इस अनुच्छेद के उद्देश्य के लिए metabolomic विश्लेषण, विशेष रूप से, केशिका electrophoresis-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए सुसंस्कृत आसंजन कोशिकाओं से जलीय चयापचयों के निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है ।
Metabolomic विश्लेषण एक होनहार omics दृष्टिकोण न केवल सामान्य कोशिकाओं की तुलना में कैंसर की कोशिकाओं में विशिष्ट चयापचय विनियमन को समझने के लिए, लेकिन यह भी प्रारंभिक चरण के कैंसर का पता लगाने और कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी के लिए biomarkers की पहचान करने के लिए है कैंसर के मरीज हैं । Metabolomic विश्लेषण के लिए एक समान नमूने की तैयारी एक महत्वपूर्ण मुद्दा है कि दूर किया जा करने के लिए रहता है । यहाँ, हम केशिका electrophoresis-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CE-MS) का उपयोग कर metabolomic विश्लेषण के लिए सुसंस्कृत आसंजन कोशिकाओं से जलीय चयापचयों निकालने के लिए एक आसान और विश्वसनीय प्रोटोकॉल मौजूद. संवर्धित कोशिकाओं से जलीय चयापचयों का विश्लेषण कर रहे हैं और कोशिकाओं को धोने, मेथनॉल के साथ कोशिकाओं के इलाज, चयापचयों निकालने, और CE-MS विश्लेषण के लिए स्पिन स्तंभों के साथ प्रोटीन और अणुओं को हटाने. प्रतिनिधि फेफड़ों के कैंसर सेल diamide, एक ऑक्सीडेटिव अभिकर्मक के साथ इलाज लाइनों का उपयोग कर परिणाम, ऑक्सीडेटिव तनाव के तहत कोशिकाओं के स्पष्ट रूप से नमूनीय चयापचय बदलाव का वर्णन । इस अनुच्छेद के छात्रों और metabolomics अनुसंधान में शामिल जांचकर्ताओं के लिए विशेष रूप से मूल्यवान होगा, जो सेल लाइनों से CE-MS द्वारा विश्लेषण के लिए फसल चयापचयों के लिए नए हैं.
Otto warburg ने कहा कि कैंसर की कोशिकाओं को ग्लूकोज लेने के लिए असामांय करने की क्षमता प्राप्त है और यह पर्याप्त ऑक्सीजन की उपस्थिति में लैक्टेट उत्पादन के लिए किण्व-warburg प्रभाव या एरोबिक ग्लाइकोलिसिस1,2के रूप में बताया घटना । माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दोष कैंसर की कोशिकाओं में एरोबिक ग्लाइकोलिसिस के लिए अंतर्निहित आधार के रूप में speculated हैं3. दरअसल, वारबर्ग प्रभाव ट्यूमर इमेजिंग के लिए आधार है fluorodeoxyglucose (fdg)-पॉजिट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), जो व्यापक रूप से नैदानिक अभ्यास में प्रयोग किया जाता है4,5. एरोबिक ग्लाइकोलिसिस की एक उच्च दर कैंसर की एक प्रमुख विशेषता माना जाता है और हाल ही में एक अच्छी तरह से जाना जाता है के रूप में अपनाया गया है “कैंसर की पहचान,” के रूप में डी Hanahan और बी Weinberg द्वारा वर्णित6। Oncogenes और ट्यूमर दबानेवाला जीन में कायिक म्यूटेशन-जैसे एचरास/kras/एनआरए, egfr, braf, myc, TP53, isocitrate डिहाइड्रोजनेज (idh), और fumarate hydratase (एफ एच )-कैंसर की कोशिकाओं में विशिष्ट चयापचय परिवर्तन करने के लिए जोड़ा गया है, Warburg प्रभाव7का परिणाम माना जाता है ।
Metabolomic विश्लेषण एक आशाजनक दृष्टिकोण न केवल कैंसर की कोशिकाओं में चयापचय विनियमन को समझने के लिए, लेकिन यह भी प्रारंभिक चरण के कैंसर biomarkers और कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया भविष्यवाणी की पहचान करने के लिए है । विरोधी यौगिकों के साथ संवेदनशील या प्रतिरोधी कैंसर कोशिकाओं के उपचार के बाद, उनके चयापचय प्रतिक्रियाओं की ट्रैकिंग कैंसर रोगियों में विशिष्ट विरोधी चिकित्सा की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने के लिए चयापचय biomarkers की पहचान को सुविधाजनक बनाता है8 ,9,10,11. इस लेख में, कैंसर कोशिका लाइनों के साथ एक फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता एक egfr उत्परिवर्तन के साथ माना जाता है, जो ऑक्सीडेटिव तनाव का कारण बनता है-metabolomic विश्लेषण के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया । केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CE-MS) का उपयोग कर इस विश्लेषणात्मक विधि का लाभ व्यापक रेंज m/z 50-100012,13के साथ चार्ज चयापचयों इस अनुच्छेद के प्रयोजन के लिए novices प्रदान करने के लिए एक विस्तृत पदश: सभ्य कैंसर कोशिकाओं और बाद में metabolomic विश्लेषण से जलीय चयापचयों की तैयारी के लिए दृश्य प्रोटोकॉल, विशेष रूप से CE-MS.
यहां, हम एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति का वर्णन करने के लिए CE-MS-आधारित metabolomic विश्लेषण के लिए सभ्य कैंसर कोशिकाओं से चयापचयों तैयार । इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक कैंसर की कोशिकाओं की उचित तैयारी है, क्योंकि मापा metabolite सांद्रता व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को सामान्यीकृत हैं. सेल नंबर के सटीक अनुमान के लिए, यह करने के लिए प्रयोगात्मक समूह के प्रति कम से एक अतिरिक्त संस्कृति पकवान तैयार करने के लिए metabolomic विश्लेषण के लिए चयापचयों के निष्कर्षण के साथ समानांतर में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, कोशिकाओं के एक ही नंबर प्रतिकृति के लिए प्रत्येक डिश में और गिनती के लिए पकवान में वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए; भविष्य में, यह एक त्वरित और stressor से सहायता प्राप्त होगा मुक्त (जैसे, trypsin मुक्त) सेल प्रोटोकॉल है कि एक ही डिश दोनों व्यवहार्य कोशिकाओं और निष्कर्षण metabolites गिनती के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है गणना । देखभाल washes के दौरान लिया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं को व्यंजन की सतह से अलग नहीं है । गंभीर साइटोटॉक्सिसिटी परीक्षण और अंय प्रयोगों है कि सेल आसंजन को कम करने के लिए इस निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं की संभावित हानि के कारण इस निकासी प्रोटोकॉल के लिए अनुपयुक्त हो सकता है ।
यह एक 5% mannitol समाधान के रूप में उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है धोने बफर के लिए संवर्धित कोशिकाओं से चयापचयों से निकालने के लिए CE-MS-आधारित metabolomic विश्लेषण, क्योंकि नमक आधारित बफ़र्स, जैसे PBS, metabolomic विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप और प्रतिकूल माप को प्रभावित.
दो या तीन व्यंजन व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक डिश से चयापचयों निकालने और फिर नमूने पूलिंग द्वारा एक एकल नमूना के रूप में जोड़ा जा सकता है; हालांकि, कई व्यंजनों के संयोजन अक्सर निकाले metabolite समाधान में अवशिष्ट mannitol बढ़ जाती है । यह भी metabolomic विश्लेषण के साथ CE-MS के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. इसलिए, यह एक एकल नमूना के रूप में कई व्यंजन या कुओं का उपयोग नहीं करने के लिए सिफारिश की है.
इस metabolomic विश्लेषण विधि CE-MS का उपयोग ५० और १००० Da के बीच आणविक भार के साथ आवेशित अणुओं के व्यापक मापन के लिए विकसित किया गया है; इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल जलीय, कम आणविक वजन यौगिकों के निष्कर्षण के लिए अनुकूलित है । इसलिए, यह प्रोटोकॉल हाइड्रोफोबिक चयापचयों जैसे कि प्रोटीन और न्यूक्लिक अम्लों जैसे लिपिड्स या मैक्रोलोक्यूल्स को निकालने के लिए उपयुक्त नहीं है । के बाद से वहां व्यापक लिपिड विश्लेषण या संवर्धित सेल नमूनों की lipidomics के लिए एक बढ़ती मांग है, दोनों हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफिलिक चयापचयों के एक साथ निष्कर्षण के लिए एक आसान और प्रभावी प्रोटोकॉल के विकास की जरूरत है ।
Metabolite निष्कर्षण के पहले कदम-aspirating माध्यम और mannitol के साथ कपड़े धोने-कोशिकाओं के चयापचय प्रोफ़ाइल में परिवर्तन को कम करने के लिए के रूप में जल्दी से संभव के रूप में आयोजित किया जाना चाहिए । Mannitol के साथ धोने के बाद मेथनॉल के साथ कोशिकाओं के उपचार denature प्रोटीन करने के लिए ग्रहण कर लिया है और इस तरह आगे चयापचय प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरक से एंजाइमों को रोकने के । हालांकि, मेथनॉल उपचार के बाद भी, गैर एंजाइमेटिक रासायनिक प्रतिक्रियाओं-जैसे रेडॉक्स प्रतिक्रियाओं, कुछ decarboxylation प्रक्रियाओं, और thiol लिंकेज-हो सकता है । इस तरह, इस प्रोटोकॉल द्वारा मापा इन प्रतिक्रियाओं में शामिल चयापचयों के किसी भी सांद्रता सावधानी से व्याख्या की जानी चाहिए. जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम के विपरीत, metabolome रासायनिक गुणों की एक विस्तृत विविधता के साथ अणुओं के होते हैं; इसलिए, कोई एकल प्रोटोकॉल किसी भी हानि या अशांति के बिना सभी चयापचयों निकाल सकते हैं । ऐसे अत्यधिक प्रतिक्रियाशील चयापचयों के अधिक सटीक मापन के लिए, एक प्रोटोकॉल विशेष रूप से चयापचयों के कुछ समूहों को निकालने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो fractionations और derivatizations की आवश्यकता है, परामर्श किया जाना चाहिए । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल, तथापि, का वर्णन करता है एक सरल और त्वरित निष्कर्षण से जलीय चयापचयों का metabolomic विश्लेषण के लिए CE-MS. इस पत्र में हम वर्णन नहीं कर सकता कैसे स्थापित करने के लिए CE-MS विस्तार में क्योंकि वर्तमान पांडुलिपि का ध्यान अलग है, तथापि, विस्तृत कदम का वर्णन करने के लिए CE-MS सेट एक अलग समर्पित लेख की आवश्यकता हो सकती है ।
The authors have nothing to disclose.
हम Shonai क्षेत्रीय उद्योग संवर्धन केंद्र के सभी सदस्यों को उनकी मदद के लिए धंयवाद । इस काम के भाग में यामागाता प्रांत और Tsuruoka शहर से अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित किया गया था, राष्ट्रीय कैंसर केंद्र अनुसंधान और विकास कोष द्वारा [अनुदान संख्या 28-A-9], और विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी द्वारा (JSPS) KAKENHI [अनुदान संख्या 17K07189] एचएम ।
Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ・cm pure water |
Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |