör en betydande utmaning som proteinet inte korsar blod - hjärnbarriären, på grund av dess kemiska egenskaper, och kräver därför långsiktiga leverans till hjärnan för att ha en biologisk effekt. Detta arbete beskriver tillverkning av nanostrukturerade PSi filmer som nedbrytbara bärare av NGF för fortsatt leverans av detta känsliga protein. PSi bärarna är skräddarsydda för att erhålla hög lastning effekt och kontinuerlig frisättning av NGF för en period på fyra veckor, samtidigt som dess biologiska aktivitet. Beteendet av NGF-PSi bärarna som en NGF leveranssystem är undersökta i vitro genom att undersöka deras förmåga att inducera neuronal differentiering och utväxt av PC12 celler och dissocierade DRG nervceller. Cellernas viabilitet i närvaro av snyggt och NGF-loaded PSi flygbolag utvärderas. Bioaktiviteten av NGF släppt från PSi bärarna jämförs med den konventionella behandlingen av repetitiva gratis NGF förvaltningar. PC12 celldifferentiering analyseras och kännetecknas av mätning av tre olika morfologiska parametrar av differentierade celler; (i) antalet neuriter extraktion från soma (ii) det totala neuriter längd och (iii) antalet förgrenade poäng. PC12 celler behandlas med NGF-PSi bärarna visar en djupgående differentiering under hela release. DRG neuronala celler odlade med NGF-PSi bärarna visar dessutom en omfattande neurite initiation, liknande till nervceller behandlas med repetitiva gratis NGF förvaltningar. De studera avstämbara transportörerna visar de långsiktiga implantat för NGF release med en terapeutisk potential för neurodegenerativa sjukdomar.

Introduction

NGF är avgörande för utveckling och underhåll av nervceller i perifera nervsystemet (PNS)1 och spelar en avgörande roll för överlevnad och funktion av basala framhjärnan kolinerga nervceller i centrala nervsystemet (CNS)2. Dess höga farmakologiska potential för att behandla centrala neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons, har påvisats allmänt, med kliniska prövningar för närvarande i framsteg3,4,5, 6. Den största utmaningen i leveransen av NGF till CNS bosatt i sin oförmåga att passera blod-hjärnbarriären (BBB), när systemiskt administrerat7. Dessutom NGF känslighet för snabb enzymatiska nedbrytningen återger dess korta halveringstid och avsevärt begränsar dess terapeutiskt bruk8,9. Därför finns det en otillfredsställda utmaning att utforma leveranssystem som möjliggör en långvarig och kontrollerad frisättning av NGF på ett säkert sätt. Olika NGF leveranssystem, inklusive polymer-baserade system, har varit studerade10,11,12,13,14,15, 16 , 17. release profiler av dessa system var ofta kännetecknas av en distinkt inledande explosion följt av en långsam kontinuerlig frisättning, där i senare skede release var betydligt låg i jämförelse med den ursprungliga burst11 ,18,19. Dessutom observerades inaktivering av proteinet av sura nedbrytningsprodukterna av polymerer (t.ex., poly(lactic-co-glycolic) syra) eller förlust av NGF bioaktivitet under processen inkapsling med detta system20.

Nanostrukturerade PSi kännetecknas av flera tilltalande egenskaper, inklusive dess höga yta, stor porösa volym, biokompatibilitet och avstämbara nedbrytbarhet i kroppsvätskor, predestining det för en lovande drogen leverans plattform21, 22,23,24,25,26,27,28. Rätt val av villkoren för dess anodisering kan enkelt justera PSi strukturella egenskaper (t.ex., porositet och por-storlek) för att skräddarsy läkemedel lastning och pressmeddelande kinetik21,27. Dessutom tillåta olika bekväma kemiska rutter att ändra ytan av PSi och genom att ytterligare justera upplösningshastigheten av Si ställningen under fysiologiska betingelser och release räntesatserna för de drog22,24, 29,30.

Detta arbete fokuserar på att utforma ett PSi-baserade leveranssystem för långvarig kontrollerad frisättning av NGF. Effekten av NGF-PSi transportörer på neuronal differentiering och utväxt undersöks med PC12 celler och dissocierade DRG nervceller. Vi visar att den laddade NGF har behållit dess bioaktivitet genom att inducera neurite utväxt och djupgående differentiering under en 1-månads utgåva period inom en enstaka administrering.

Protocol

Alla metoder har godkänts av etiska kommittén av Bar Ilan universitetet.

1. tillverkning av oxiderade PSi (PSiO2) bärare

  1. Skär en Si wafer (enkelsidigt polerad i < 100 > ansiktet och tungt Boron-dopade, p-typ, 0.95 mΩ·cm) i 1,5 cm x 1,5 cm prover med en diamantbestyckade penna.
  2. Oxidera Si proverna i en tube ugn vid 400 ° C för 2 h i luften (värme hastighet: 25 ° C/min, naturlig kylning).
  3. Fördjupa de Si proverna i en lösning av etanol (99,9%), vattenhaltigt fluorvätesyra (HF) (48%), ddH2O (1:1:3 v/v/v) för 5 min; sedan skölj av prov med etanol tre gånger och torka under en kväve-ström.
    Obs: Förbereda och lagrar HF lösning i plasticware endast, som HF upplöser glas.
    FÖRSIKTIGHET: HF är en starkt frätande vätska, och det ska hanteras med yttersta försiktighet. Vid exponering, skölj noga med vatten och behandla det drabbade området med HF antidote gel; Sök vård omedelbart.
  4. Montera Si provet cellredigering polytetrafluoroethylene etsning, med en remsa av aluminiumfolie som en back-kontakt och en platina spole som counter elektroden.
  5. Etch ett uppoffrande lager i en 3:1 (v/v) lösning av vattenhaltigt HF och etanol (99,9%) för 30 s vid en konstant strömtäthet av 250 mA/cm2, sedan skölj ytan av den resulterande PSi film med etanol tre gånger och torka under en kväve-ström.
  6. Lös upp färska-etsade porösa skiktet i NaOH vattenlösning (0,1 M) i 2 min. Skölj sedan med etanol tre gånger och torka under en kväve-ström.
  7. Fördjupa provet i en lösning av vattenhaltigt HF (48%), ddH2O och etanol (99,9%) (1:1:3 v/v) i 2 min. Skölj sedan med etanol tre gånger och torka under en kväve-ström.
  8. Elektrokemiskt etch Si provet i en 3:1 (v/v) lösning av vattenhaltigt HF och etanol (99,9%) för 20 s vid en konstant strömtäthet av 250 mA/cm2, sedan skölj ytan av den resulterande PSi film med etanol tre gånger och torka under en kväve-ström.
  9. Termiskt oxidera nymalen-etsade PSi proverna i en tube ugn vid 800 ° C för 1 h i luften (värme hastighet: 25 ° C/min, naturlig kylning) att bilda en porös SiO2 (PSiO2) byggnadsställning.
  10. Spin-coat PSiO2 prover med en positiv tjock fotoresist vid 4000 rpm för 1 min; sedan baka belagda proverna vid 90 ° C under 2 minuter (värme hastighet: 5 ° C/min, naturlig kylning).
  11. Tärna PSiO2 proverna i 8 mm × 8 mm prover med hjälp av en tärning såg.
  12. Ta bort fotoresist, blöt tärnad proverna i aceton för 3 h; Skölj sedan noggrant med etanol och torka under en kväve-ström.

2. lastning PSiO2 med NGF

  1. För att bereda den NGF buffertlösning, Lös 20 µg av murina β-NGF i 400 µL av 1:1 (v/v) lösning av 0,01 M fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och ddH2O.
  2. Tillsätt 52 µL av lastning lösningen ovanpå PSiO2 provet och inkubera i 2 h på RT i ett utjämnat maträtt.
    Obs: Upprätthålla hög luftfuktighet i skålen att förhindra uttorkning av lösningen under inkubation.
  3. Samla in lösningen på toppen av provet för efterföljande kvantifieringen av NGF innehåll inom PSiO2 transportören.
    Obs: NGF påfyllning i PSiO2 bör utföras omedelbart före den avsedda användningen, protokollet kan inte pausas här på grund av risken för torkning och denaturering av protein.

3. kvantifiering av NGF lastning av NGF ELISA

  1. För att förbereda ELISA-plattan, tillsätt 100 µL 0,5 µg/mL fånga antikropp (kanin anti-hβ-NGF) till varje brunn, försegla plattan och inkubera över natten vid RT.
  2. Aspirera brunnarna för att ta bort vätska och tvätta plattan fyra gånger med 300 µL tvättlösning (0,05% Tween-20 i PBS) per väl; efter den sista tvättningen vänd på plattan för att avlägsna kvarvarande buffert och blot på en pappershandduk.
  3. Tillsätt 300 µL av block buffert (1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS) till varje brunn och inkubera i minst 1 h på RT. Sedan aspirera och tvätta plattan fyra gånger som beskrivs i steg 3,2.
  4. För att förbereda en kalibreringskurva, späd NGF buffertlösning (se steg 2.1) i spädningsvätskan (0,05% Tween-20, 0,1% BSA i PBS) 1 ng/ml. Utför sedan 2-faldig seriespädningar från 1 ng/mL till noll för att få kalibrering kurva prov.
  5. För att bereda proverna, späd NGF lastning lösningen (från steg 2.1) och insamlade efter lastning lösningen (från steg 2.3) i spädningsvätska 1:100,000 och 1:10,000 respektive, för att nå intervallet koncentrationer av ELISA kit används (16-1000 pg/mL).
  6. Tillsätt 100 µL utspädda proverna och kalibreringskurvan prover till var väl i tre exemplar och inkubera vid RT för 2 h; sedan aspirera och tvätta plattan fyra gånger som beskrivs i steg 3,2.
  7. Tillsätt 100 µL av 1 µg/mL detektionsantikropp (biotinylerade kanin anti-hβ-NGF) till varje brunn och inkubera vid RT i 2 h. Sedan aspirera och tvätta plattan fyra gånger som beskrivs i steg 3,2.
  8. Späd avidinen-pepparrot peroxidas (HRP) 1:2,000 i spädningsvätska, tillsätt 100 µL per brunn och inkubera i 30 min på RT. Nu aspirera och tvätta plattan fyra gånger som beskrivs i steg 3,2.
  9. Tillsätt 100 µL arbetssubstratlösning i varje brunn och inkubera 25 min på RT för färgutvecklingen. Mät absorbansen vid 405 nm med våglängd korrigering ställa vid 650 nm med en microplate reader.
  10. Bestämma NGF koncentrationen i både lastning lösningen och den insamlade efter lastning lösningen utifrån kalibreringskurvan.
  11. För att beräkna NGF massa laddad inom PSiO2 bärare, subtrahera NGF samlas i insamlade efter lastning lösningen från NGF massan i buffertlösning. NGF lastning effekt beräknas med följande ekvation:
    Equation

4. in vitro NGF Release från PSiO2

  1. Inkubera NGF-loaded PSiO2 bärarna i 2 mL 0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning som innehåller 1% (w/v) BSA och 0,02% (w/v) natriumazid vid 37 ° C och under orbital agitation av 100 rpm.
  2. Varannan dag samla lösningen och ersätta det med 2 mL färsk PBS. Frysa insamlade release proverna i flytande kväve och förvaras vid-20 ° C för ytterligare analyser.
  3. Använda kommersiellt tillgängliga NGF ELISA-testet för att kvantifiera NGF innehåll i release proven som beskrivs i steg 3.1-3,9.
    Obs: När du förbereder release proverna för ELISA kvantifiering, olika spädningar göras för olika tidpunkter längs den release-perioden (dvs. tidigare tid punkter ska spädas mycket mer än senare tidpunkter). Dessutom för varje release prov, bör minst två olika spädningar utföras och kvantifieras för att säkerställa att nå intervallet koncentrationer av ELISA kit.
  4. Bestämma NGF koncentrationen i release prover utifrån kalibreringskurvan och rita ett diagram över ackumulerande NGF frisättning över tiden.

5. kvantifiering av in vitro- Si Erosion genom induktivt kopplad Plasma utsläpp atomspektroskopi (ICP-AES)

  1. Späd 1 mL release prover 1:10 i release buffert (0,01 M fosfatbuffrad Koksaltlösning innehållande 1% (w/v) BSA och 0,02% (w/v) natriumazid) för en total volym på 10 mL.
  2. Övervaka Si Atom utsläpp toppar vid 212,4, 251,6 och 288,2 nm för utspädda prover.
  3. Bestämma Si koncentrationen i prover utifrån en kalibreringskurva.
  4. För att fastställa den Si nedbrytning profilen, uttrycka Si innehåll vid varje tidpunkt som en procentandel av den totala Si-halten av bärarna (dvs. det kumulativa Si-innehållet längs perioden release).
    Obs: För att säkerställa korrekt kvantifiering av den totala Si-halten av bärarna, release prover är samplade 1 månad efter slutpunkten av frigöraren studera och analyseras för Si koncentration med ICP-AES. Summera det kumulativa Si innehållet längs perioden release och Si innehållet i efter utsättningen proven ger 100% av Si innehåll.

6. cell lönsamhet och tillväxt i närvaro av NGF-Loaded Psio2 bärare

  1. Cellkultur råtta feokromocytom (PC12)
    1. Förbereda grundläggande odlingsmedium genom att lägga till 10% häst serum (HS), 5% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 1% penicillin streptomycin och 0,2% amfotericin Roselle Park Medical Institute (RPMI) medium.
    2. Förbereda differentiering medium genom att lägga till 1% HS, 1% L-glutamin, 1% penicillin streptomycin och 0,2% amfotericin RPMI medium.
    3. Växa cellsuspension (106 celler) i en 75 cm2 kultur kolv med 10 mL grundläggande odlingsmedium för 8 dagar; varannan dag tillsätt 10 mL av grundläggande odlingsmedium till kolven.
    4. För att generera differentierade PC12 cellkultur, överföra cellsuspensionen till ett centrifugrör; Centrifugera celler för 8 min vid 200 x g och RT. Kassera supernatanten.
    5. Avbryta cellerna i 5 mL färsk grundläggande odlingsmedium och åter Centrifugera cellerna för 5 min vid 200 x g och RT; avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 3 mL grundläggande odlingsmedium.
    6. För att separera cell kluster, aspirera cellerna tio gånger med en 23 G spruta.
    7. Räknar de celler som använder en hemocytometer cell räknare och frö 104 celler/cm2 arbetsområdet på kollagen typ l belagda plåtar i närvaro av differentiering medium.
    8. Efter 24 h, lägga till färsk murina β-NGF (50 ng/mL) eller NGF-loaded PSiO2 bärare per platta.
      Obs: Högre NGF koncentrationer (> 50 ng/mL) besitter den exakta effekten som den angivna koncentrationen.
    9. Förnya det differentiering mediet varannan dag.
    10. Utvärdera cellernas viabilitet, lägga till 10% (v/v) av den livskraft indikatorlösningen (resazurin-baserade) vid representativa tidpunkter och inkubera i 5 h vid 37 ° C; Mät absorbansen vid 490 nm med en spektrofotometer.
  2. Möss dorsalrotsganglier ganglier (DRG) cellkultur
    1. För att isolera DRGs från två 7-vecka-gammal C57bl möss, första Släck möss med 70% etanol och gör ett snitt ta bort huden.
    2. Skär basen av skallen och bukväggen musklerna tills ryggmärgen utsätts.
    3. Ta bort ryggraden genom att göra ett snitt i nivå med lårbenet och rengör omgivande vävnader.
    4. Skär kolumnen i tre bitar; skär sedan varje bit i mittlinjen att generera två halvor och skala ut ryggmärgen.
    5. Under kikärten, extrahera alla DRG ganglier och doppa dem i en kall Hanks balanserad saltlösning (HBSS).
    6. Rengör den omgivande bindväv genom tynar DRGs på en petriskål och ta försiktigt bort kvarvarande hjärnhinnorna under kikaren.
    7. Separera DRG cellerna genom inkubering i 20 min i 1.000 U av papain.
    8. Centrifugera cellerna för 4 min vid 400 x g. Avlägsna supernatanten och hålla cellpelleten.
    9. Återsuspendera pelleten i en 10 mg/mL kollagenas och 12 mg/mL dispase-II lösning och Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C.
    10. Centrifugera cellerna för 2 min vid 400 x g; avlägsna supernatanten och hålla cellpelleten.
    11. Pulverisera cellpelleten i 1 mL HBSS, 10 mM glukos och 5 mM HEPES (pH 7,35) av upprepade passage genom en trängd Pasteur-pipett.
    12. Försiktigt lägga till dissocierade cellerna i l-15-medium som innehåller 20% av kisel-baserade kolloidal medium för cellseparation täthet lutning centrifugering; Centrifugera i 8 min vid 1 000 x g. Aspirera supernatanten och hålla cellpelleten.
      Obs: Syftet med detta steg är att separera och renar neuronala celler från axonal skräp, Schwann celler och fibroblaster.
    13. Återsuspendera cellpelleten i 2 mL av F-12 medium; Centrifugera under 2 minuter vid 1 000 x g; avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL F-12 medium.
    14. Räkna celler och utsäde 2 × 104 celler på poly-L-lysin och laminin belagda glas botten 35 mm kultur rätter i ett F-12 antibiotika-fri medium kompletteras med 10% FBS.
      Obs: Inledningsvis utsäde cellerna i en liten volym av medium (150-200 µL); efter 2 h inkubation vid 37 ° C, Lägg till medium för en slutlig volym av 2 mL.
    15. Försiktigt lägga till NGF-loaded PSiO2 transportören eller färska murina β-NGF (50 ng/mL) per platta.
    16. Efter 2 dagar, fixa cellkulturen genom inkubation det med en 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) lösning för 15 min vid RT; immunostain cellkulturen använder en gemensam immunofluorescens färgning förfarande31.
    17. Bild neuronala cellkulturen med confocal Mikroskop.

7. cell differentiering analys

  1. PC12 celler differentiering procentandel i närvaro av NGF-loaded PSiO2 bärare
    1. Inkubera NGF-loaded PSiO2 bärarna i 2 mL differentiering medium, i en fuktad inkubator vid 37 ° C som innehåller 5% CO2.
    2. Varannan dag, samla lösningen och ersätta det med 2 mL färsk medium. Frysa insamlade release proverna i flytande kväve och förvaras vid-20 ° C för ytterligare analyser.
    3. Utsäde PC12 celler i 12-väl kollagen-belagda plattor enligt anvisningar i avsnitt 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. Efter 24 h, införa release proverna av representativa tidpunkter (från avsnitt 5.1.2) till de olika brunnarna; för kontrollbrunnar, lägga till färsk murina β-NGF (50 ng/mL).
    5. Efter 24 h, image cellerna använder ett ljusmikroskop.
    6. För att bestämma procentandelen av neurite-bärande celler, manuellt räkna celler som hade vuxit ur neuriter av det totala antalet celler i bilder (n = 5 bildrutor för varje brunn); Rita ett diagram över andelen PC12 celler med neurite utväxt över tid.
      Obs: Odifferentierade PC12 celler tycktes ha rundade struktur utan neuriter, medan differentierade celler kan identifieras genom utväxt av neuriter (minst en av minsta längd lika med cell soma diameter) eller morfologiska förändringar.
  2. Morfometriska analys av differentierade PC12 celler
    1. För bearbetning bildanalys, förvärva fas bilder av odlade celler upp till 3 dagar efter behandling med NGF (som gratis reagens eller som release produkt av NGF-loaded PSiO2 bärarna).
      Obs: Vid senare tidpunkter (utöver dag 5) cellerna utvecklas mycket komplexa nätverk, förhindra morfometriska mätningar med en enda cell upplösning.
    2. Ladda ner bild bearbetning programmet NeuronJ, ett ImageJ plug-in, vilket möjliggör en halvautomatisk neurite spårning och mätning av längd.
    3. Konvertera bildfilen till en 8-bitars format och åtgärd pixel-mikrometer förhållande använda bildraden skala.
    4. Ställa in skalan för hjälp att analysera | Ange skala kommando och mäta längden på varje neurite.
    5. Manuellt räkna antalet förgrenade punkter och antalet neuriter med ursprung från varje cell soma.
      Obs: En genomsnittlig neurite längd 1 dag efter NGF behandling är ca 30 µm. De uppmätta neurite längderna kan distribueras.

Representative Results

Oxiderade PSi filmer tillverkas som beskrivs i protokollet. Si rånet utsätts för elektrokemisk etsning för 20 s på 250 mA/cm2 (figur 1ai), följt av Termisk oxidation vid 800 ° C (figur 1aii) för att producera en PSiO2 byggnadsställning. Högupplösta svepelektronmikroskopi (HR-SEM) bilder av resulterande PSiO2 filmen visas i figur 1bc. Top-view Mikrograf av filmen (figur 1b) skildrar dess mycket porösa med porer på cirka 40 nm i diameter. Tvärsnittsdata Mikrograf av en klyvs film (figur 1 c) avslöjar en porös lagrartjocklek av 2,9 µm, kännetecknas av anslutande cylindriska porer.

PSiO2 filmerna är laddade med den NGF buffertlösning som illustreras i figur 1aiii. NGF lastning kvantifieras med NGF ELISA genom mätning av NGF koncentrationerna i lastning lösningen före och efter inkubation med PSiO2 filmer. Den genomsnittliga massan av den inlästa NGF per PSiO2 film bestäms som 2,8 ± 0,2 µg, vilket motsvarar en hög lastning effekten av 90% (w/w) (inga data anges31). För att fastställa NGF frige profilen från PSiO2 transportörer, lastade filmerna inkuberas i PBS vid 37 ° C och varje 2 dagar alikvoter provtas för kvantifiering av utgivna protein koncentrationen med hjälp av NGF ELISA. Dessutom Si innehållet i de frige proverna kvantifieras med ICP-AES och Si erosion kineticsen av PSiO2 bärarna är etablerad. Figur 2 visar att NGF och motsvarande Si nedbrytning profiler av de porösa bärarna. En fördröjd frisättning av NGF, utan brast verkan, uppnås under en period av 1 månad. NGF release i den första veckan är snabbare (lutning = 0.442) jämfört med en mycket långsammare frisättning i senare dagar längs perioden release (lutningen 0.043). Det bör noteras att mängden NGF släppt under hela hela 1 månad release, är tillräckliga för att inducera djupgående differentiering av PC12 celler, som kommer att diskuteras senare. Den ackumulerande NGF släppt befinns vara i en bra korrelation (R2 = 0,971) med återstående Si innehåll, som visas i infällt i figur 2.

Nästa, bioaktiviteten av NGF-loaded PSiO2 bärarna är kännetecknas i vitro, PC12 celler och DRG nervceller används som modeller för neuronal differentiering och utväxt. PC12 celler och dissocierade DRG nervceller är seedade som beskrivs i protokollet. Först, cellernas viabilitet i närvaro av PSiO2 bärarna undersöks av ruvning cellerna med snygg (inte laddas) eller NGF-loaded PSiO2; kontrollplattor och celler behandlas med snyggt PSiO2 kompletteras med gratis NGF varannan dag. Ingen cytotoxicitet observeras vid exponering av celler, som snyggt eller NGF-loaded PSiO2 transportörer (figur 3a), visar att PSiO2 är biokompatibel med denna cellinje. Figur 3b visar representativa HR-SEM micrographs PC12 celler behandlas med NGF-loaded PSiO2 transportörer. Den observerade celler extrakt neuriter och bildar karakteristiskt Grenade neuronala nätverk. Liknande resultat erhålls när sådd dissocierade DRG neuronala celler i närvaro av NGF-loaded PSiO2 transportörer. Confocal bilder av immunostained DRG celler odlade med NGF-loaded PSiO2 transportörer (figur 3e) visar en omfattande neurite initiering och töjning, liknar den positiva kontrollen (dvs., det nervceller kompletteras med gratis NGF, se figur 3d), medan negationen kontroll (dvs.obehandlad nervceller, se figur 3 c), uppvisar en dålig omfattningen av neurite utväxt.

Utvärdera PC12 celler differentiering procentandel i närvaro av NGF släppt från PSiO2 transportörer, kvantifieras differentiering genom att räkna cellerna med neurite utväxt av befolkningens totala cell. Figur 4 sammanfattar resultaten när det gäller andelen differentierade celler vid olika tidpunkter under en 26-dagars period. Betydande differentiering procentvärden uppnås under hela studerade. Särskilt efter 26 dagar, har de släppt NGF inducerad differentiering av över 50%, en differentiering procentandel som är betydligt högre jämfört med tidigare studier med polymer-baserade bärare16. Dessa resultat indikerar att NGF brottsprovokation inom porösa värden bevaras den biologiska aktiviteten av proteinet för att inducera djupgående differentiering för ~ 1 månad.

För att ytterligare undersöka effekten av NGF-PSiO2 bärare på neuronal differentiering, tre karakteristiska morfologiska parametrar av differentierade PC12 cellerna mäts på enstaka cellnivå: (i) antalet neuriter utvinna från den soma ( (II) den totala neuriter längd och (iii) antalet förgrenade poäng. Celler behandlas med NGF-loaded PSiO2 bärare eller upprepad administrering av gratis NGF (varannan dag), som en kontroll. Figur 5a -c presenterar morfometriska analysen av cell befolkningen på dag 1 och 3. PC12 cellerna behandlas med NGF-loaded PSiO2 Visa morfometriska värden som liknar kontroll behandling för alla tre testade parametrar. Efter 3 dagar observeras värdena för alla morfologiska parametrar för att öka i samma takt för både NGF-loaded PSiO2 transportörer och kontroll behandling av upprepad administrering av gratis NGF.

Figure 1
Figur 1: Tillverkning av PSiO2 filmer. (a) Fabrication systematiken i PSiO2 transportörer: (i) kisel wafer utsätts för elektrokemisk etsning för 20 s på 250 mA/cm2, följt av (ii) Termisk oxidation vid 800 ° C att producera en PSiO2 byggnadsställning, och (iii) NGF lastning av fysiska adsorption (scheman är inte ritade i skala). (b-c) Top-view och tvärsnitt elektronmikrografier av en karakteristisk PSiO2 film. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: NGF release och Si erosion profiler av NGF-loaded PSiO2 bärare. Omfattningen av nedbrytning av PSiO2 bärarna presenteras som fraktionen av återstående Si innehåll vid varje tidpunkt av den totala Si-halten av porösa filmen. Infällt visar sambandet mellan den ackumulerande NGF släppt och återstående Si innehåll. Fel barer Föreställ SD, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Cellernas viabilitet och tillväxt i närvaro av NGF-loaded PSiO2 bärare. (a) In vitro cytotoxicitet karakterisering. PC12 celler livskraft mäts på 1, 3 och 7 dagar efter exponering för snygg (inte last) PSiO2 bärare, NGF-loaded PSiO2 bärare eller gratis NGF (50 ng/mL varannan dag, kontrollplattor). (b) elektronmikrografier PC12 celler odlade med NGF-loaded PSiO2 transportörer i 9 dagar. Vänstra panelen: en zoom-i, som skildrar neurite utväxt från den cell soma; högra panelen: en zoom-out, som anger det mycket komplexa neuronala nätverket bildas. (c-e) Konfokalmikroskopi bilder av immunostained DRG neuronala cellodling (2 dagar efter sådd): (c) obehandlad celler; (d) celler kompletteras med gratis NGF (50 ng/mL); (e), NGF-PSiO2 bärare. Immunofluorescerande färgning av neurofilament H möjliggör avbildning av den cell soma och den outgrowing neuriter. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: PC12 celler differentiering procentvärden vid exponering för NGF släppt från NGF-loaded PSiO2 minibussar på representativa tidpunkter. Differentiering procentandel uttrycks som antalet celler med neurite utväxt av befolkningens totala cell. Kontroll behandling refererar till celler som kompletteras med gratis NGF (50 ng/mL). Representativa ljusmikroskopi bilder av celler vid olika tidpunkter skildras längs x-axeln; skalstapeln = 25 µm för micrographs dag 2, 8, 14, 26 och 50 µm för kontroll Mikrograf. Fel barer Föreställ SD, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: morfometriska analys av differentierade PC12 celler. Tre morfologiska parametrar av differentierade PC12 celler mäts, på enstaka cellnivå, på dag 1 och 3 efter exponering för NGF-loaded PSiO2 bärare eller upprepad administrering av gratis NGF varannan dag (kontroll), (en) totala neuriter längd (b) antal neuriter utvinna från det cell soma och (c) antalet förgrenade punkter. Fel barer Föreställ SD, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Nedbrytbara nanostrukturerade PSiO2 filmerna är fabricerade och anställd som bärare för NGF, vilket möjliggör kontinuerlig och långvarig släpptes samtidigt behålla dess biologiska aktivitet. Den PSiO2 potential att fungera som ett leveranssystem för NGF är visat in vitro- genom att visa sin förmåga att frigöra tillräckliga NGF doseringen förmå neuronal differentiering och främja utväxt av PC12 celler och DRG nervceller. De bakåtkompilerade filmerna kan användas som långsiktiga reservoarer av NGF för framtida behandling i vivo.

Strukturella egenskaperna för de påhittade PSi-filmerna var skräddarsydda för NGF nyttolast; strömtäthet av elektrokemisk etsning processen justerades för att erhålla porstorlek av ungefärligt 40 nm som skulle rymma NGF, ett protein med en molecular weight av 26,5 kDa32 och en karakteristisk diameter på ~ 4 nm33, inom den porös matrisen. Dessutom framfördes Termisk oxidation av porösa schavotten för att möjliggöra fysisk adsorption av NGF av elektrostatisk attraktion av positivt laddade protein till negativt laddade oxiderat PSi ytan. PSi ytan kemi utövar en större effekt på lastning effekten och kan enkelt ställas in för att bättre styra interaktioner mellan nyttolasten och porös matris. Dessa interaktioner diktera därefter av adsorberat proteinmolekyler struktur och deras bioaktivitet34,35,36. Sammanfattningsvis, justerades systemet för att erhålla optimal lastning av NGF genom att noggrant välja lämplig porstorlek, ytegenskaper och ideal lastning lösningsmedel och den resulterande effekten av nämnda parametrar diktat protein lastning effekt. Därför, förändring i fabrication parametrar (t.ex., strömtäthet, etsning tid, typ och koncentration av dopade eller elektrolyt), ytkemi eller lastning lösning sammansättning kan påverka lastning effekt och bioaktivitet av den inlästa protein.

Andelen utsläpp av en nyttolast från PSi orPSiO2värden styrs generellt av en kombination av två samtidiga mekanismer, ut diffusion av nyttolast molekylerna och nedbrytningen av de Si byggnadsställning37. Av erosion och efterföljande upplösningshastighet påverkas av implanteringsstället, dess patologi och sjukdom stat28,38,39. Det fastställdes i tidigare arbete att om en annan Frisättningshastigheten krävs för ett visst terapeutiska program, frige profilen kan ändras och långvarig genom att ändra ytkemi av PSi ytan38,40, 41. Olika kemiska modifieringar, såsom Termisk oxidation, termisk förkolning och hydrosilylation tekniker, har visat att stabilisera PSi ytan och påverka dess nedbrytning och därav nyttolast release35,42 ,43,44,45. Övrigt lastning av NGF till bärarna av kovalent fastsättning av proteinmolekyler till Si schavotten via olika ytkemi rutter bör resultera i en mer långvarig utgivningen eftersom nyttolasten släpps endast när de kovalenta bindningar bryts eller det stödja Si matrix är degraderad21.

Dessutom efter dess tillverkningsprocessen, PSi kan återge i olika konfigurationer förutom tunna filmer, såsom mikropartiklar46, nanopartiklar47 eller fristående membran26, som också kan användas som bärare för NGF och uppfyller specifika applikationsbehov.

För att vara kliniskt relevant, bör NGF innehållet inom PSiO2 lufttrafikföretagen nå terapeutiska dosintervallet. I den metod som beskrivs i protokollet, NGF-loaded PSiO2 bärarna införs en enhetlig volym av 2 mL cell media eller PBS-bufferten och därmed koncentrationen av lastning lösningen och respektive NGF massan laddade justerades för att ge en släppte NGF koncentration som är relevant för testade in vitro- system. När du använder denna metod för olika system, såsom ex vivo eller in-vivo miljöer, bör koncentrationen av den NGF buffertlösning ökade och justeras enligt den nödvändiga dosen. Alternativt kan högre NGF innehåll fås genom att införa flera bärare per testade område eller med hjälp av större områden av PSiO2 prover.

Det bör dessutom noteras att de släppt NGF-koncentrationerna i senare tidpunkter längs perioden release, är mycket lägre än i tidigare tidpunkter. Det faktum att NGF flux inte är konstant över tiden måste beaktas när man utformar systemet enligt applikationsbehov.

Talrika NGF leverans system har utvecklats och rapporterats i litteraturen, de flesta av dem är polymerbaserade system, bestående av syntetiska eller naturliga polymer konjugat10,11,12,15 , 16 , 17. dessa system har visat effektiv frisättningen användarprofiler, dock release perioden sträckte sig över flera dagar med en betydande burst effekt. Några av dessa leveransplattformar lider av kritiska begränsningar såsom förlust av bioaktivitet vid inkapsling processen, som kräver användning av olika stabiliserande agenter18,48, samt sofistikerade och komplexa Fabrication teknik16. En av de största utmaningarna i utforma leveranssystem för proteiner är förmågan att bevara bioaktiviteten av molekylerna vid entrapment inom flygbolaget systemet. Proteiner eller peptider kan laddas i PSi/PSiO2 på RT eller även vid lägre temperaturer utan att använda starka organiska lösningsmedel, som är båda viktiga faktorer när du laddar dessa känsliga biomolekyler. Tidigare studier har visat att PSi/PSiO2 ytkemi spelar en avgörande roll i att minimera möjliga denaturering av den Ladda proteiner35,36. Därför är PSi/PSiO2 en fördelaktig nanomaterial för utveckla leveranssystem för tillväxtfaktorer i allmänhet och NGF i synnerhet.

Det nuvarande arbetet är inriktat på att utnyttja denna metod som en nya behandlingsmetoder för direkt förvaltning av NGF i CNS för potentiell behandling av neurodegenerativa sjukdomar. NGF-loaded PSiO2 transportörer kan implanteras i möss hjärnor och effekten av plattformen som långsiktiga implantat är studerade i vivo. Dessutom kan kombinerar detta lovande bärare med icke-invasiva biolistics49,50 aktivera något att administrera NGF-loaded PSiO2 partiklarna i en hög rumslig upplösning till en lokaliserad område med hjälp av en pneumatisk roman Kapillär pistol för behandling av neurodegenerativa sjukdomar, där en spatiotemporal drug administration krävs. NGF kan dessutom direkt neuronal tillväxt i en kemisk toning sätt51, liknar axon vägledning molekyler. Således, de laddade PSiO2 bärarna kan fungera som lockmedel hot spots att NGF, direkt tillväxt, kompletterar andra styra cues52,53. Dessutom kan PSiO2bärarna skräddarsys specifikt för att upprätthålla leverans av NGF för en mycket-utökad tidsperiod på upp till flera månader genom att ytterligare trimma PSiO2 nanostrukturen och dess ytkemi.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

MS och ES bekräftar grundutbudet och stöd från lastbil I. Lokey Center för Life Science, Engineering och ekonomiskt stöd från Russell Berrie nanoteknik institutet vid Technion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiesmann, C., De Vos, A. Nerve growth factor: structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, (5), 748-759 (2001).
  2. Dreyfus, C. F. Effects of nerve growth factor on cholinergic brain neurons. Trends in Pharmacological Sciences. 10, (4), 145-149 (1989).
  3. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 9, (5), 246-257 (1998).
  4. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Encapsulated cell biodelivery of nerve growth factor to the basal forebrain in patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 33, (1), 18-28 (2012).
  5. Eyjolfsdottir, H., et al. Targeted delivery of nerve growth factor to the cholinergic basal forebrain of Alzheimer's disease patients: application of a second-generation encapsulated cell biodelivery device. Alzheimer's Research & Therapy. 8, (1), 30 (2016).
  6. Tuszynski, M. H., et al. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Nature Medicine. 11, (5), 551-555 (2005).
  7. Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain barrier to neurotrophins. Brain Research. 788, (1), 87-94 (1998).
  8. Thorne, R. G., Frey, W. H. Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system. Clinical Pharmacokinetics. 40, (12), 907-946 (2001).
  9. Tria, M. A., Fusco, M., Vantini, G., Mariot, R. Pharmacokinetics of nerve growth factor (NGF) following different routes of administration to adult rats. Experimental Neurology. 127, (2), 178-183 (1994).
  10. Bhang, S. H., et al. The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture. Biomaterials. 30, (1), 126-132 (2009).
  11. Camarata, P. J., Suryanarayanan, R., Turner, D. A., Parker, R. G., Ebner, T. J. Sustained release of nerve growth factor from biodegradable polymer microspheres. Neurosurgery. 30, (3), 313-319 (1992).
  12. Cooper, A., Bhattarai, N., Zhang, M. Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve tissue regeneration. Carbohydrate Polymers. 85, (1), 149-156 (2011).
  13. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 37 (2016).
  14. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7, (3), 1058-1066 (2015).
  15. Sridhar, R., et al. Electrosprayed nanoparticles and electrospun nanofibers based on natural materials: applications in tissue regeneration, drug delivery and pharmaceuticals. Chemical Society Reviews. 44, (3), 790-814 (2015).
  16. Valmikinathan, C. M., Defroda, S., Yu, X. Polycaprolactone and bovine serum albumin based nanofibers for controlled release of nerve growth factor. Biomacromolecules. 10, (5), 1084-1089 (2009).
  17. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, (17), 3765-3772 (2002).
  18. Cao, X., Shoichet, M. S. Delivering neuroactive molecules from biodegradable microspheres for application in central nervous system disorders. Biomaterials. 20, (4), 329-339 (1999).
  19. Saltzman, W. M., Mak, M. W., Mahoney, M. J., Duenas, E. T., Cleland, J. L. Intracranial Delivery of Recombinant Nerve Growth Factor: Release Kinetics and Protein Distribution for Three Delivery Systems. Pharmaceutical Research. 16, (2), 232-240 (1999).
  20. Zhu, G., Mallery, S. R., Schwendeman, S. P. Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly (lactide- co-glycolide). Nature Biotechnology. 18, 52 (2000).
  21. Anglin, E. J., Cheng, L., Freeman, W. R., Sailor, M. J. Porous silicon in drug delivery devices and materials. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (11), 1266-1277 (2008).
  22. Canham, L. T., et al. Derivatized mesoporous silicon with dramatically improved stability in simulated human blood plasma. Advanced Materials. 11, (18), 1505-1507 (1999).
  23. Chen, F., et al. Organosilica Nanoparticles with an Intrinsic Secondary Amine: An Efficient and Reusable Adsorbent for Dyes. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (18), 15566-15576 (2017).
  24. Godin, B., et al. Tailoring the degradation kinetics of mesoporous silicon structures through PEGylation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 94A. 4, (4), 1236-1243 (2010).
  25. Kempen, P. J., et al. Theranostic Mesoporous Silica Nanoparticles Biodegrade after Pro-Survival Drug Delivery and Ultrasound/Magnetic Resonance Imaging of Stem Cells. Theranostics. 5, (6), 631-642 (2015).
  26. Low, S. P., Voelcker, N. H., Canham, L. T., Williams, K. A. The biocompatibility of porous silicon in tissues of the eye. Biomaterials. 30, (15), 2873-2880 (2009).
  27. Salonen, J., Kaukonen, A. M., Hirvonen, J., Lehto, V. -P. Mesoporous silicon in drug delivery applications. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, (2), 632-653 (2008).
  28. Tzur-Balter, A., Shatsberg, Z., Beckerman, M., Segal, E., Artzi, N. Mechanism of erosion of nanostructured porous silicon drug carriers in neoplastic tissues. Nature Communications. 6, (2015).
  29. Salonen, J., Lehto, V. -P. Fabrication and chemical surface modification of mesoporous silicon for biomedical applications. Chemical Engineering Journal. 137, (1), 162-172 (2008).
  30. Tzur-Balter, A., Massad-Ivanir, N., Segal, E. Surface Engineered Porous Silicon-based Nanostructures for Cancer Therapy. MRS Proceedings. 1416, (2012).
  31. Zilony, N., et al. Prolonged controlled delivery of nerve growth factor using porous silicon nanostructures. Journal of Controlled Release. 257, 51-59 (2017).
  32. Young, M., Saide, J. D., Murphy, R. A., Arnason, B. G. Molecular size of nerve growth factor in dilute solution. Journal of Biological Chemistry. 251, (2), 459-464 (1976).
  33. Erickson, H. P. Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by. Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 11, (1), 32 (2009).
  34. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Thermal oxidation for controlling protein interactions with porous silicon. Langmuir. 26, (17), 14316-14322 (2010).
  35. McInnes, S. J., et al. Surface engineering of porous silicon to optimise therapeutic antibody loading and release. Journal of Materials Chemistry B. 3, (20), 4123-4133 (2015).
  36. Prestidge, C. A., et al. Loading and release of a model protein from porous silicon powders. Physica Status Solidi (A. 204, (10), 3361-3366 (2007).
  37. Tzur-Balter, A., Young, J. M., Bonanno-Young, L. M., Segal, E. Mathematical modeling of drug release from nanostructured porous Si: combining carrier erosion and hindered drug diffusion for predicting release kinetics. Acta Biomaterialia. 9, (9), 8346-8353 (2013).
  38. Nieto, A., et al. Surface Engineering of Porous Silicon Microparticles for Intravitreal Sustained Delivery of Rapamycin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (2), 1070-1080 (2015).
  39. Warther, D., et al. Porous silicon based intravitreal platform for dual-drug loading and controlled release towards synergistic therapy. Drug Delivery. 25, (1), 1537-1545 (2018).
  40. Li, W., et al. Tailoring Porous Silicon for Biomedical Applications: From Drug Delivery to Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 30, (24), 1703740 (2018).
  41. Yazdi, I. K., et al. Physicochemical properties affect the synthesis, controlled delivery, degradation and pharmacokinetics of inorganic nanoporous materials. Nanomedicine. 10, (19), 3057-3075 (2015).
  42. Fry, N. L., Boss, G. R., Sailor, M. J. Oxidation-Induced Trapping of Drugs in Porous Silicon Microparticles. Chemistry of Materials. 26, (8), 2758-2764 (2014).
  43. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Surface chemistry of porous silicon and implications for drug encapsulation and delivery applications. Advances in Colloid and Interface Science. 175, 25-38 (2012).
  44. Salonen, J., Mäkilä, E. Thermally Carbonized Porous Silicon and Its Recent Applications. Advanced Materials. 30, (24), (2018).
  45. Wang, M., et al. Influence of Surface Chemistry on the Release of an Antibacterial Drug from Nanostructured Porous Silicon. Langmuir. 31, (22), 6179-6185 (2015).
  46. Salonen, J., et al. Mesoporous silicon microparticles for oral drug delivery: loading and release of five model drugs. Journal of Controlled Release. 108, (2), 362-374 (2005).
  47. Park, J. -H., et al. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nature Materials. 8, (4), 331-336 (2009).
  48. Johnson, P. J., Skornia, S. L., Stabenfeldt, S. E., Willits, R. K. Maintaining bioactivity of NGF for controlled release from PLGA using PEG. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 86, (2), 420-427 (2008).
  49. Shefi, O., et al. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, (23), 6119-6123 (2006).
  50. Zilony, N., Tzur-Balter, A., Segal, E., Shefi, O. Bombarding Cancer: Biolistic Delivery of therapeutics using Porous Si Carriers. Scientific Reports. 3, 2499 (2013).
  51. Zuidema, J. M., Provenza, C., Caliendo, T., Dutz, S., Gilbert, R. J. Magnetic NGF-Releasing PLLA/Iron Oxide Nanoparticles Direct Extending Neurites and Preferentially Guide Neurites along Aligned Electrospun Microfibers. ACS Chemical Neuroscience. 6, (11), 1781-1788 (2015).
  52. Baranes, K., Moshe, H., Alon, N., Schwartz, S., Shefi, O. Neuronal Growth on l- and d-Cysteine Self-Assembled Monolayers Reveals Neuronal Chiral Sensitivity. ACS Chemical Neuroscience. 5, (5), 370-376 (2014).
  53. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (15), 1700267 (2017).
Utforma porösa Silicon filmer som bärare av nervtillväxtfaktor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter