単一細胞の感度を提供する、リアルタイムのフローサイトメトリー、生活文化のマルチ モーダル受容体機能を定量化する一意に適しています。大人の神経前駆細胞を使用して、P2X7 受容体機能カルシウム インジケーター染料、エチジウム ブロマイド吸収と蛍光のラテックス ビーズを用いた貪食による膜貫通孔形成によって検出されたカルシウム流入によって評価されました。
細胞生物学者の間で生活の生物学的プロセスを定量化する生細胞のフローサイトメトリーをますます使用細胞培養。このプロトコルでは、という生細胞のフローサイトメトリーを拡張リアルタイムで P2X7 受容体活性化の複数の機能の分析方法について説明します。流れの cytometer にインストール時間モジュールを使用すると、生細胞機能が評価され、カルシウム流入、膜貫通細孔形成と貪食能の動態を探索する指定された期間にわたってプロットします。この単純な方法が有利な P2X7 受容体のすべての 3 つの標準的な機能を評価するには、1 台のマシンと印刷時間をかけて収集したデータはしばしば単一セルの録音よりもむしろ全体の生きている細胞集団に情報を提供パッチ ・ クランプの技術的に挑戦的なメソッドを使用して取得。カルシウム流入実験カルシウム インジケーター染料を使用して、P2X7 細孔形成アッセイは、エチジウム ブロマイド、膜の通過を許可されているに依存しています毛穴アゴニスト高濃度時に形成されました。イエロー グリーン (YG) ラテックス ビーズは、貪食能を測定するために利用されています。特定アゴニストおよびアンタゴニストは、P2X7 受容体活性の効果に適用されます。個別に、カルシウム チャネルとプリンとスカベン ジャー受容体の数に量的なデータを提供するこれらのメソッドを変更できます。一緒に取られて、彼らはどのようにリアルタイム生細胞のフローサイトメトリーの使用は P2X7 受容体機能を調査する急速なコスト効果の高い、再現、および定量的な方法を強調します。
プリンがシグナル伝達の研究は広範かつ多面的な細胞生理学、生化学、薬理学を含みます。がんと細胞周期制御細胞細胞コミュニケーションおよび幹細胞生物学、細胞および分子プロセスの数が無限でプリンがシグナル伝達が関与しています。などがしばしばプリン治療効果のシグナル伝達を調節する可能性が存在します。プリン受容体の P2X7 受容体は、多くの炎症性条件1の治療上のターゲットとして近年その潜在性のため大きな注目を受けています。受容体を研究する手法の進歩や長年にわたりこの研究2,3,4,5を容易に合わせられました。ここでは、成人の神経前駆細胞由来 (SVZ) 脳室下帯と海馬歯状回における P2X7 受容体の複数の機能を調査する生細胞流れフローサイトメトリー法について述べる.
P2X7 受容体最初 P2Z 受容体または最大 900 ダ6分子を通す大きな貫通孔の形成により、アデノシン三リン酸 (ATP) の高濃度とその活性化としての「細胞死」の受容体として記述されていた。これは、ため、骨格転位は、貫通孔の形成、および、潜在的に、アポトーシスや壊死7。伝統的に、P2X7 のこの機能は DNA3、8を挟むときに蛍光を発するヨ-プロ-1 またはエチジウム ブロマイドなど大きい分子量染料の通風管によって定量化されます。通常急速なとアップスケー リングを可能にする、プレート リーダー メソッドは動態観察のため許可しません。ここで説明したメソッドの ethidium によって吸収に基づいており深みポア形成の速度についての情報を提供すること、時間をかけて観察する蛍光が増加。P2X7 受容体は、非免疫機能、露出時間とアゴニスト濃度9,10に応じて異なる応答の数を容易にするので示されています。ATP の濃度による簡単な活性化は、神経伝達物質および信号の伝達のための11の目的のため陽イオンの流入で結果します。面倒な技術的に挑戦的なメソッドに関連付けられている問題を克服するカルシウム流入を計るためフローサイトメトリーを使用して-特に、パッチク ランプ法ポテンシャルの変化に関して貴重な詳細を提供する内向きの電流を測定するには細胞膜人口分析2のことはありません。P2X7 受容体の第三の機能は ATP、P2X7 受容体が免疫系と神経系9,12,13の貪食を促進する実証されているがないときに発生します。顕微鏡検査の技術の進歩は、定量化と人口分析することができますまだ課題が吸収過程では、細胞骨格の再編成の可視化を許可しています。
ここで詳細な生細胞流れフローサイトメトリー法はリアルタイムにおける P2X7 受容体のすべての 3 つの主要な機能の調査のためことができます。流れの cytometer で時間モジュール デバイスを含めることにより、温度制御と細胞懸濁液の連続攪拌できます。アゴニストとアンタゴニストの刺激は、細胞応答の近い連続測定を許可する、1 秒以内に配信できます。これは、再現性をもって複数のアッセイ システムの使用を回避しながら機能を定量化する迅速かつ簡単な方法を示します。このプロトコルは任意のセル型に合わせて簡単に適応することがあり、特定のアゴニストまたはそのプロパティによって、阻害剤の封入を与えられた他の受容体サブタイプが確認される可能性がありますに注意してくださいすることが重要です。
大人の神経因性のニッチに由来神経前駆細胞培養における P2X7 受容体機能の解析のための詳しいプロトコルを提案する.大人の神経前駆細胞の潜在的なアプリケーション細胞研究から治療目的の範囲と文化のメソッドは、堅牢かつ再現可能なので。エンドポイント文化の質に影響を与える可能性がありますこのプロトコルの主要な要素の数があります。頭蓋骨から削除されると、脳は乾燥するいけないし、郭清はできるだけ早く実行する必要があります。海馬と特に血管や膜質の組織を削除する余分な注意は優れた前駆細胞の利回りになります。解離と製粉プロセス重く、培養で得られた球の数に影響を与えるトリプシン-EDTA と孵化の間にティッシュを攪拌より均一なソリューションになります。火磨かれたガラスの使用は、細胞死を軽減し生成されたカルチャを向上させる強くお勧めプラスチック ピペット チップ P1000 にピペットを牧草地します。Overtriturating は避けてください。これらの注意にもかかわらず、プロシージャは P0 文化の破片の多くを作成できます、前駆細胞を失うこと、洗濯や文化の餌付けを避けるために球が形成されるまでに避けるべき。
番号違い、海馬、SVZ 文化は P0 で明らかになります。海馬文化収量が少ない球、これらが一般的に従っています。初期の通路の球からそっと持ち上げてピペット チップを使用します。その後通路で付着性球は見られなかった。組織培養のフラスコのさまざまなブランドが、球を引き起こす可能性があります準拠、皿の底の植民地として成長し、特に海馬の球。これはこのプロトコルの下流の結果を変更する見つかりませんでしたが、監視する必要があり、可能な限り一貫性は維持する必要があります。
パッチク カルシウム流入を記録するなど、P2X7 受容体機能を測定するために使用前のメソッドは、時間がかかり、骨の折れる、単一のセルにのみ情報を提供可能性があります。このプロトコルは、P2X7 受容体 1 つのマシンを使用してのすべての 3 つの機能を分析する迅速かつ再現性のある手法を提案します。全体の人口の分析のため時分割住セルイメージ フローサイトメトリーとカルシウム流入、細孔形成および/または貪食能の動態に関する情報を研究者を提供できます。これに加えて、フローサイトメトリーは、マーカー発現パターンとセル サイズやタンパク質発現レベルに基づく母集団解析評価するための方法として簡単に使用できます。
これらの実験を実施する際の繰り返し間隔最大カルシウム流入、エチジウム取り込みや貪食率の違いを観察する可能性があります。これは、球のサイズを最小限に抑える培養条件と供給体制必要があります一貫して細胞の健康は得られた結果に重要な影響を与えます。氷の上にも影響を与えるデータので氷の上には最低限、事前にすべての準備を確認します。カルシウム インジケーターの色素が読み込み時間が一致していることを確認します。最大カルシウム録音の大きな矛盾につながる可能性がありますもう一つの要因は、ATP バッチ間バリエーションです。ATP 株の準備が重要と同じ実験のための異なるバッチの使用は避けるべきであります。ATP が一貫性のあることを確認する古いものと新しいバッチを比較することをもお勧めします。インキュベーション時間と濃度の最適化が必要になる場合がありますので、P2X7 拮抗薬の有効性は細胞ラインとバッチに依存可能性があります。
それはカルシウム流入/流出は最も基本的で複雑な細胞機能の一つ、多くの受容体によって媒介されることができますは注目に値するです。ATP 誘起カルシウム流入 P2X7 チャネル/孔機能の古典的な測定が P2X7 受容体の真の機能を正確に反映しない ATP として可能性がありますもアクティブ P2Y 受容体細胞内のカルシウムを解放します。この場合、バリウムは良い陽の流入は単方向16カルシウムの代わりに使用する可能性があります。このカルシウム流入の P2Y 受容体からの貢献を区別するために代わりに CaCl2 K+中に 1 mM EDTA またはエチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, n ′ n ′ 四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸) が追加条件を使用する可能性があります。試金。
このプロトコルは、他の細胞型に合わせて簡単に適応も可能性があり、代替イオン チャンネル受容体または貪食に参加している受容体の機能を調べるために便利することができます。このメソッドは、time モジュールなし流れ cytometry マシンに適応することがあります。例としては、YG ビーズが従来のフローサイトメトリーによる解析の前に 7-8 分を追加、食作用の試金が行われます。37 ° C で細胞を維持し、継続的にそれらを旋回します。これはリアルタイムの情報を提供することはしませんが、平均の最終的な蛍光の違いはまだ P2X7 受容体の機能に関する研究員をお知らせいたします。
興味 P2X7 受容体薬剤標的21,22または24が急速に成長している薬剤投与ルート23,としても、この謎の受容体を研究する手法を継続的にする必要がありますので適応し、する改良これらの研究を促進します。このプロトコルは大人の神経前駆細胞における P2X7 関数を探索するために使用可能性がある方法論を概説し、神経因性のニッチにおける P2X7 受容体のより大きい理解を達成するため、脳卒中治療の進歩につながることを期待していて、その他の虚血性損傷。
The authors have nothing to disclose.
著者は、この研究への貢献のマリア ・ Kasherman と新黄を感謝したいです。この作品は、国立保健医療研究評議会 (NHMRC) のオーストラリア (571100 と 1048082) とバクスター慈善財団 (から T.C.L.、m. w.、T.C.L.、ミリリットル、レベッカ L. クーパー医療研究財団からの助成金によって支えられました。シドニー、オーストラリア)。B.G. は、オーストラリア研究会議 (ARC) 未来フェローシップ (FT120100581)、NHMRC (1048082、1061419、および 1120095)、プロジェクト助成と Florey 研究所にビクトリア朝の政府の運用インフラストラクチャ サポート助成金によって支持されました。ミリリットルは、ケルマン博士チャールズ d. 博士研究賞 (2010 年) 国際網膜研究財団 (アメリカ) からによって支えられました。
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |