Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Gözenekli silisyum filmleri sinir büyüme faktörü taşıyıcı olarak tasarlama

doi: 10.3791/58982 Published: January 25, 2019

Summary

Burada, tasarım ve parçalanabilir taşıyıcıları için sinir büyüme faktörü (NGF) olarak nanostructured gözenekli silisyum (PSI) filmleri imal için bir protokol mevcut. Nöronal farklılaşma ve PC12 hücreleri ve fareler dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar akıbet üzerine tedavi NGF yüklü PSi taşıyıcıları ile karakterizedir.

Abstract

Rağmen NGF büyük potansiyeli nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için tedavi edici, yönetim protein kimyasal özelliklerine borçlu kan - beyin bariyerini çapraz değil gibi önemli bir sorun temsil eder ve bu nedenle uzun süreli gerektirir biyolojik bir etkiye sahip beyin teslim. Bu işi nanostructured PSi filmleri imalatı NGF parçalanabilir taşıyıcıları bu hassas protein sürekli teslimat için olarak tanımlar. PSi taşıyıcılar özellikle yüksek yükleme etkinliği ve sürekli serbest bırakmak-in NGF onun biyolojik aktivitesi koruma sırasında dört haftalık, bir süre için elde etmek için tasarlandı. NGF-PSi taşıyıcıların NGF teslim sistemi olarak incelenen vitro nöronal farklılaşma ve PC12 hücreleri ve Disosiye DRG nöronlar akıbet ikna etmek için onların yeteneği inceleyerek bir davranıştır. Hücre canlılığı temiz ve NGF yüklü PSi taşıyıcıları huzurunda değerlendirilir. PSi taşıyıcıları serbest NGF bioactivity tekrarlayan ücretsiz NGF idareleri konvansiyonel tedavi için karşılaştırılır. PC12 hücre farklılaşması analiz ve farklılaştırılmış hücrelerin üç farklı morfolojik parametreleri ölçüm tarafından karakterize; (i) (II toplam neurites uzunluğu ve (iii) dallanma noktası sayısını soma ayıklama neurites sayısı. PC12 hücreleri NGF-PSi gemileri ile tedavi yayın süresi boyunca derin bir farklılaşma göstermektedir. Ayrıca, DRG nöronal hücreleri NGF-PSi gemileri ile kültürlü bir geniş neurite inisiyasyon nöronların benzer tekrarlayan ücretsiz NGF idareleri ile tedavi gösterir. Okudu tunable taşıyıcıları nörodejeneratif hastalıklar için tedavi edici bir potansiyel uzun vadeli implantlarda NGF sürülmesi göstermektedir.

Introduction

NGF geliştirilmesi ve periferik sinir sistemi (PNS)1 nöronlarda bakımı için önemlidir ve merkezi sinir sistemi (MSS)2' hayatta kalma ve fonksiyon bazal ön kolinerjik nöronların önemli bir rol oynar. Alzheimer ve Parkinson gibi merkezi nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için yüksek farmakolojik potansiyel yaygın olarak, klinik çalışmalarda Şu anda devam eden3,4,5ile kanıtlanmıştır, 6. En büyük sorun NGF dağıtımını MSS için onun yetersizlik cross kan beyin bariyerini için (BBB) Sistemik yönetilen zaman,7bulunur. Ayrıca, hızlı enzimatik yıkımı NGF duyarlılık onun kısa yarılanma işler ve onun terapötik kullanım8,9önemli ölçüde sınırlar. Bu nedenle, güvenli bir şekilde NGF uzun süreli ve kontrollü yayın için izin teslim sistem tasarımı için karşılanmamış bir meydan okuma. Polimer esaslı sistem, dahil olmak üzere çeşitli NGF teslim sistemleri eğitimi10,11,12,13,14,15, olmuştur 16 , 17. bu sistemlerin yayın profilleri kez nerede ikinci aşamasında yayın oranı ilk seri çekim11 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde düşük bir yavaş sürekli yayın tarafından takip ayrı bir ilk patlama ile karakterize ,18,19. Ayrıca, kapsülleme işlemi sırasında (Örneğin, poly(lactic-co-glycolic) asit) polimerlerin asidik bozulması ürünlerle veya NGF bioactivity kaybı protein inactivation ile bu sistemleri20gözlendi.

Nanostructured PSi, yüksek yüzey alanı, geniş gözenekli birim, biyouyumluluk ve akort çözünebilirlik vücut sıvısının içinde de dahil olmak üzere çeşitli çekici özellikler bir gelecek vaat eden uyuşturucu dağıtım platformu21içinpredestining ile karakterize, 22,23,24,25,26,27,28. Anodization koşulları uygun seçim kolayca uyuşturucu yükleme ve yayın kinetik21,27dikme için PSi yapısal özelliklerini (Örneğin, porozite ve gözenek boyutu) ayarlamak için izin verir. Ayrıca, çeşitli uygun kimyasal yollar PSi yüzeyine değiştirmek ve bununla daha fazla Si iskele fizyolojik koşullar altında çözünme hızı ve uyuşturucu22,24yayın oranları ayarlamak için izin vermek, 29,30.

Bu eser bir PSi tabanlı iletim sistemi için uzun süreli kontrollü serbest bırakmak-in NGF tasarlama üzerinde duruluyor. Nöronal farklılaşma ve akıbet NGF-PSi taşıyıcıları etkisi PC12 hücreleri kullanarak incelenir ve DRG nöronlar ayrışmış. Biz neurite çıkıntı ve tek bir yönetim içinde 1 aylık yayın süresi boyunca derin farklılaşma inducing tarafından yüklenen NGF onun bioactivity korudu göstermek.

Protocol

Tüm yöntemleri Etik Komitesi, Bar Ilan Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. oksitlenmiş PSi (PSiO2) taşıyıcı imalatı

  1. (Tek taraflı < 100 > yüzüne cilalı ve ağır bor katkılı, p-tipi, 0.95 mΩ·cm) Si gofret bir elmas uçlu kalem kullanarak 1,5 cm × 1.5 cm örnekleri kesti.
  2. 400 ° c ortam havası içinde 2 h için bir tüp ocağı Si örneklerinde okside (Isıtma hızı: 25 ° C/dak, doğal soğutma).
  3. Sulu hidroflorik asit (HF) (% 48), GKD2O ve etanol (% 99.9) bir çözüm Si örneklerinde bırakın (1:1:3 v/v/v) 5 dakika; o zaman üç kez etanol örnekleriyle durulama ve azot akış altında kuru.
    Not: Hazırlamak ve plasticware sadece, çözümde HF HF çözer cam saklayın.
    Dikkat: HF son derece korozif sıvı, ve aşırı dikkatle ele alınmalıdır. Maruz kalma durumunda suyuyla iyice durulayın ve HF panzehir jel ile etkilenen bölge tedavi; tıbbi bakım için hemen isteyin.
  4. Alüminyum folyo bir şerit arka kartvizit ve platin bir bobin sayaç elektrot kullanarak Si örnek Politetrafloroetilen gravür hücrede bağlayın.
  5. 3:1 (v/v) çözüm sulu HF ve etanol (% 99.9) 30 kurban bir katmanda etch sabit bir akım yoğunluğu 250 mA/cm2; daha sonra elde edilen PSi yüzeyine etanol ile üç kere çek ve bir azot akış altında Kuru durulama s.
  6. Taze kazınmış gözenekli katmanda 2 min için sulu bir NaOH çözüm (0,1 M) geçiyoruz. Etanol ile üç kez yıkayın ve bir azot akış altında kuru.
  7. Sulu HF (% 48), GKD2O ve etanol (% 99.9) bir çözümde örnek bırakın (1:1:3 v/v) 2 dk için. Etanol ile üç kez yıkayın ve bir azot akış altında kuru.
  8. 3:1 (v/v) çözüm sulu HF ve etanol (% 99.9) 20 Si örnekte mamüllerinin etch sabit bir akım yoğunluğu 250 mA/cm2; daha sonra elde edilen PSi yüzeyine etanol ile üç kere çek ve bir azot akış altında Kuru durulama s.
  9. Termal olarak 800 ° c ortam havası içinde 1 h için bir tüp ocağı taze kazınmış PSi örnekleri okside (Isıtma hızı: 25 ° C/dak, doğal soğutma) bir gözenekli SiO2 (PSiO2) iskele oluşturmak için.
  10. 1 dk. için 4.000 rpm'de olumlu bir kalın fotorezist ile spin-ceket PSiO2 örnekleri; kaplamalı örnekleri için 2 dk 90 ° C'de pişirin (oranı Isıtma: 5 ° C/dak, doğal soğutma).
  11. PSiO2 örnekleri kullanarak küp şeklinde bir testere 8 mm × 8 mm örnekleri zar.
  12. Fotorezist kaldırmak için 3 h için aseton doğranmış örnekleri emmek; etanol ile iyice durulayın ve azot akış altında kuru.

2. PSiO2 NGF ile yükleme

  1. Çözüm yükleme NGF hazırlamak için 1:1 (v/v) çözüm 0.01 M fosfat tamponlu tuz (PBS) ve GKD2O. 400 µL fare β-NGF 20 µg dağıtılması
  2. 52 µL üstünde tepe-in PSiO2 örnek yükleme çözümün ekleyin ve RT kepli bir tabak içinde 2 h için kuluçkaya.
    Not: kuluçka sırasında çözümü kurutma önlemek için tabak içinde yüksek nem korumak.
  3. Çözüm örnek NGF içeriğin PSiO2 taşıyıcı içinde sonraki miktar için üst toplamak.
    Not: NGF yükleme PSiO2 hedeflenen kullanımdan hemen önce gerçekleştirilmelidir, protokol burada kurutma riskini ve denatürasyon protein nedeniyle duraklatılamaz.

3. miktar NGF yükleme NGF ELISA tarafından

  1. ELISA plaka hazırlamak, her şey, plaka mühür ve bir gecede RT. kuluçkaya için 0,5 µg/mL yakalama antikor (tavşan anti-hβ-NGF) 100 µL ekleyin
  2. Sıvı kaldırmak ve dört kez 300 µL yıkama arabelleği kullanarak plaka yıkamak için kuyu Aspire edin (% 0.05 Ara-20 PBS) başına kuyusu; Son yıkama sonra kalan arabellek kaldırmak ve bir kağıt havlu üzerinde leke için plaka tersine çevirin.
  3. Her şey için 300 µL blok arabelleği (%1 sığır serum albumin (BSA) PBS içinde) ekleyin ve RT. en az 1 h için kuluçkaya O zaman Aspire edin ve plaka 3.2 adımda anlatıldığı gibi dört kez yıkayın.
  4. Bir kalibrasyon eğrisi hazırlamak için seyreltik çözüm yükleme NGF (bkz. Adım 2.1) eritici olarak (% 0.05 Ara-20, PBS % 0,1 BSA) 1 ng/ml. Sonra logosuna 2 kat seri dilutions 1 ng/kalibrasyon eğrisi örneklerini almak için sıfır olarak mL gerçekleştirin.
  5. Örnekleri hazırlamak için NGF yükleme çözümü (Kimden adım 2.1) ve (Kimden adım 2.3) toplanan sonrası yükleme çözümü seyreltici 1:100,000 ve 1:10,000 sırasıyla, ELISA kiti (16-1000 pg/mL) kullanımda konsantrasyonları dizi ulaşmak için sulandırmak.
  6. 100 µL seyreltilmiş örneklerinin eklemek ve iyi kalibrasyon eğrisi örnekleri her nüsha ve RT 2s için kuluçkaya; o zaman Aspire edin ve plaka 3.2 adımda anlatıldığı gibi dört kez yıkayın.
  7. Her şey için 1 µg/mL algılama antikor (biotinylated tavşan anti-hβ-NGF) 100 µL ekleyin ve RT 2s için kuluçkaya. O zaman Aspire edin ve plaka 3.2 adımda anlatıldığı gibi dört kez yıkayın.
  8. Eritici avidin-Horseradish peroksidaz (HRP) 1:2,000 sulandırmak, iyi başına 100 µL eklemek ve RT., 30 dk için kuluçkaya Şimdi Aspire edin ve plaka dört kez 3.2 adımda anlatıldığı gibi yıkayın.
  9. Her şey için 100 µL substrat çözeltisi ekleyin ve RT, 25 dk renk geliştirme için kuluçkaya. 405 absorbans ölçmek nm dalga boyu düzeltme ile ayarla 650 nm Mikroplaka Okuyucu kullanarak.
  10. Yükleme çözümü ve kalibrasyon eğrisi üzerinde dayalı toplanan sonrası yükleme çözüm NGF konsantrasyonu belirlemek.
  11. NGF kitle PSiO2 taşıyıcı içinde yüklü hesaplamak için NGF seviye toplanan sonrası yükleme çözümü, çözüm yükleme NGF kütlesi üzerinden çıkarın. NGF yükleme etkinliği Aşağıdaki denklemle hesaplanır:
    Equation

4. vitro NGF yayın PSiO2

  1. PSiO NGF yüklü2 taşıyıcıları 2 ml % 1 ' (w/v) BSA ve %0.02 (w/v) sodyum azid 37 ° C'de ve 100 RPM yörünge ajitasyon altında içeren 0.01 M PBS kuluçkaya.
  2. 2 günde çözüm toplamak ve 2 mL taze PBS ile değiştirin. Sıvı azot içinde toplanan yayın örnekleri donma ve daha fazla analiz için-20 ° C'de depolayın.
  3. Piyasada bulunan NGF ELISA tahlil NGF içerik 3.1-3,9 adımlarda açıklandığı gibi yayın örneklerinde ölçmek için kullanın.
    Not: yayın örnekleri ELISA miktar için hazırlanırken, farklı dilutions (Yani, önceki zaman noktaları çok daha sonraki zaman puan daha seyreltilmiş) yayın dönemi boyunca farklı zaman noktaları için yapılmalıdır. Ayrıca, her yayın örneği için en az iki farklı dilutions gerçekleştirilen ve ELISA kiti konsantrasyonları dizi ulaşmasını sağlamak için sayılabilir.
  4. Kalibrasyon eğrisi üzerinde tabanlı yayın örneklerinde NGF konsantrasyonu belirlemek ve zaman içinde birikmiş NGF sürümü bir grafik çizmek.

5. miktar vitro Si erozyon indüktif birleştiğinde plazma atomik emisyon spektroskopisi (ICP-AES) tarafından

  1. Yayın örnekleri 1:10 çıkış arabelleği (%1 (w/v) BSA ve %0.02 (w/v) sodyum azid içeren 0.01 M PBS) 1 mL toplam hacmi 10 mL için sulandırmak.
  2. Si atomik emisyon tepeler, 212.4, 251.6 ve 288,2 nm seyreltilmiş numune izlemek.
  3. Bir kalibrasyon eğri dayalı örneklerinde si konsantrasyonu belirlemek.
  4. Si bozulması profil kurmak için toplam Si içeriği (Yani, toplu Si içeriğini yayın dönemi boyunca) taşıyıcıların yüzdesi olarak Si içeriği, her zaman bir noktada hızlı.
    Not: taşıyıcıların toplam Si içeriğinin doğru miktar emin olmak için yayın örnekleri belgili tanımlık serbest bırakmak son çalışma ve ICP-AES kullanarak Si konsantrasyon için analiz örneklenen 1 ay şunlardır. Yayın dönemi boyunca toplu Si içerik ve yayın sonrası örnekleri Si içeriğinde özetleme %100 Si içerik sağlar.

6. hücre canlılığı ve büyüme NGF yüklü Psio2 taşıyıcıları varlığında

  1. Sıçan sebepleri (PC12) hücre kültürü
    1. Temel büyüme orta % 10 at serum (HS), % 5 fetal Sığır serum (FBS), %1 L-glutamine, % 1 penisilin streptomisin ve % 0,2 amfoterisin Roselle Park Tıp Enstitüsü (RPMI) orta ekleyerek hazırlayın.
    2. Farklılaşma orta % 1 ekleyerek hazırlamak HS, %1 L-glutamine, % 1 penisilin streptomisin ve % 0,2 amfoterisin RPMI orta.
    3. Hücre süspansiyon bir 75 cm2 kültür şişesi ile temel büyüme ortamının 10 mL (106 hücreleri) için 8 gün büyümek; 2 günde 10 mL temel büyüme ortamının şişesi için ekleyin.
    4. Farklılaşmış PC12 hücre kültürü oluşturmak için hücre süspansiyon bir santrifüj tüpü transfer; hücreler için 200 x g ve RT. atma 8 dk süpernatant santrifüj kapasitesi.
    5. 5 mL taze temel büyüme ortamının hücrelerde askıya alma ve 200 x g ve RT 5 min için hücreleri yeniden santrifüj kapasitesi; süpernatant atın ve hücre Pelet temel büyüme orta 3 mL resuspend.
    6. Hücre kümeleri ayırmak için on kat 23 G kullanarak hücreleri Aspire edin.
    7. Bir hemasitometre hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak ve 104 hücreleri/cm2 çalışma alanı kollajen türü kaplı l plakaları farklılaşma orta huzurunda temel olarak belirler.
    8. 24 saat sonra taze fare β-NGF (50 ng/mL) veya NGF yüklü PSiO2 taşıyıcı plaka başına ekleyin.
      Not: Daha yüksek NGF konsantrasyonları (> 50 ng/mL) belirtilen konsantrasyon tam etkiye sahip.
    9. Farklılaşma Orta 2 günde yenilemek.
    10. Hücre canlılığı değerlendirmek için yüzde 10'u (v/v) canlılık gösterge çözüm (resazurin tabanlı) temsilcisi zaman noktalarda ekleyin ve 37 ° C'de 5 h için kuluçkaya; 490 absorbans ölçmek bir spektrofotometre kullanarak nm.
  2. Fareler Dorsal kök gangliyon (DRG) hücre kültürü
    1. DRGs iki 7 haftalık C57bl fare yalıtmak için ilk % 70 etanol ile fareler söndür ve deri kaldırmak için bir kesik yapın.
    2. Spinal kord maruz kadar kafatası ve karın duvarı kasları kesmiş.
    3. Omurga kalça düzeyinde bir kesim yaparak çıkarın ve çevre dokular temizleyin.
    4. Sütun üç parçalar halinde kesilmiş; sonra her parça iki yarısı üretmek ve omurilik kabuğu orta hat kesilmiş.
    5. Binoküler altında tüm DRG gangliyon ayıklamak ve onları soğuk bir Hank'in dengeli tuz solüsyonu içinde (HBSS) bırakın.
    6. Çevreleyen bağ dokusu üzerinde bir petri DRGs hasretini tarafından temiz ve yavaşça binoküler altında kalan meninkslerde çıkarın.
    7. DRG hücreleri için 20 dk papain 1000 U onları kuluçka tarafından ayırmak.
    8. Hücreler için 400 x gde 4 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet koruyun.
    9. Pelet bir 10 mg/mL collagenase ve 12 mg/mL dispase-II çözüm resuspend ve 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
    10. Hücreler için 400 x gde 2 dk santrifüj kapasitesi; süpernatant atın ve hücre Pelet koruyun.
    11. 1 ml HBSS, 10 mM glikoz ve 5 mM HEPES (pH 7,35) tarafından tekrarlanan bir dar Pasteur pipet geçitle hücre Pelet triturate.
    12. Yavaşça L-15 orta silis tabanlı kolloidal Orta hücre ayrılması için % 20'si tarafından yoğunluk gradient Santrifüjü içeren Disosiye hücreleri ekleyin; Santrifüj 8 dk 1000 x gaz için. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet tutun.
      Not: Bu adımı ayrı ve aksonal enkaz nöronal hücre, Schwann hücreleri ve fibroblastlar arındırmak için amaçtır.
    13. Hücre Pelet 2 mL F-12 orta resuspend; Santrifüj için 2 dk 1000 x g de; süpernatant atın ve pelet 1 mL F-12 orta resuspend.
    14. Hücreleri ve poli-L-lizin tohum 2 × 104 hücre sayısı ve laminin kaplı cam alt 35 mm Kültür yemekleri, % 10 ile desteklenmiş bir ortamda F-12 antibiyotik-Alerjik FBS.
      Not: Başlangıçta, Orta (150-200 µL); küçük hacimli hücrelerde tohum 37 ° C'de 2 h kuluçka orta son hacmi 2 mL için ekleyin.
    15. Yavaşça NGF yüklü PSiO2 taşıyıcı veya taze fare β-NGF (50 ng/mL) plaka başına ekleyin.
    16. 2 gün sonra hücre kültürü RT, 15 dk için %4 paraformaldehyde (PFA) çözüm ile kuluçka tarafından saptamak; immunostain yordam31boyama bir ortak ayirt kullanarak hücre kültürü.
    17. Görüntü confocal bir mikroskop kullanarak nöronal hücre kültürü.

7. hücre farklılaşması Analizi

  1. PC12 hücre farklılaşması yüzde NGF yüklü PSiO2 taşıyıcıları varlığında
    1. PSiO NGF yüklü2 taşıyıcıları farklılaşma orta, bir oksijen kuluçka içeren % 5 CO237 ° C'de 2 ml kuluçkaya.
    2. 2 günde çözüm toplamak ve taze Orta 2 mL ile değiştirin. Sıvı azot içinde toplanan yayın örnekleri donma ve daha fazla analiz için-20 ° C'de depolayın.
    3. Tohum PC12 hücreler 12-şey kolajen kaplı levha talimat olarak Bölüm 4.1 (4.1.3-4.1.6).
    4. 24 saat sonra temsilcisi zaman noktaları (Bölüm 5.1.2) den farklı wells yayın örnekleri tanıtmak; Denetim kuyular için taze fare β-NGF (50 ng/mL) ekleyin.
    5. 24 saat sonra hafif bir mikroskop kullanarak hücreleri görüntü.
    6. Neurite taşıyan hücreleri yüzdesini belirlemek için el ile neurites toplam sayısı görüntüleri dışarı geçmek hücreleri saymak (n = 5 kare her şey için); bir grafiğin yüzde PC12 hücre neurite çıkıntı ile zaman içinde arsa.
      Not: Farklılaşmamış PC12 hücreleri farklılaşmış hücreler neurites (en az bir hücre soma çapına eşit uzunluk alt sınırı) veya morfolojik değişiklikler akıbet tarafından tanımlanabilir iken yapısı olmadan neurites, yuvarlak ortaya çıktı.
  2. Xarakteristikaları analiz farklılaşmış PC12 hücre
    1. Görüntü işleme analizi için tedavi NGF (ücretsiz reaktif veya NGF yüklü PSiO2 taşıyıcıların yayın ürün olarak) sonra 3 gün kadar kültürlü hücre Faz görüntüler elde.
      Not: Sonraki zaman puan (5 gün) ötesinde, son derece karmaşık ağları xarakteristikaları ölçümleri bir tek hücre çözünürlükte önlenmesi, hücreleri geliştirmek.
    2. Download görüntü işleme programı NeuronJ, bir yarı otomatik neurite izleme ve Uzunluk ölçme sağlayan bir ImageJ eklenti.
    3. Resim dosyasının bir 8-bit biçimi ve ölçü piksel görüntü ölçek çubuğu kullanarak mikrometre oranı dönüştürmek.
    4. Analyze kullanarak ölçeği | Ölçeği Ayarla komutu ve ölçü her neurite uzunluğu.
    5. El ile dallanma noktası sayısını ve her hücre soma kaynaklanan neurites sayısını saymak.
      Not: Bir ortalama neurite 1 gün sonra NGF tedavi yaklaşık 30 µm uzunluğudur. Ölçülen neurite uzunlukları yaygın olarak dağıtılabilir.

Representative Results

Oksitlenmiş PSi filmleri iletişim kuralında tanımlandığı gibi cihazlarında. Si gofret için 20 elektrokimyasal gravür tabi tutulur 800 ° c (Şekil 1aiibir PSiO2 iskele üretmeye) termal oksidasyon ardından s 250 mA/cm2 (Şekil 1ai). Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu tarama (HR-SEM) görüntüleri elde edilen PSiO2 film Şekil 1bc. gösterilir Üst-görünüm test (Şekil 1b) filmin gösteriyor çok gözenekli doğası ile gözenekleri yaklaşık 40 nm çapındadır. Kesitsel test cleaved film (Şekil 1 c) 2.9 µm, silindirik gözenekleri birbirine tarafından karakterize gözenekli katman kalınlığı ortaya koymaktadır.

PSiO2 filmleri Şekil 1aiiiiçinde gösterildiği gibi çözüm yükleme NGF ile yüklenir. NGF yükleme öncesi ve sonrası kuluçka PSiO2 filmleri ile yükleme çözümü NGF konsantrasyonlarda ölçerek NGF ELISA kullanarak sayılabilir. PSiO2 film başına yüklenen NGF ortalama kütlesinin % 90'ı (w/w) (veri31gösterilmemiştir) yüksek yükleme etkinliği için karşılık gelen 2.8 ± 0.2 µg olarak belirlenir. PSiO2 gemisi NGF yayın profil oluşturmak için yüklü filmler 37 ° C'de PBS içinde inkübe ve her 2 gün aliquots NGF ELISA kullanarak yayımlanmış protein konsantrasyonu miktar için örnek. Ayrıca, yayın örnekleri Si içeriğinde ICP-AES kullanarak sayısal ve Si erozyon kinetik PSiO2 taşıyıcıların kurulur. Şekil 2 NGF yayın ve gözenekli taşıyıcıların Si bozulması profillerin gösteriyor. NGF, sürekli bir sürümü olmadan patlama etkisi, 1 ay süreyle elde etti. İlk hafta içinde NGF serbest bırakmak daha hızlı (yamaç 0.442 =) daha sonra gün boyunca yayın dönemi (yamaç 0.043) çok daha yavaş bir sürümde göre. Bu tüm 1 aylık yayın süresince piyasaya NGF miktarı daha sonra anlatıldığı gibi derin PC12 hücreleri, farklılaşma ikna için yeterli olması gerekmektedir. Yayımlanan birikmiş NGF iyi bir ilişki olduğu bulunmuştur (R2 0.971 =) kalan Si Şekil 2ilave gösterildiği gibi içerik ile.

Daha sonra bioactivity PSiO NGF yüklü2 taşıyıcıların karakterize vitro, PC12 hücreleri ve DRG nöronlar nöronal farklılaşma ve akıbet için model olarak kullanılır. PC12 hücreleri ve Disosiye DRG nöronlar iletişim kuralında tanımlandığı gibi seribaşı. İlk olarak, hücre canlılığı PSiO2 taşıyıcıları huzurunda temiz (yüklü değil) içeren hücreleri veya NGF yüklü PSiO2kuluçka tarafından incelenir; Denetim plakaları ve temiz PSiO2 ile tedavi hücreleri ile ücretsiz NGF 2 günde eklenmiştir. Hiçbir sitotoksisite maruz PSiO2 bu hücre satırıyla biyouyumlu gösteren temiz ya da NGF yüklü PSiO2 taşıyıcıları (Şekil 3a), hücrelerin üzerine görülmektedir. Şekil 3b temsilcisi HR-SEM filmler NGF yüklü PSiO2 gemileri ile tedavi PC12 hücrelerinin gösterir. Gözlenen hücreleri özü neurites ve form özelliği nöronal ağlar dallı. Ne zaman tohum DRG nöronal hücre NGF yüklü PSiO2 taşıyıcıları huzurunda ayrışmış benzer sonuçlar elde edilir. Bir geniş neurite başlatma ve uzama, (yani, nöronlar ile ücretsiz takıma olumlu Denetimi'ne benzer NGF yüklü PSiO2 taşıyıcıları (Şekil 3e) ile kültürlü immunostained DRG hücrelerinin confocal resimleri göster NGF, şekil 3dbakın), negatif kontrol (yani, tedavi edilmemiş nöronlar, bkz: Şekil 3 c), neurite çıkıntı zavallı bir ölçüde sergiler.

PC12 hücre farklılaşması yüzde PSiO2 taşıyıcıları serbest NGF huzurunda değerlendirmek için farklılaşma neurite yapılan Toplam hücresini nüfus dışında hücrelerle sayarak sayılabilir. Şekil 4 26 günlük süre içinde farklılaşmış hücreler farklı zaman puan yüzdesi açısından sonuçlarını özetler. Önemli farklılaşma yüzde değerlerini eğitimi süresi boyunca elde etti. Özellikle, 26 gün sonra serbest bırakılan NGF farklılaşma % 50, önemli ölçüde daha yüksek önceki çalışmaları polimer esaslı taşıyıcıları16ile karşılaştırıldığında bir farklılaşma yüzde yukarıda indüklenen. Bu sonuçlar gözenekli ana bilgisayar içinde NGF tuzak ~ 1 ay süreyle derin farklılaşma inducing için protein biyolojik aktivitesi korunmuş gösterir.

Daha da nöronal farklılaşma NGF-PSiO2 taşıyıcıları etkisini incelemek için üç karakteristik morfolojik parametreleri farklılaşmış PC12 hücreleri tek hücre düzeyinde ölçülür: (i) neurites ayıklama soma (sayısını II) Toplam neurites uzunluğu ve (iii) dallanma noktaları sayısı. Hücreleri NGF yüklü PSiO2 taşıyıcıları ile veya tekrarlayan yönetimi ile ücretsiz NGF (2 günde), bir denetim olarak kabul edilir. Şekil 5a -c gün 1 ve 3, hücre nüfus xarakteristikaları analizini sunar. PSiO NGF yüklü2 ile tedavi PC12 hücreleri kontrol tedavi tüm üç test parametreleri için benzer xarakteristikaları değerleri gösterir. 3 gün sonra tüm morfolojik parametrelerinin değerlerini aynı oranda NGF yüklü PSiO2 taşıyıcıları ve ücretsiz NGF tekrarlayan yönetimi denetim tedavisi için artan gözlenir.

Figure 1
Resim 1: PSiO2 filmleri imalatı. (a) PSiO2 taşıyıcıların imalat düzeni: (i) Silikon gofret için 20 elektrokimyasal gravür için tabi s 250 mA/cm2, ardından bir PSiO2 iskele ve (iii) NGF tarafından yükleme üretmek için 800 ° c termal oksidasyon (II) fiziksel adsorpsiyon (şemalar çizilmez ölçek). (b-c) Üst-görünüm ve kesit elektron filmler bir karakteristik PSiO2 film. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: NGF yayın ve Si erozyon profilleri NGF yüklü PSiO2 taşıyıcıların. PSiO2 taşıyıcıları bozulma ölçüde gözenekli film toplam Si içeriği dışında her zaman noktasında kalan Si içerik kısmını olarak sunulur. İlave içerik yayımlanan birikmiş NGF ve Si kalan arasındaki ilişkiyi gösterir. Hata çubukları temsil SD, n = 3. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: hücre canlılığı ve büyüme NGF yüklü PSiO2 taşıyıcıları huzurunda. (a) vitro sitotoksisite karakterizasyonu. PC12 hücre canlılığı temiz (yüklü değil) PSiO2 taşıyıcıları, NGF yüklü PSiO2 taşıyıcı veya ücretsiz NGF maruz kaldıkları takip 1, 3 ve 7 gün ölçülür (50 ng/mL 2 günde kontrol levha). (b) elektron filmler PC12 hücre PSiO NGF yüklü2 taşıyıcıları için 9 gün ile kültürlü. Sol kapı aynası: bir zoom-hücre soma; dan neurite çıkıntı tasvir içinde doğru kapı aynası: bir zoom-out son derece karmaşık nöronal ağ gösteren kurdu. (c-e) Confocal mikroskobu görüntüleri immunostained DRG nöronal hücre kültür (2 gün tohum sonra): (c) tedavi edilmezse hücreleri; (d) hücreleri ile takıma ücretsiz NGF (50 ng/mL); (e) NGF-PSiO2 uçak gemisi. Neurofilament H immünfloresan boyama görüntüleme hücre soma ve outgrowing neurites sağlar. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: PC12 hücre farklılaşması yüzde değerlerini maruz NGF NGF yüklü PSiO2 gemisi temsilcisi zaman noktalarda serbest bırakmak için üzerine. Farklılaşma yüzde neurite yapılan Toplam hücresini nüfus dışında bulunan hücrelerin sayısı olarak ifade edilir. Denetim tedavi anlamına gelir ile ücretsiz NGF takıma hücrelere (50 ng/mL). Hücreleri farklı zaman noktalarda görüntülerini temsilcisi ışık mikroskobu, x-ekseni boyunca tasvir edilmektedir; ölçek çubuğu denetimi test için gün 2, 8, 14, 26 ve 50 µm filmler için 25 µm =. Hata çubukları temsil SD, n = 3. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: xarakteristikaları analiz farklılaşmış PC12 hücrelerinin. Farklılaşmış PC12 hücre üç morfolojik parametreleri ölçülen, tek hücre düzeyinde gün 1 ve 3 aşağıdaki pozlama NGF yüklü PSiO2 taşıyıcı veya tekrarlayan yönetimi için ücretsiz NGF 2 günde (kontrol); neurites hücre soma ve (c) numarasını dallanma noktaları ayıklama uzunluğu (b) numarası (bir) Toplam neurites. Hata çubukları temsil SD, n = 3. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Parçalanabilir nanostructured PSiO2 film fabrikasyon ve taşıyıcıları için onun sürekli ve uzun süreli yayın için izin ederken onun biyolojik aktivitesi koruyarak NGF olarak istihdam. PSiO2 potansiyelini NGF için bir iletim sistemi olarak hizmet etmek için yeterli NGF doz nöronal farklılaşma teşvik ve PC12 hücreleri ve DRG nöronlar akıbet teşvik için serbest bırakmak için yeteneklerini göstererek vitro gösterdi. Mühendislik filmleri NGF uzun vadeli rezervuar gelecekteki tedavi içinde vivoiçin kullanılabilir.

Fabrikasyon PSi filmlerin yapısal özellikler özellikle NGF yükü için özel olarak tasarlanmış; akım yoğunluğu elektrokimyasal gravür sürecinin yaklaşık 40 gözenek boyutu elde etmek için ayarlanmış NGF, bir protein 26.5 kDa32 molecular weight ve ~ 4 nm33, karakteristik çapı ile kolayca kapsayan nm gözenekli matris içinde. Ayrıca, gözenekli iskele termal oksidasyonunu NGF fiziksel adsorpsiyon etkinleştirmek için olumsuz ücret oksitlenmiş PSi yüzeye pozitif yüklü proteinin elektrostatik çekim tarafından gerçekleştirildi. Yüzey kimyası psi yükleme etkinliği üzerinde büyük bir etkisi giderek artan ve kolayca yükü ve gözenekli matris arasındaki etkileşimler daha iyi kontrol için ayarlanabilir. Bu etkileşimler daha sonra adsorbe protein molekül yapısını ve onların bioactivity34,35,36dikte. Sonuç olarak, sistem en uygun yükleme NGF dikkatli uygun gözenek boyutu, yüzey özellikleri ve solvent ve belirtilen parametreleri dikte oluşturduğu efekt protein yükleme yükleme ideal seçerek elde etmek için ayarlanmış etkinlik. Bu nedenle, yüzey kimyası (Örneğin, akım yoğunluğu, gravür zaman, türü ve dopant veya elektrolit konsantrasyonu), üretim parametrelerinde değişiklik veya çözüm kompozisyon yükleme yükleme etkinliği ve bioactivity in etkileyebilir zengin protein.

PSi orPSiO2ana bilgisayardan bir yükü yayın oranı genellikle iki eşzamanlı mekanizmaları, yükü moleküllerin geçici difüzyon ve Si iskele37bozulması kombinasyonu tarafından dikte edilir. Erozyon ve sonraki çözünme hızı hastalık durumu28,38,39ve implantasyon site, onun patoloji tarafından etkilenir. Önceki çalışmalarında farklı yayın oranı belirli bir tedavi uygulamasını için gerekliyse, yayın profil değiştirilebilir ve PSi yüzey38,40yüzey kimyası değiştirerek uzun süreli olduğunu kurulduğu, 41. Termal oksidasyon, termal kömürleşme ve hydrosilylation teknikleri, gibi çeşitli kimyasal değişiklikler PSi yüzey stabilize etmek ve onun bozulması ve bunun neticesi olan yükü yayın35,42 etkiler gösterilmiştir ,43,44,45. Kovalent bağlar koptu zaman yük yalnızca yayımlanır çünkü Ayrıca, daha uzun süreli bir sürümde NGF yüklenmesini protein molekülleri kovalent eki Si iskele yolu ile çeşitli yüzey kimyası rotalar için taşıyıcılarda içine sonuçlanmalıdır veya Matrix Si destekleyen21bozulmuş.

Ayrıca, kendi üretim sürecini takiben, PSi microparticles46, nano tanecikleri47 veya müstakil membranlar26da taşıyıcı olarak istihdam edilecek, gibi ince filmlerin yanı sıra çeşitli yapılandırmaları içine işlenebilir NGF ve tanışın belirli uygulama ihtiyaçları için.

Klinik olabilmek için PSiO2 taşıyıcıları NGF içeriğinde terapötik dozlarda aralığını ulaştırılması gerekmektedir. Yöntem iletişim kuralında tanımlanan, NGF yüklü PSiO2 Taşıyıcılar hücre medya 2 mL tutarlı bir hacim içine tanıtıldı veya PBS tamponu ve böylece, yükleme çözümü ve yüklenen ilgili NGF kütle konsantrasyonu verim için ayarlanmış bir Test vitro sistemi için geçerlidir NGF konsantrasyon yayımladı. Ex vivo veya vivo içinde ortamlar gibi farklı sistemler için bu yöntemi kullanan zaman çözüm yükleme NGF konsantrasyon artış ve göre gerekli doz ayarlanması gerekir. Alternatif olarak, daha yüksek NGF içeriği test edilmiş alan başına birden çok taşıma tanıtmak veya PSiO2 örneklerin geniş alanlar kullanarak elde edilebilir.

Ayrıca, bu yayın dönemi boyunca daha sonra zaman noktaları yayımlanan NGF konsantrasyonları çok önceki zaman puan daha düşük olması gerekmektedir. NGF akı zaman içinde sabit değil aslında uygulama ihtiyaçlarına göre sistemini tasarlarken dikkate alınması gerekir.

Sistemleri geliştirilmiştir ve bunların çoğu literatürde bildirilen polimer esaslı sistem olan çok sayıda NGF teslim, sentetik veya doğal polimer oluşan10,11,12,15 conjugates , 16 , 17. bu sistemleri etkili göstermiştir sürekli yayın profilleri, ancak, yayın döneminin önemli patlama etkisi ile birkaç gün süre içinde yayılmış. Kritik sınırlamaları bioactivity farklı teskin ajanlar18,48, yanı sıra gelişmiş ve karmaşık kullanımını gerektiren kapsülleme işlemi üzerine kaybı gibi bazı bu teslim platformlar muzdarip imalat teknikleri16. Proteinler için dağıtım sistemlerinin tasarımında en büyük zorluklardan biri üzerine taşıyıcı sistemi içinde tuzak moleküllerin bioactivity korumak için yeteneğidir. Proteinler veya peptidler bu hassas biomolecules yüklerken iki önemli faktör vardır güçlü organik çözücüler kullanmadan PSi/PSiO2 RT veya daha düşük sıcaklıklarda dahi içine yüklenebilir. Önceki çalışmalarda PSi/PSiO2 yüzey kimyası yüklü proteinler35,36olası denatürasyon en aza indirmek önemli bir rol oynar gösterdi. Bu nedenle, PSi/PSiO2 özellikle dağıtım sistemleri için büyüme faktörleri genel olarak geliştirmek ve NGF avantajlı bir nanomaterial.

Mevcut iş NGF doğrudan yönetimi içine MSS nörodejeneratif hastalıkların potansiyel tedavisi için yeni bir tedavi yaklaşımı olarak bu yöntemi kullanan üzerinde odaklanmıştır. PSiO NGF yüklü2 taşıyıcıları farelerin beyinlerinde implante ve platform olarak uzun vadeli implantlar etkinliğini okudu vivo içindeolduğunu. Ayrıca, bu gelecek vadeden gemileri non-invaziv biolistics49ile birleştirerek,50 bir yüksek uzaysal çözünürlük NGF yüklü PSiO2 parçacıkları bir roman Pnömatik kullanarak yerelleştirilmiş bir alana yönetmek izin verebilir zamanmekansal ilaç idaresi gerekli olduğu nörodejeneratif hastalıklar, tedavi için kılcal tabancası. Ayrıca, NGF nöronal büyüme bir kimyasal degrade şekilde51, akson rehberlik moleküllerine benzer yönlendirebilirsiniz. Bu nedenle, yüklü PSiO2 taşıyıcıları cezbedici sıcak noktalar için NGF büyüme, diğer yönetmenlik cues52,53için tamamlayıcı yönlendirmek için görevi görebilir. Buna ek olarak, PSiO2taşıyıcılar özellikle NGF teslimini birkaç ay kadar bir zaman fazla genişletilmiş süre için PSiO2 nanostructure ve onun yüzey kimyası daha fazla ayarlama tarafından ayakta tutmak için uygun olabilir.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Acknowledgments

MS ve ES Çekirdek Hizmetleri kabul ve yaşam bilimleri ve mühendislik ve Russell Berrie nanoteknoloji Enstitüsü Technion'mali desteği için kamyon ı. Lokey Merkezi'nden destekler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Gadot 830101375
Amphotericin Biological Industries 03-028-1B
Aqueous HF (48%) Merck 101513
AZ4533 photoresist Metal Chem, Inc. AZ4533
BSA fraction v MP biomedicals 0216006950
BSA solution (10%) Biological Industries 03-010-1B
Collagen type l Corning Inc. 354236
Collagenase Enco LS004176
Collagen-coated plastic coverslips NUNC Thermanox 1059846
D-(+)-glucose Sigma-Aldrich Chemicals G8170
Dispase-II Sigma-Aldrich Chemicals 4942078001
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 Abcam ab150073
Ethanol absolute (99.9%) Merck 818760
FBS Biological Industries 04-121-1A
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate Electron Microscopy Sciences 15949
Freon Sigma-Aldrich Chemicals 613894
Guanidine-HCl Sigma-Aldrich Chemicals G7294
Ham's F-12 nutrient mixture Thermo Scientific 11765054
HBSS Thermo Scientific 14185-045
HEPES (1M) Thermo Scientific 15630-056
HS Biological Industries 04-124-1A
Human β-NGF ELISA Development Kit Peprotech 900-K60
Immumount solution Thermo Scientific 9990402
L-15 medium Sigma-Aldrich Chemicals L5520
Laminin Thermo Scientific 23017015
L-glutamine Biological Industries 03-020-1A
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody BiolLegend SMI31P
Murine β-NGF Peprotech 450-34-20
Normal donkey serum (NDS) Sigma-Aldrich Chemicals G9023
Papain Sigma-Aldrich Chemicals p-4762
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences BN15710
PBS (pH 7.4) prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM
NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ).
PBS X10 Biological Industries 02-020-1A
PC12 cell line ATCC CRL-1721
Penicillin–streptomycin Biological Industries 03-032-1B
Percoll Sigma-Aldrich Chemicals p1644
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich Chemicals P4832
PrestoBlue reagent Thermo Scientific A13261
RPMI medium Biological Industries 01-100-1A
Si wafer Siltronix Corp. Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Sodium azide Sigma-Aldrich Chemicals S2002
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich Chemicals S8045
Tannic acid Sigma-Aldrich Chemicals 403040
Triton X-100 Chem-Impex International Inc. 1279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiesmann, C., De Vos, A. Nerve growth factor: structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58, (5), 748-759 (2001).
  2. Dreyfus, C. F. Effects of nerve growth factor on cholinergic brain neurons. Trends in Pharmacological Sciences. 10, (4), 145-149 (1989).
  3. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Intracerebroventricular infusion of nerve growth factor in three patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 9, (5), 246-257 (1998).
  4. Eriksdotter-Jönhagen, M., et al. Encapsulated cell biodelivery of nerve growth factor to the basal forebrain in patients with Alzheimer's disease. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 33, (1), 18-28 (2012).
  5. Eyjolfsdottir, H., et al. Targeted delivery of nerve growth factor to the cholinergic basal forebrain of Alzheimer's disease patients: application of a second-generation encapsulated cell biodelivery device. Alzheimer's Research & Therapy. 8, (1), 30 (2016).
  6. Tuszynski, M. H., et al. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Nature Medicine. 11, (5), 551-555 (2005).
  7. Pan, W., Banks, W. A., Kastin, A. J. Permeability of the blood-brain barrier to neurotrophins. Brain Research. 788, (1), 87-94 (1998).
  8. Thorne, R. G., Frey, W. H. Delivery of neurotrophic factors to the central nervous system. Clinical Pharmacokinetics. 40, (12), 907-946 (2001).
  9. Tria, M. A., Fusco, M., Vantini, G., Mariot, R. Pharmacokinetics of nerve growth factor (NGF) following different routes of administration to adult rats. Experimental Neurology. 127, (2), 178-183 (1994).
  10. Bhang, S. H., et al. The effect of the controlled release of nerve growth factor from collagen gel on the efficiency of neural cell culture. Biomaterials. 30, (1), 126-132 (2009).
  11. Camarata, P. J., Suryanarayanan, R., Turner, D. A., Parker, R. G., Ebner, T. J. Sustained release of nerve growth factor from biodegradable polymer microspheres. Neurosurgery. 30, (3), 313-319 (1992).
  12. Cooper, A., Bhattarai, N., Zhang, M. Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve tissue regeneration. Carbohydrate Polymers. 85, (1), 149-156 (2011).
  13. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, (1), 37 (2016).
  14. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7, (3), 1058-1066 (2015).
  15. Sridhar, R., et al. Electrosprayed nanoparticles and electrospun nanofibers based on natural materials: applications in tissue regeneration, drug delivery and pharmaceuticals. Chemical Society Reviews. 44, (3), 790-814 (2015).
  16. Valmikinathan, C. M., Defroda, S., Yu, X. Polycaprolactone and bovine serum albumin based nanofibers for controlled release of nerve growth factor. Biomacromolecules. 10, (5), 1084-1089 (2009).
  17. Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, (17), 3765-3772 (2002).
  18. Cao, X., Shoichet, M. S. Delivering neuroactive molecules from biodegradable microspheres for application in central nervous system disorders. Biomaterials. 20, (4), 329-339 (1999).
  19. Saltzman, W. M., Mak, M. W., Mahoney, M. J., Duenas, E. T., Cleland, J. L. Intracranial Delivery of Recombinant Nerve Growth Factor: Release Kinetics and Protein Distribution for Three Delivery Systems. Pharmaceutical Research. 16, (2), 232-240 (1999).
  20. Zhu, G., Mallery, S. R., Schwendeman, S. P. Stabilization of proteins encapsulated in injectable poly (lactide- co-glycolide). Nature Biotechnology. 18, 52 (2000).
  21. Anglin, E. J., Cheng, L., Freeman, W. R., Sailor, M. J. Porous silicon in drug delivery devices and materials. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, (11), 1266-1277 (2008).
  22. Canham, L. T., et al. Derivatized mesoporous silicon with dramatically improved stability in simulated human blood plasma. Advanced Materials. 11, (18), 1505-1507 (1999).
  23. Chen, F., et al. Organosilica Nanoparticles with an Intrinsic Secondary Amine: An Efficient and Reusable Adsorbent for Dyes. ACS Applied Materials & Interfaces. 9, (18), 15566-15576 (2017).
  24. Godin, B., et al. Tailoring the degradation kinetics of mesoporous silicon structures through PEGylation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 94A. 4, (4), 1236-1243 (2010).
  25. Kempen, P. J., et al. Theranostic Mesoporous Silica Nanoparticles Biodegrade after Pro-Survival Drug Delivery and Ultrasound/Magnetic Resonance Imaging of Stem Cells. Theranostics. 5, (6), 631-642 (2015).
  26. Low, S. P., Voelcker, N. H., Canham, L. T., Williams, K. A. The biocompatibility of porous silicon in tissues of the eye. Biomaterials. 30, (15), 2873-2880 (2009).
  27. Salonen, J., Kaukonen, A. M., Hirvonen, J., Lehto, V. -P. Mesoporous silicon in drug delivery applications. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, (2), 632-653 (2008).
  28. Tzur-Balter, A., Shatsberg, Z., Beckerman, M., Segal, E., Artzi, N. Mechanism of erosion of nanostructured porous silicon drug carriers in neoplastic tissues. Nature Communications. 6, (2015).
  29. Salonen, J., Lehto, V. -P. Fabrication and chemical surface modification of mesoporous silicon for biomedical applications. Chemical Engineering Journal. 137, (1), 162-172 (2008).
  30. Tzur-Balter, A., Massad-Ivanir, N., Segal, E. Surface Engineered Porous Silicon-based Nanostructures for Cancer Therapy. MRS Proceedings. 1416, (2012).
  31. Zilony, N., et al. Prolonged controlled delivery of nerve growth factor using porous silicon nanostructures. Journal of Controlled Release. 257, 51-59 (2017).
  32. Young, M., Saide, J. D., Murphy, R. A., Arnason, B. G. Molecular size of nerve growth factor in dilute solution. Journal of Biological Chemistry. 251, (2), 459-464 (1976).
  33. Erickson, H. P. Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by. Sedimentation, Gel Filtration, and Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 11, (1), 32 (2009).
  34. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Thermal oxidation for controlling protein interactions with porous silicon. Langmuir. 26, (17), 14316-14322 (2010).
  35. McInnes, S. J., et al. Surface engineering of porous silicon to optimise therapeutic antibody loading and release. Journal of Materials Chemistry B. 3, (20), 4123-4133 (2015).
  36. Prestidge, C. A., et al. Loading and release of a model protein from porous silicon powders. Physica Status Solidi (A. 204, (10), 3361-3366 (2007).
  37. Tzur-Balter, A., Young, J. M., Bonanno-Young, L. M., Segal, E. Mathematical modeling of drug release from nanostructured porous Si: combining carrier erosion and hindered drug diffusion for predicting release kinetics. Acta Biomaterialia. 9, (9), 8346-8353 (2013).
  38. Nieto, A., et al. Surface Engineering of Porous Silicon Microparticles for Intravitreal Sustained Delivery of Rapamycin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, (2), 1070-1080 (2015).
  39. Warther, D., et al. Porous silicon based intravitreal platform for dual-drug loading and controlled release towards synergistic therapy. Drug Delivery. 25, (1), 1537-1545 (2018).
  40. Li, W., et al. Tailoring Porous Silicon for Biomedical Applications: From Drug Delivery to Cancer Immunotherapy. Advanced Materials. 30, (24), 1703740 (2018).
  41. Yazdi, I. K., et al. Physicochemical properties affect the synthesis, controlled delivery, degradation and pharmacokinetics of inorganic nanoporous materials. Nanomedicine. 10, (19), 3057-3075 (2015).
  42. Fry, N. L., Boss, G. R., Sailor, M. J. Oxidation-Induced Trapping of Drugs in Porous Silicon Microparticles. Chemistry of Materials. 26, (8), 2758-2764 (2014).
  43. Jarvis, K. L., Barnes, T. J., Prestidge, C. A. Surface chemistry of porous silicon and implications for drug encapsulation and delivery applications. Advances in Colloid and Interface Science. 175, 25-38 (2012).
  44. Salonen, J., Mäkilä, E. Thermally Carbonized Porous Silicon and Its Recent Applications. Advanced Materials. 30, (24), (2018).
  45. Wang, M., et al. Influence of Surface Chemistry on the Release of an Antibacterial Drug from Nanostructured Porous Silicon. Langmuir. 31, (22), 6179-6185 (2015).
  46. Salonen, J., et al. Mesoporous silicon microparticles for oral drug delivery: loading and release of five model drugs. Journal of Controlled Release. 108, (2), 362-374 (2005).
  47. Park, J. -H., et al. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nature Materials. 8, (4), 331-336 (2009).
  48. Johnson, P. J., Skornia, S. L., Stabenfeldt, S. E., Willits, R. K. Maintaining bioactivity of NGF for controlled release from PLGA using PEG. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 86, (2), 420-427 (2008).
  49. Shefi, O., et al. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, (23), 6119-6123 (2006).
  50. Zilony, N., Tzur-Balter, A., Segal, E., Shefi, O. Bombarding Cancer: Biolistic Delivery of therapeutics using Porous Si Carriers. Scientific Reports. 3, 2499 (2013).
  51. Zuidema, J. M., Provenza, C., Caliendo, T., Dutz, S., Gilbert, R. J. Magnetic NGF-Releasing PLLA/Iron Oxide Nanoparticles Direct Extending Neurites and Preferentially Guide Neurites along Aligned Electrospun Microfibers. ACS Chemical Neuroscience. 6, (11), 1781-1788 (2015).
  52. Baranes, K., Moshe, H., Alon, N., Schwartz, S., Shefi, O. Neuronal Growth on l- and d-Cysteine Self-Assembled Monolayers Reveals Neuronal Chiral Sensitivity. ACS Chemical Neuroscience. 5, (5), 370-376 (2014).
  53. Marcus, M., et al. Interactions of Neurons with Physical Environments. Advanced Healthcare Materials. 6, (15), 1700267 (2017).
Gözenekli silisyum filmleri sinir büyüme faktörü taşıyıcı olarak tasarlama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).More

Rosenberg, M., Zilony, N., Shefi, O., Segal, E. Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor. J. Vis. Exp. (143), e58982, doi:10.3791/58982 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter