提供单细胞灵敏度, 实时流式细胞仪是唯一适合量化多模态受体功能的活培养物。利用成体神经祖细胞, 通过钙指示剂检测钙流入、溴化乙酯吸收的跨膜孔形成和荧光乳胶珠的吞噬作用来评估 P2X7 受体功能。
活细胞流式细胞术越来越多地用于细胞生物学家, 以量化活细胞培养中的生物过程。该协议描述了一种实时细胞流式细胞术的方法, 用于实时分析 P2X7 受体激活的多重功能。使用安装在流式细胞仪上的时间模块, 可以在给定的时间段内评估和绘制活细胞功能, 以探索钙流入、跨膜孔隙形成和吞噬的动力学。这种简单的方法是有利的, 因为 P2X7 受体的所有三个规范功能都可以用一台机器来评估, 随着时间的推移绘制的收集到的数据提供了整个活细胞群体的信息, 而不是经常的单细胞记录使用技术上具有挑战性的膜片钳方法获得。钙流入实验使用钙指示剂, 而 P2X7 孔隙形成检测依靠溴化乙酯被允许通过在高激动剂浓度下形成的跨膜孔。黄绿 (YG) 乳胶珠被用来测量吞噬性。应用特异性激动剂和拮抗剂研究 P2X7 受体活性的影响。单独地, 这些方法可以被修改, 以提供任何数量的钙通道和嘌中华人民共和国和清除剂受体的定量数据。总之, 他们强调了如何使用实时活细胞流式细胞术是一种快速, 具有成本效益, 可重复性, 和可量化的方法来研究 P2X7 受体功能。
嘌中华人民共和国信号转导的研究是广泛和多方面的, 涉及细胞生理学, 生物化学和药理学。Purnetp 信号参与了无数的细胞和分子过程, 从癌症和细胞周期调控到细胞通讯和干细胞生物学;因此, 往往存在一种潜在的调节嘌上的信号转导治疗的好处。在嘌上能受体中, P2X7 受体由于具有多种炎症疾病的治疗靶点潜力, 近年来受到了广泛关注.多年来, 研究受体的方法已经进化并进行了调整, 以促进这项研究 2,3,4,5。本文介绍了一种活细胞流式细胞仪法, 研究 P2X7 受体在成人神经祖细胞中的多重功能, 这些细胞分光法来源于心室下区 (SVZ) 和海马齿状回。
P2X7 受体最初被描述为 P2Z 受体, 或 “细胞死亡” 受体, 因为它的激活与高浓度的三磷酸腺苷 (ATP) 导致形成一个大的跨膜孔渗透分子高达 900 da 6.这导致细胞骨架重组, 跨膜毛孔形成, 并有可能, 细胞凋亡和/或坏死7。传统上, p2x7 的这一功能是通过吸收大分子量染料 (如 yo-pro-1 或溴化乙酯) 来量化的, 当它与 dna 3,8插入时会发光。板材读取器方法是快速的, 并且允许向上缩放, 一般不允许观察动力学。这里描述的方法是基于的吸收, 并允许随着时间的推移观察荧光的增加, 提供了更多的关于孔隙形成速度的信息深度。此后, p2x7 受体被证明有助于一些非免疫功能, 根据接触时间和激动剂浓度9, 10,有不同的反应。通过较低浓度的 ATP 短暂激活导致阳离子流入, 用于神经递质和信号转导 11。使用流式细胞仪测量钙的流入克服了与繁琐且技术上具有挑战性的方法相关的问题, 特别是补丁夹紧以测量内向电流, 这些电流为整个地区的电位变化提供了宝贵的细节细胞膜, 但不允许进行种群分析2。P2x7 受体的第三个功能发生在没有 atp 的情况下, p2x7 受体已被证明有助于免疫系统和神经系统的吞噬9,12,13。显微镜技术的进步使细胞骨架的反应在吸收过程中得以可视化, 尽管定量和种群分析仍然可能带来挑战。
这里详细介绍的活细胞流式细胞仪方法可以实时调查 P2X7 受体的所有三个主要功能。在流式细胞仪上包含时间模块装置, 可在悬浮液中控制温度并持续搅拌细胞。在一秒钟内, 可以提供农化剂和拮抗剂刺激, 几乎不间断地测量细胞反应。这提供了一种快速而简单的方法, 可重复量化功能, 同时避免使用多个检测系统。需要注意的是, 该协议可以很容易地适应任何细胞类型, 并可用于检查其他受体亚型, 因为包括特定的激动剂或抑制剂, 这取决于它们的特性。
本文提出了一种详细的方案, 分析 P2X7 受体在神经祖细胞培养中的功能, 这些受体在成人神经源位的培养中的作用。成人神经祖细胞的潜在应用范围从研究到治疗目的, 因此培养方法必须是稳健和可重复的。此协议有许多关键方面可能会影响终结点区域性的质量。一旦从头骨上取出, 不应允许大脑干燥, 应尽快进行解剖。特别是海马体, 额外注意切除任何血管或膜组织将导致优越的祖细胞产量。分离和三化过程会严重影响在培养中获得的球体数量;在胰蛋白酶 edta 培养过程中搅拌组织将产生更均匀的溶液。强烈建议在 P1000 塑料移液器尖端使用火抛光玻璃牧场移液器, 以减少细胞死亡并改善由此产生的培养。避免过度排尿。尽管采取了这些预防措施, 该程序可以在 P0 培养中产生大量的碎片, 并避免失去祖细胞, 清洗或喂养培养, 应避免, 直到球体形成。
在 P0 下, 海马和 SVZ 培养之间的一些差异将是显而易见的。海马培养产生的球体较少, 这些球体一般都坚持。使用移液器尖端轻轻地提起球体的初始通道。在随后的通道中没有观察到附体。不同品牌的组织培养瓶可能会导致球体, 特别是海马球体, 在菜的底部粘附和生长为菌落。这并没有改变本议定书的任何下游结果, 但应该加以监测, 并应尽可能保持一致性。
以前用于测量 P2X7 受体功能的方法, 如贴片夹紧记录钙的涌入, 既耗时又费力, 可能只提供单个细胞的信息。该协议提出了一种快速、可重复的方法, 可以用一台机器分析 P2X7 受体的所有三大功能。时间分辨活细胞流式细胞仪可进行全群分析, 并为研究人员提供有关钙流入、孔隙形成和吞噬功能的动力学信息。除此之外, 流式细胞术还可以很容易地用作评估标记表达模式和基于细胞大小或蛋白质表达水平的群体分析的方法。
在进行这些实验时, 可以观察到重复次数之间最大钙流入、吸收或吞噬率的差异。为了尽量减少这种情况, 球体大小、培养条件和喂养条件必须一致, 因为细胞的健康将对所取得的结果产生重大影响。冰上的时间也会影响数据, 所以要确保一切都提前准备好, 这样冰上的时间就会最小。确保钙指示剂染料加载时间一致。另一个可能导致最大钙记录大不一致的因素是 ATP 批次之间的差异。ATP 库存的制备至关重要, 应避免在相同的实验中使用不同的批次。还建议比较新旧批次, 以确保 ATP 的一致性。P2X7 拮抗剂的有效性也可能是细胞线和批次相关的, 因此可能需要优化孵育时间和浓度。
值得注意的是, 钙流出是最基本和最复杂的细胞功能之一, 可以通过许多受体介导。Atp 诱导的钙流入, 作为 P2X7 通道/毛孔功能的经典测量, 可能无法准确反映 P2X7 受体的真实功能, 因为 ATP 还可能激活 P2Y 受体释放细胞内钙。在这种情况下, 钡可能是一个更好的阳离子使用, 而不是钙, 因为它的流入是单向16。为了区分钙流入中 P2Y 受体的贡献, 在这种情况下, 可以将 1 mM EDTA 或乙二醇-双 (β-氨基乙醚)-n、N ‘、N ‘–四乙酸 (EGTA) 添加到 K+培养基中, 而不是 CaCl2 。测定。
该协议也可以很容易地适应其他细胞类型, 并可用于研究参与吞噬的替代离子通道受体或受体的功能。这种方法也可以适用于没有时间模块的流式细胞仪。例如, 在常规流式细胞仪分析之前7-8分钟添加 YG 珠子时, 可进行吞噬检测。将细胞保持在 37°c, 并持续旋转。这不会提供实时信息, 但在平均最终荧光的差异仍将告知研究人员有关 P2X7 受体的功能。
对 p2x7 受体作为药物靶标21、22甚至作为药物输送路线的兴趣正在迅速增长, 因此, 研究这种神秘受体的方法必须不断调整和改进。促进这些研究。该协议概述了可用于探索 P2X7 在成人神经祖细胞中的功能的方法, 并希望在神经源位中对 P2X7 受体有更深入的了解, 这可能会导致中风治疗的进步和其他缺血性损伤。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢玛丽亚·卡斯曼和新黄对这项研究的贡献。这项工作得到了丽贝卡·库珀医学研究基金会向 m. w.、t. c. l. 和澳大利亚国家卫生和医学研究委员会 (NHMRC) 和 Baxter 慈善基金会 (澳大利亚悉尼)。B. g. 得到了澳大利亚研究理事会未来研究金 (FT120100581)、NHMRC 项目赠款 (1048082、1048082和 11200995) 以及维多利亚州政府向 Florey 研究所提供的业务基础设施支助赠款的支持。M. l. 得到了国际视网膜研究基金会 (美国) 查尔斯·D·凯尔曼博士奖 (2010年) 的支持。
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |