Formålet med denne artikel er at beskrive en protokol til ekstraktion af vandige metabolitter fra kultiverede vedlige celler til metabolomic analyse, især, kapillar elektroforese-massespektrometri.
Metabolomic analyse er en lovende omik tilgang til ikke kun at forstå den specifikke metaboliske regulering i kræftceller sammenlignet med normale celler, men også at identificere biomarkører for tidlig fase kræft påvisning og forudsigelse af kemoterapi respons i Kræftpatienter. Fremstilling af ensartede prøver til metabolomic analyse er et kritisk spørgsmål, der mangler at blive behandlet. Her præsenterer vi en nem og pålidelig protokol til udvinding af vandige metabolitter fra kultiverede vedhæng ende celler til metabolomic analyse ved hjælp af kapillar elektroforese-massespektrometri (CE-MS). Vandige metabolitter fra kultiverede celler analyseres ved dyrkning og vask af celler, behandling af celler med methanol, udvinding af metabolitter og fjernelse af proteiner og makromolekyler med spin kolonner til CE-MS-analyse. Repræsentative resultater ved hjælp af lungecancer cellelinjer behandlet med diamid, et oxidativt reagens, illustrerer den tydeligt observerbare metaboliske forskydning af celler under oxidativ stress. Denne artikel vil være særligt værdifuld for studerende og efterforskere, der er involveret i metabolomik forskning, som er nye til høst metabolitter fra cellelinjer til analyse af CE-MS.
Otto Warburg bemærkede, at kræftceller får den usædvanlige evne til at optage glucose og gæske det til at producere lactat i tilstedeværelse af tilstrækkelig ilt — et fænomen, der betegnes som Warburg-effekt eller aerob glycolyse1,2. Mitokondriel respiration defekter er spekuleret som det underliggende grundlag for aerob glykolyse i kræftceller3. Faktisk, Warburg effekt er grundlaget for tumor billeddannelse ved fluordeoxyglucose (FDG)-Positron emission tomografi (PET), som er meget udbredt i klinisk praksis4,5. En høj hastighed af aerob glykolyse betragtes som et centralt element i kræft og er for nylig blevet vedtaget som en af de velkendte “kendetegn for kræft,” som beskrevet af D. Hanahan og B. Weinberg6. Somatiske mutationer i onkogener og tumor suppressor gener — såsom HRAS/KRAS/NTM, EGFR, BRAF, MYC, TP53, isocitrat dehydrogenase (Idh) og fumarat hydratase (FH ) — har været forbundet med specifikke metaboliske ændringer i kræftceller, menes at være et resultat af Warburg effekt7.
Metabolomic analyse er en lovende tilgang ikke kun at forstå metaboliske regulering i kræftceller, men også at identificere tidlige stadier af kræft biomarkører og kemoterapi respons forudsigelse. Efter behandling af følsomme eller resistente kræftceller med anticancer forbindelser, sporing af deres metaboliske respons letter identifikation af metaboliske biomarkører at forudsige effekten af specifikke anticancer behandlinger hos cancerpatienter8 ,9,10,11. I denne artikel blev kræft cellelinjer afledt af et lunge adenokarcinom med en EGFR -mutation behandlet med diamid – som forårsager oxidativ stress – brugt som modeller for metabolomic analyse. Fordelen ved denne analysemetode med kapillar elektroforese-massespektrometri (CE-MS) er dens omfattende måling af ladede metabolitter med masse området m/z 50-100012,13. Formålet med denne artikel er at give nybegyndere en detaljeret trinvis visuel protokol til fremstilling af vandige metabolitter fra dyrkede cancerceller og efterfølgende metabolomic analyse, især af CE-MS.
Her beskriver vi en alment tilgængelig metode til at forberede metabolitter fra dyrkede kræftceller til CE-MS-baseret metabolomic analyse. Et af de mest kritiske punkter i denne protokol er den korrekte forberedelse af kræftceller, fordi målte metabolit koncentrationer er normaliseret til antallet af levedygtige celler. For nøjagtig vurdering af celletallet er det nødvendigt at forberede mindst én yderligere kultur skål pr. forsøgsgruppe for at tælle antallet af levedygtige celler parallelt med ekstraktion af metabolitter til metabolomic analyse. Desuden bør det samme antal celler seedede i hver skål for replikater og i skålen til optælling; i fremtiden vil dette blive hjulpet af en hurtig og stressor-fri (f. eks. trypsin-fri) celle optællings protokol, der gør det muligt at anvende samme ret til både optælling af levedygtige celler og udvinding af metabolitter. Der skal udvises forsigtighed under vask, så cellerne ikke løsnes fra overfladen af retterne. Svære cytotoksiske tests og andre eksperimenter, der reducerer celle adhæsion, kan være uegnede til denne ekstraktions protokol på grund af potentielt tab af celler under vaskeproceduren.
Det er vigtigt at bruge en 5% mannitol opløsning som vaskebuffer til udvinding af metabolitter fra dyrkede celler til CE-MS-baseret metabolomic analyse, fordi salt-baserede buffere, såsom PBS, interfererer med metabolomic analyse og påvirker målingen negativt.
To eller tre retter kan kombineres som en enkelt prøve ved individuelt at udtrække metabolitter fra hver skål og derefter samleprøver; Kombinationen af flere retter øger dog ofte residualmannitol i den ekstraherede metabolit-opløsning. Dette kan også interferere med metabolomic analyse af CE-MS. Derfor anbefales det ikke at bruge flere retter eller brønde som en enkelt prøve.
Denne metabolomic analysemetode ved hjælp af CE-MS er blevet udviklet til omfattende måling af ladede molekyler med molekylvægte mellem 50 og 1000 da; Derfor er denne protokol optimeret til ekstraktion af vandige, lavmolekylære forbindelser. Derfor er denne protokol ikke egnet til udvinding af hydrofobe metabolitter såsom lipider eller makromolekyler såsom proteiner og nukleinsyrer. Da der er en stigende efterspørgsel efter omfattende lipid-analyser eller lipidomics af dyrkede celleprøver, er det nødvendigt at udvikle en let og effektiv protokol til samtidig ekstraktion af både hydrofile og hydrofobiske metabolitter.
Det første trin af metaboliseringsekstraktionen — aspirerende medium og vaske celler med mannitol — bør udføres så hurtigt som muligt for at minimere ændringer i cellernes metaboliske profil. Behandling af celler med methanol efter vask med mannitol antages at denaturere proteiner og derved forhindre enzymer i at katalysere yderligere metaboliske reaktioner. Men selv efter methanolbehandling kan ikke-enzymatiske kemiske reaktioner — såsom redox-reaktioner, nogle decarboxyleringprocesser og thiol-forbindelser — finde sted. Som sådan bør enhver koncentration af metabolitter, der er involveret i disse reaktioner målt ved denne protokol, fortolkes med forsigtighed. I modsætning til genomet eller transkriptomet består metabolomet af molekyler med en lang række kemiske egenskaber; Derfor kan ingen enkelt protokol udtrække alle metabolitter uden tab eller forstyrrelse. For mere nøjagtige målinger af sådanne meget reaktive metabolitter bør en protokol, der specifikt er konstrueret til at udtrække visse grupper af metabolitter, og som kræver fraktioneringer og derivatiseringer, konsulteres. Den protokol, der præsenteres her, beskriver imidlertid en enkel og hurtig ekstraktion af vandige metabolitter fra kultiverede celleprøver til metabolomic analyse af CE-MS. I dette dokument kunne vi ikke beskrive, hvordan man opretter CE-MS i detaljer, fordi fokus i det nuværende manuskript er anderledes, men beskriver detaljerede skridt til at oprette CE-MS kan kræve en særskilt dedikeret artikel.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle medlemmer af Shonai regional industri Promotion Center for deres hjælp. Dette arbejde blev delvist støttet af forskningsmidler fra Yamagata Prefecture og Tsuruoka City, af National Cancer Center forsknings-og Udviklingsfond [Grant nummer 28-A-9], og af Japan Society for fremme af videnskab (JSPS) KAKENHI [Grant nummer 17K07189] til HM.
Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ・cm pure water |
Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |