Summary

Характеристика белков по размеру-исключение хроматографии в сочетании с многоугловой рассеяния света (SEC-MALS)

Published: June 20, 2019
doi:

Summary

Этот протокол описывает сочетание хроматографии исключения размера с многоугольным рассеянием света (SEC-MALS) для абсолютной характеристики белков и комплексов в растворе. SEC-MALS определяет молекулярный вес и размер чистых белков, местных олигомеров, гетерокомплексов и модифицированных белков, таких как гликопротеины.

Abstract

Аналитическая хроматография размер-исключения (SEC), обыкновенно используемая для определения молекулярного веса протеинов и белков-белковых комплексов в растворе, относительная техника которая полагается на томе elution analyte для того чтобы оценить молекулярное Вес. Когда белок не является шарокулным или подвергается неидеальным взаимодействиям столбцов, кривая калибровки, основанная на белковых стандартах, недействительна, а молекулярный вес, определяемый из объема elution, неверен. Многоугольное рассеяние света (MALS) является абсолютной техникой, которая определяет молекулярный вес анализа в растворе из основных физических уравнений. Сочетание SEC для разделения с MALS для анализа представляет собой универсальное, надежное средство для характеристики решений одного или нескольких видов белков, включая мономера, местные олигомеры или агрегаты, и гетерокомплексы. Поскольку измерение выполняется на каждом томе elution, SEC-MALS может определить, является ли пик улюлинга однородным или неоднородным, и различать фиксированное молекулярное распределение веса и динамическое равновесие. Анализ модифицированных белков, таких как гликопротеины или липопротеины, или конъюги, такие как моющие средства- имущие мембранные белки, также возможно. Таким образом, SEC-MALS является критическим инструментом для белка химик, который должен подтвердить биофизические свойства и решение поведения молекул, производимых для биологических или биотехнологических исследований. Этот протокол для SEC-MALS анализирует молекулярный вес и размер чистых белковых мономеров и агрегатов. Полученные данные служат основой для дальнейшего анализа SEC-MALS, включая анализы комплексов, гликопротеинов и мембранных белков, связанных с сурфактантами.

Introduction

Надежный анализ молекулярного веса (МВт) белков врастворе необходим для биомолекулярных исследований 1,2,3,4. Анализ МВт информирует ученого, если правильный белок был произведен и если он подходит для использования в дальнейших экспериментах5,6. Как описано на веб-сайтах сетей исследований белков P4EU7 и ARBRE-Mobieu8,контроль качества белка должен характеризовать не только чистоту конечного продукта, но и его олигомерное состояние, однородность, идентичность, конформацию, структуру, изменения после перевода и другие свойства.

Измерение МВт в неденатурном растворе определяет форму белка, присутствующего в водной среде, будь то мономерная или олигомерическая. В то время как для многих белков цель состоит в том, чтобы произвести мономерную форму, для других специфический родной олигомер является ключом к биологической активности9,10,11,12. Другие олигомеры и неместные агрегаты нежелательны и приведут к недостаткам в структурном определении с помощью кристаллографии, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или рассеяния рентгеновских лучей, а также артефактов или неточностей в функциональных анализах количественное связывание по изотермальной титрорационной калорититрии или поверхностного плазмонного резонанса2,13.

В случае биотерапевтических препаратов, таких как моноклональные антитела (mAbs), анализ МВт на основе растворов служит аналогичной цели контроля качества и характеристики продукта. Чрезмерные агрегаты и фрагменты свидетельствуют о нестабильном продукте, который не подходит для использования человеком. Регулирующие органы требуют тщательной характеристики не только терапевтической молекулы, но и потенциальных деградантов, которые могут присутствовать в конечном продукте14,15,16,17.

Некоторые из наиболее распространенных методов анализа белка МВт натрия dodecyl сульфат полиакриламимид гель электрофоресис (SDS-PAGE), капиллярный электрофорес (CE), родной PAGE, масс-спектрометрии (MS), размер исключения хроматографии (SEC) и аналитической ультрацентрифугация (AUC). Из них SDS-PAGE, CE и MS не выполняются в родном штате и обычно приводят к разобщению олигомеров и агрегатов, следовательно, не подходят для определения родного олигомера или количественных агрегатов. Хотя родной PAGE теоретически сохраняет родное состояние, по нашему опыту трудно оптимизировать для многих белков, и результаты не очень надежны. AUC, будь то скорость осадка или равновесие осадочных, является количественным и может определить МВт от первых принципов, но это довольно громоздким, требующих много ручного труда и значительный опыт в интерпретации данных, долгое время эксперимента и очень дорогой инструмент.

Аналитический SEC является количественным и относительно надежным, простым методом, который отделяет макромолекулы во время потока через упакованный столбец. Принципы и приложения SEC хорошо представлены в нескольких обзорах18,19,20 и в справочнике “Размер исключения хроматографии: Принципы и методы”21. Различия в удержании обусловлены различными количествами времени, затрачиваемого на диффузию в поры и из них в стационарной фазе перед eluting от конца столбца. Различия возникают (номинально) от относительных размеров и коэффициентов диффузии молекул22. Кривая калибровки построена с использованием ряда эталонных молекул, связывающих МВт молекулы с объемом elution. Для белков, эталонные молекулы, как правило, хорошо себя ведут, шаровые белки, которые не взаимодействуют с колонкой через заряд или гидрофобных поверхностных остатков. Объем элюционистки измеряется ультрафиолетовым (УФ) детектором абсорбции. Если коэффициент вымирания UV известен-часто высчитанный от последовательности- то общая масса протеина пиковая может также быть количественно.

Примечательно, что анализ МВпом SEC опирается на два ключевых предположения относительно белков, которые будут характериться: 1) они разделяют со стандартами той же конформации и конкретный объем (другими словами, та же связь между свойствами диффузии и MW) и 2) как эталонные стандарты, они не взаимодействуют с колонкой, за исключением стерических свойств- они не придерживаются колонки упаковки по заряду или гидрофобных взаимодействий. Отклонения от этих предположений недействительной кривой калибровки и приводят к ошибочным определениям МВт. Это относится к внутренне неупорядоченных белков, которые имеют большие радиусы Стокса из-за их обширных неструктурированных регионов23,24 или несферических / линейных олигомерных сборок10. Гликозилатные белки, как правило, имеют больший радиус Стокса, чем негликозилатная форма, даже если добавленная углеводная масса учитывается19. Детергентно-растворимые мембранные белки elute по-разному, чем калибровочные белки, потому что их elution от SEC зависит от общего размера комплекса полипептида-детергента-липидов, а не олигомерного состояния и молярной массы белка25 ,26. Химия колонки, рН и условия соли все влияют на объемы elution белков с заряженными или гидрофобных поверхностных остатков27,28.

SEC становится гораздо более универсальным и надежным для определения МВт в сочетании с многоугловым рассеянием света (MALS) и дифференциальнымреющим рефракционным индексом (dRI) детекторами3,4,11,29, 30,31,32. Детектор dRI определяет концентрацию на основе изменения рефракционного индекса раствора из-за присутствия оранжерея. Детектор MALS измеряет пропорцию света, рассеянного анализом, в нескольких углах относительно лазерного луча инцидента. В совокупности известный как SEC-MALS, эта приборация определяет МВт независимо от времени elution, так как МВт может быть рассчитан непосредственно из первых принципов с помощью уравнения 1,

Equation 1(1)

где M молекулярный вес analyte, R(0) уменьшенное коэффициент Rayleigh (т.е., количество света рассеянного по отношению к интенсивности лазера) обусловлено детектором MALS и extrapolated к углу нулю, c концентрация веса, определяемые детектором УФ или DРИ, dn/dc рефракционного индекса приращения аналита (по существу разница между рефракционным индексом опровертела и буфера), и K оптическая константа, которая зависит от системные свойства, такие как длинаволны и рефракционный индекс 29.

В SEC-MALS, колонка SEC используется исключительно для разделения различных видов в растворе, так что они попадают в MALS и концентрации детектор клеток в отдельности. Фактическое время удержания не имеет значения для анализа, за исключением того, насколько хорошо он разрешает вид белка. Инструменты откалиброваны независимо от столбца и не полагаются на эталонные стандарты. Таким образом, SEC-MALS считается “абсолютным” методом определения МВт из основных физических уравнений. Если образец неоднороден и не полностью разделен столбцом, то значение, предусмотренное при каждом объеме elution, будет средним весом молекул в каждом объеме elution, который течет через ячейку потока на один срез времени, приблизительно 75 зл.

Путем анализа угловых вариаций интенсивности рассеяния, MALS может также определить размер (корень среднего квадратного радиуса, Rg) макромолекулики и наночастиц с геометрическим радиусом больше, чем около 12,5 нм29. Для небольших видов, таких как мономерные белки и олигомеры, динамический свет рассеяния (DLS) модуль может быть добавлен в инструмент MALS для измерения гидродинамических радиусов от 0,5 нм и до33.

Хотя либо УФ или DRI анализ концентрации может обеспечить значение c в Eq. 1, использование dRI является предпочтительным по двум причинам: 1) dRI является универсальным детектором концентрации, пригодным для анализа молекул, таких как сахара или полисахариды, которые не содержат УФ-излучение хромофор34; и 2) реакция концентрации dn/dc почти всех чистых протеинов в aqueous буфере такая же к внутри один или 2 процента (0.185 mL/g)35,поэтому никакая потребность знать коэффициент вымирания UV.

Использование SEC-MALS в исследованиях белков довольно обширна. На сегодняшний день наиболее распространенными приложениями являются установление ли очищенный белок является мономерным или олигомерическим и степень олигомеризации, и оценки агрегатов3,10,11,17, 31,36,37,38. Способность сделать это для моющих растворимых мембранных белков, которые не могут быть охарактеризованы традиционными средствами особенно ценится, и подробные протоколы для этого были опубликованы31,39,40 , 41 год , 42 г. , 43. Другие распространенные приложения включают установление степени посттрансляционной модификации и полидисперсности гликопротеинов, липопротеинов и аналогичных конъюги4,31,44 , 45 г. , 46 , 47; образование (или отсутствие таковой) и абсолютная стоихиометрия (в отличие от стоихиометрического соотношения) гетерокомплексов, включая белок-белок, белково-нуклеиновой кислоты и белково-полисахаридные комплексы24,46, 48,49,50,51,52; определение мономерно-димерного равновесия диссоциации постоянной49,53,54; и оценки конформации белка55,56. Помимо белков, SEC-MALS имеет неоценимое значение для характеристики пептидов57,58, широко неоднородные природные полимеры, такие как гепарин59 и хитосаны60,61, небольшой вирусы62 и большинство типов синтетических или обработанных полимеров63,64,65,66. Обширную библиографию можно найти в литературе67 и в Интернете (в http://www.wyatt.com/bibliography).

Здесь мы представляем стандартный протокол для запуска и анализа эксперимента SEC-MALS. В качестве примера для разделения и характеристики белковых мономеров и олигомеров представлен абберов сывороточный альбомин (BSA). Протокол BSA определяет определенные системные константы, которые служат основой для дальнейшего анализа SEC-MALS, включая анализы комплексов, гликопротеинов и мембранных белков, связанных с сурфактантами.

Мы отмечаем, что SEC-MALS может выполняться с использованием стандартной высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC) или быстрого белкового жидкого хроматографии (FPLC) оборудования от многих поставщиков. Этот протокол описывает использование системы FPLC, обычно встречающихся в лабораториях, которые производят белки для исследований и разработок (см. ТаблицуМатериалов). Перед запуском протокола должны были быть установлены системы FPLC, детекторы MALS и dRI, а также соответствующие пакеты программного обеспечения для управления, сбора данных и анализа инструкций производителей и любых необходимых констант калибровки или другие настройки, введенные в программное обеспечение. Между насосом и инжекторам следует поместить влинейный фильтр с гидрофильной, установленной мембраной поры 0,1 мкм.

Protocol

1. Подготовка системы Подключите детекторы MALS и dRI вниз по течению УФ-детектора FPLC. Обойти детекторы рН и проводимости, так как они добавят значительный объем интердетектора между детекторами УФ и MALS. Используйте капиллярные трубки 0,25 мм i.d. от столбца до и между детекторами, и 0,75 мм т.д. капиллярные трубки на выходе детекторов для отходов или фракционного коллектора. Убедитесь, что необходимые сигнальные соединения между FPLC и детекторами были установлены, в том числе аналоговый выход из УФ-детектора на аналоговый вход MALS, и цифровой выход из FPLC в MALS Autoinject, через I/O Box FPLC. Установите подходящую аналитическую колонку SEC, охватывающую диапазон фракционности от не менее 20 кДа до 500 кДА. Проверьте информацию о продукте, чтобы определить, подходит ли столбец для диапазона МВт, рН и других свойств образца и подвижной фазы. 2. Подготовка буфера, f lushing система ночлега и проверка чистоты Используя hPLC-класса реагентов, подготовить 1 л фосфат-буфера сольника с 50 – 100 мм NaCl. Фильтр буфера до 0,1 мкм с помощью флютер-топ полиетер сульфонфильтр ажиотаж или аналогичный. Фильтр первые 50-100 мл буфера в бутылку отходов и отбросить, для того, чтобы устранить частицы из сухих фильтров, а затем фильтровать остаток на чистую, стерильную бутылку, которая была тщательно промывают с фильтрованной, де-ионизированной воды и ограничен, чтобы предотвратить пыли от входа.ПРИМЕЧАНИЕ: Другие мобильные растворители фазы, такие как буфер Tris, могут быть использованы, если будут проанализированы дополнительные белки, которые преимущественно растворяются в этих растворяемых растворяемых в этих растворителях. Промыть ночь на скорости потока 0,5 мл/ мин, или, как иначе рекомендовано производителем столбца, чтобы уравновесить столбец в буфере и удалить частицы. Используйте режим непрерывного потока FPLC и убедитесь, что поток не прекращается до тех пор, пока не будут завершены все запуски SEC-MALS. Поместите ячейку потока dRI в режиме очистки во время ночного флеша. Выключите очистку перед запуском образца. При начале флеша, постепенно нарастить скорость потока, чтобы предотвратить “колонка пролить” эффект (или освобождение частиц), вызванных внезапным изменением давления в столбце. Если система, как известно, довольно стабильна и без частиц, и в равновесии с желаемой мобильной фазы, заменить ночной флеш с более коротким, 2-3 ч флеш. Проверьте чистоту системы, слегка нажав трубки вниз по течению колонны, чтобы освободить накопленные частицы и наблюдая за сигналом в детекторе 90 градусов на фронтальном дисплее прибора MALS. Убедитесь, что пиковый до пиковый шум составляет не более 50 -100 мв.. Выполните “пустую” инъекцию, чтобы убедиться, что инжектор чист от частиц. «Пустой» — это просто бегущий буфер, приготовленный в свежем стерильных флаконах. Если пик частицы не превышает 1 мл в объеме и не более 5 мВт выше базового, то система готова к пробам. В противном случае, выполнять дополнительные пустые инъекции до очистки, или выполнить техническое обслуживание для очистки инжектор. 3. Подготовка и загрузка образца Приготовьте не менее 200 кЛ BSA при 1-2 мг/мл в буфере SEC.ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы предотвратить осадки, BSA никогда не должны быть растворены в чистой воде. Фильтр белка до 0,02 мкм с помощью шприца-наконечник афты фильтра. Откажитесь от первых нескольких капель фильтрата, чтобы исключить частицы из сухих фильтров. Кроме того, центрифуга образца на 10000 х г в течение 15 минут, чтобы позволить осадков нерастворимых агрегатов и других крупных частиц. Введите в петлю 100 л раствора BSA.ПРИМЕЧАНИЕ: Это рекомендуемое количество материала, и более или менее могут быть введены в зависимости от обстоятельств выборки, таких как стабильность или наличие. Количество белка, необходимого для инъекции, меняется обратно с молекулярным весом – в два раза больше массы белка необходимо, если молекулярный вес составляет 33 kDa, или в два раза, что BSA. 4. Подготовка программного обеспечения MALS Открыть новые (ru) Экспериментируйте с методом в меню программного обеспечения MALS и выберите метод Online из папки методов системы рассеяния света. Если детектор DLS присутствует, выберите метод Онлайн из рассеяния света С папкой “ЭЛС”. В разделе Конфигурация набор параметров образца и подвижной фазы. В представлении Generic Pump установите скорость потока на ту, которая используется в FPLC. В представлении Generic Pump, ветвь Solvent, поле имени, выберите PBS. В представлении инжектора, Ветка образца, введите название как BSA, и установите dn/dc 0.185 (стандартное значение для неизмененных протеинов), A2 й 0, и коэффициент вымирания UV 0.667 mL/(mg-cm).ПРИМЕЧАНИЕ: Для других белков, коэффициент вымирания UV280 nm можно найти в литературе или вычислить из его последовательности с использованием различных программных средств общественного достояния. В разделе Процедуры, Представление Базовой Коллекции, выберите флажок Триггер на Autoinject и установите продолжительность запуска до 70 мин, чтобы данные собирались для всего elution до общего объема проницаемости SEC столбец достигнут.ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое количество времени может варьироваться в зависимости от столбца и скорости потока – 35 мин сбора требуется для стандартной 7,8 мм х 300 мм HPLC-SEC колонки на 0,5 мл / мин. Начните эксперимент в программном обеспечении MALS, нажав на кнопку Run. Он начнет считывать данные после получения импульсного сигнала с прибора FPLC через детектор MALS. Нулевой сигнал dRI, нажав кнопку Autozero на передней панели прибора. 5. Подготовка программного обеспечения FPLC Вставьте имя белка и запустить в программном обеспечении FPLC, в Руководстве Выполнение инструкций по эксплуатации Установить знак. Переключите впрыск клапан от ручной нагрузки на впрыскните под пути потока (ru) Инъекционный клапан. Включите импульсный сигнал, вставив 0,5 с импульса под ввоза / O поле Импульс цифровой из. Это вызовет сбор данных в программном обеспечении MALS. 6. Введите образец в петлю. Нажмите Выполните в программном обеспечении FPLC, чтобы начать эксперимент. 7.Анализ данных SEC-MALS BSA Выполняйте анализ, шаг за шагом, в разделе Процедуры в программном обеспечении MALS. Проверить, что пики появляются примерно с тем же объемом elution в УФ, MALS и RI, проверяя представление Basic Collection. В базовом представлении определите базовый упор для всех сигналов (все детекторы LS, УФ и dRI). Базовые линии должны быть определены, чтобы указать уровень чистого растворителя, предпочтительно растяжения с одной стороны пиков образца на другую. В представлении Пикс определите пики, которые необходимо проанализировать, нажав и перетащив мышь. Выберите центральную 50% каждого пика. Сначала выберите мономерный пик (‘Пик 1’), а затем пик димера (‘Пик 2’). Проверить правильные значения dn/dc 0,185 и УФ 280 нм коэффициент амфизии 0,667 для BSA под каждым пиком. Выполните процедуры пикового выравнивания, коррекции и нормализации полос.ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно метод SEC-MALS периодически калибруется для пикового выравнивания, расширения полосы и нормализации угловых детекторов до детектора 90 градусов с использованием монодисперсиального белка с радиусом вращения Rg lt; 10 нм, таких как BSA Мономера. В этом примере BSA служит как молекула калибровки, так и сама является предметом анализа МВТ. В Процедурах Выравнивание зрения, выберите центральную область пиков, нажав и перетащив мышь, нажмите выровнять сигналы, а затем OK. В Процедурах Полоса Расширение зрения, выбрать центральную 50% от мономер пика. Убедитесь, что детектор RI указан как справочныйинструмент, затем нажмите Perform Fit и применить, чтобы соответствовать УФ и LS сигналов к сигналу RI. Увеличьте масштаб до пиков, чтобы убедиться, что они перекрываются очень близко в пределах центрального 50-70%, затем нажмите OK. Если перекрытие не является совершенным, (может быть необходимо) выполнить подходят и “Применить” один или два раза, пока перекрытие отлично. В Процедурах Представление нормализации, выберите Пик 1, введите 3,0 нм в качестве значения R g, нажмите Нормализовать затем OK. В Процедурах Molar Mass и Rg из представления MALS просмотрите данные, чтобы определить, какие углы обнаружения должны быть отбираны из анализа из-за чрезмерного шума. Как правило, это будут нижние углы, в которые частицы пыли рассеивают относительно высокую интенсивность. Выберите отдельные срезы в пределах пиков от графика справа и просмотрите угловую зависимость обратного уменьшенного соотношения Рейли на графике слева. Если нижние (а иногда и самые высокие) углы постоянно сильно отклоняются от припадка, то отослайте их из списка в нижней части представления. Просмотр графика результатов в представлении Графика EASI. Выберите Моляровую массу из дисплея в верхней части окна. Используйте Ctrl и нажмите кнопку и перетащите, чтобы увеличить на пике области. Просмотр окончательных результатов средней средней массы молярной массы для мономерных и димерных пиков в результатах Представление отчета (резюме) под пиковыми результатами Молярные моменты (g/mol) Mw. Чистота сообщается в соответствии с пиковыми результатами (ru) Массовая фракция (%).ПРИМЕЧАНИЕ: Другие молярные моменты массы также показаны; они, как правило, имеют отношение к разнородным полимерам, но не к белкам с дискретными размерами. Многие другие результаты, полученные программным обеспечением, могут быть включены в отчет, такие как процентное восстановление массы (доля белка, который eluted через детектор концентрации относительно количества вводили), пик статистика, polydispersity, Rg и Rh моменты и т.д. При условии, что показатели неопределенности отражают точность приведенного значения, основанного на шуме в серии измерений, и не должны рассматриваться как отражающие точность. Истинная точность заявленных значений зависит от различных факторов, таких как точность предоставленных значений dn/dc и коэффициента вымирания, калибровка приборов и т.д. Из меню файла выберите Сохранить как метод и сохранить проанализированные данные BSA в качестве стандартного метода для будущих измерений всех типов белков. Параметры нормализации и полосометра, определяемые для BSA, будут перенесены в анализ.

Representative Results

Рисунок 1a,b показывает, что три олигомерные формы BSA: мономер, димер и тример, были хорошо разделены на 200-рысивной колонке с базовым разрешением мономера и димера, в то время как рисунок 2a показывает, что разделение на 75-pore колонне не достичь хорошего мономерно-димерного разрешения. Последний пример был включен в качестве примера, иллюстрирующего “плохой” результат; эти различия в разделении для двух столбцов можно, по сути, ожидать в соответствии с заявленными диапазонами разделения производителя. Тример не полностью отделен от димера и высшие олигомеры не очень хорошо отделены от тримера и друг друга. Рисунок 2b является примером шумного сигнала рассеяния света с частицами, присутствующими по всей хроматограмме, что исключает точное определение МВт. Отныне мы сосредоточимся на рисунке 1b. Мономер, который eluted на 13,8 мл, экспонатов средней массы молярной МW 64,1 и 0,4 кДа определяется MALS и гидродинамического радиуса Rч 3,54 и 0,01 нм. Эти результаты согласуются с массой последовательности и известным гидродинамическим радиусом BSA, 66,4 кДа и 3,5 нм соответственно68,в пределах обычной точности SEC-MALS, 5% 3,69. Димер, который eluted на 12 мл, выставлены MW значение 127 и 1 кДА определяется MALS-как ожидалось, в два раза, что мономер в рамках экспериментальной точности и Rч 5,68 и 0,06 нм. Пик тримера также наблюдался на 11 мл с MW 194 и 9 kDa определяется MALS, в три раза больше, чем мономер в экспериментальной точности, как ожидалось. R h тримера не удалось определить из-за низкой интенсивности сигнала DLS. Точки молярной массы, рассчитанные на мономерном пике, являются однородными в пределах 2-5%, что указывает на однородность. Это не редкость, чтобы найти заднее плечо с молярной массой в диапазоне 38-50 kDa, соответствующие BSA фрагменты70. Точки молярной массы через димерические и тримерические пики не являются однородными, что свидетельствует о неоднородности. Пик димера несколько неоднороден из-за следов тримера, которые кровоточат в пик димера, а пик тримера неоднороден из-за совместного улавливания плохо решенных высших олигомеров. Уровень сигнала к шуму мономерного пика вполне приемлем во всех трех сигналах, более 100:1, как и пик димера с сигналом к шуму 40:1. Области хроматограммы за пределами белковых пиков являются плоскими, за исключением пика из-за твердых частиц вблизи общего объема исключения (пустоты) в следе LS и (положительного) пика соли и (негативного) растворенного воздушного пика в следе DRI, близком к общему проницательности Объем. На них указано на рисунке 1а. Уровень чистоты также можно вычислить в эксперименте SEC-MALS: массовая доля мономерного пика в отчете представляет процент чистоты мономерной формы. Для мономера BSA расчетная чистота составляет 88%. Рисунок 1 : SEC-MALS анализ бычьего сывороточных альбумина (BSA) с использованием 200 пор-исключение колонки. Следы хроматограмм нормализуются до мономерного пика и компенсируются для ясности. (A) Общие артефакты, которые могут быть проигнорированы, указываются, в том числе пик частиц ы в начале сигнала рассеяния света, а также соляные и растворенные воздушные пики вблизи общего объема проницаемства в рефракционном сигнале индекса. (B) Хроматограмма демонстрирует отличное разделение мономер-димер-тримера, а сигнал рассеяния света демонстрирует высокий сигнал к шуму. Значения мономеров и димер-МВт обладают высокой однородностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2 : Примеры некачественного анализа SEC-MALS. Следы хроматограмм нормализуются до мономерного пика и компенсируются для ясности. (A) Недостаточное разделение на столбце исключения размера 75 й pore; пик частиц между 8 – 9 мин не хорошо отделены от белков. (B) Недостаточное соотношение сигнала к шуму и обширные частицы, прилегающие к белкам, проявляются в сигнале рассеяния света (LS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Эксперимент SEC-MALS обеспечил хорошее разделение мономеров, димеров и тримера, а также количественные результаты для моляровских масс и гидродинамических размеров каждого пика. Это, в свою очередь, четко определяет и характеризует каждый вид настоящего, а также количественной чистоты. Обычно полученные результаты точны в пределах 5%, а точныеи повторяемые в пределах 1-2% 3,69. Такой уровень точности и повторяемости позволяет уверенно различать виды, которые могут быть близки в МВт, до тех пор, пока они разделены SEC (может частично перекрываться в пределах того же пика). Преимущества контроля качества белка и фундаментальной биофизической характеристики очевидны.

Проверка отсутствия твердых частиц имеет весьма важное значение для чувствительных, повторяющихся измерений SEC-MALS. Пики частиц обычно отображаются как большие сигналы MALS, несопровождаемые сопоставимыми сигналами УФ или RI. Мобильная фаза и образец должны быть тщательно подготовлены для устранения таких частиц. Использование hPLC-класса реагентов или лучше, фильтрация мобильной фазы и буфера разбавления до 0,1 – 0,2 мкм (предварительная промывка фильтра для устранения частиц, которые всегда присутствуют на сухих мембранах), обслуживание внечистынных мобильных фазовых бутылок и других стеклянных изделий для SEC-MALS и расширенное равновесие столбца под потоком (для удаления частиц и агрегатов, которые, возможно, накопились при прекращении потока или не используется столбец). Образец должен быть отфильтрован до наименьшего размера поры, что не удаляет интересуяающего материала, как правило, не более 0,1 мкм и, если возможно, 0,02 мкм. Если фильтр быстро засоряется, образец может быть центрифугирован, отфильтрован поэтапно с нисходящим размером поры и/или повторно очищен. Когда системы постоянно поддерживаются с высококачественной, свежей и фильтруетой мобильной фазой, столбцовые удары предотвращаются, образцы чисты и не соответствуют столбцам, измерения не будут демонстрировать вышеупомянутый шум твердых частиц и обеспечат высококачественные данные.

MALS является агностиком типичных буферов SEC для белков; многие другие буферные системы, кроме PBS, могут быть использованы для оптимизации разделения и стабильности, включая различные excipients71. MALS также агностик для конкретной колонки, которая должна быть выбрана для оптимального разделения и восстановления. Основными проблемами для excipients в отношении анализа являются значительные изменения в рефракционном индексе, что приводит к изменению конкретного рефракционного приращения индекса dn/dc,и excipients, которые поглощают 280 нм, когда УФ-анализ необходим. Например, аргинин является распространенным агрегаторами сокращения excipient, которые могут резко повлиять на dn/dc типичного белка, даже в результате чего его в отрицательный режим (белок с отрицательным dn/dc все еще может быть проанализирован SEC-MALS, если dn/ dc определяется эмпирически, но если dn/dc 0 интенсивность света, рассеянного белком, будет нулевым, а анализ МВт будет невозможен). Тема значений dn/dc для белков широко обсуждается Чжао и др.35, где показано, что для стандартных ваковых буферов подавляющее большинство неизмененных белков подпадают под 2-3% от стандартного значения (0,185 или 0,186 мл/г при 660 нм) , хотя белки ниже 10 кДа являются более переменными, и есть несколько видов, которые могут достигать 0,21 мл/г.

Профили MW через мономер BSA и димер пики в представленных данных были довольно однородными в пределах 2% или менее, что указывает на монодисперсные виды. Неравномерные значения МВт на пике могут возникнуть из-за неоднородности или неправильного анализа. В частности, профиль BSA MW, который является вогнутым (‘улыбка’) или выпуклым (‘grimace’) может возникнуть из-за неправильного применения коррекции полосы. Для других белков выпуклый профиль может также возникнуть из динамического равновесия между мономерами и олигомерами, где соотношение мономера к олигомеру – и, следовательно, очевидное значение МВт зависит от пиковой концентрации (BSA не проявляет такого поведения и часто используется контрольный образец для проверки правильных параметров расширения полосы). Профиль МВт, который варьируется от ведущего к задней кромке и не изменяется с концентрацией образца, характерен для распределения молекулярных видов веса, которые частично разрешены SEC. источники явно неоднородных распределений путем введения различных общих количеств белка- распределение будет варьироваться в зависимости от динамического равновесия, но не с фиксированным распределением или неправильной коррекцией полосы.

Учитывая ограничения, описанные выше, SEC-MALS не подходит для выполнения различных задач. Он не подходит для анализа образцов сырой нефти; образцы должны быть хорошо очищены стандартными методами сродства и полировки. Он не имеет достаточной точности или разрешителяя силы для выявления мутантов и вариантов белка или mAb с той же или очень близкой массой, и не может быть использован с анализами, которые не развеяются или отделены от столбца SEC, хотя недавно было показано, что ион-эксчан e или хроматография обратной фазы может быть объединена с MALS для разделения и характеристики видов, которые не решены SEC72,73,74. В тех случаях, когда количество белка сильно ограничено, SEC-MALS может быть неосуществимым, поскольку обычно требуется 10 – 200 мкг3 и даже больше, может потребоваться системе FPLC с внутренним диаметром труб более 0,25 мм; однако меньшие количества могут быть проанализированы UHPLC-SEC-MALS. Высоко нестабильные белки, которые агрегируются после введения в мобильную фазу, не подходят для анализа SEC-MALS, хотя оптимизация буфера с использованием автономного динамического рассеяния света может преодолеть эту проблему75.

Несмотря на дополнительные усилия, которые влечет за собой SEC-MALS, он имеет неоценимое значение для исследования белка и широко используется академическими и биофармацевтическими сообществами. В дополнение к характеристике мономеров, олигомеров и агрегатов, описанных в вышеупомянутом протоколе, SEC-MALS может охарактеризовать модифицированные белки, такие как гликопротеины (определение МВ белка и гликановых компонентов индивидуально), сурфактант- или липидно-растворимые мембранные белки (определяющие МВТ белков и компонентов растворителя по отдельности), белковые сборки, такие как вирусоподобные частицы, белково-белковые и белково-нуклееновые кислотные комплексы, полисахариды, белок-полисахарид конъюгирует, пептиды и многие другие биомакромолекулы.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-ра Цафи Даниэли (Вольфсонский центр прикладной структурной биологии, Еврейский университет) за советы и сотрудничество. Мы также благодарим Daniel Biotech Ltd. (Rehovot, Израиль) за помощь и создание аналитической системы FPLC-MALS, использованной в данном исследовании.

Materials

AKTA pure GE Healthcare 29-0182-26 fast protein liquid chromatograph (FPLC) 
AKTA UNICORN GE Healthcare FPLC control software
ASTRA Wyatt Technology MALS data acquisition and analysis software
Bovine serum albumine (purity >97%) Sigma  A1900 analyte
DAWN or miniDAWN Wyatt Technology WH2 or WTREOS multi-angle light scattering (MALS) detector
Increase 200 10/300 GE Healthcare size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length
Optilab Wyatt Technology WTREX differential refractive index (RI) detector
Sodium chloride NaCl Sigma  71382 HPLC grade NaCl
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL  Millipore SCVPU11RE mobile phase filter
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm GE Healthcare 6809-1002 sample filter
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter GE Healthcare 6809-1012 sample filter
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm GE Healthcare 6809-2012 mobile phase filter
WyattQELS Wyatt Technology WIQ dynamic light scattering detector

References

  1. Acton, T. B., et al. Robotic cloning and Protein Production Platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Methods in Enzymology. 394, 210-243 (2005).
  2. Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 493, 21-60 (2011).
  3. Folta-Stogniew, E., Williams, K. R. Determination of molecular masses of proteins in solution: Implementation of an HPLC size exclusion chromatography and laser light scattering service in a core laboratory. Journal of Biomolecular Technology. 10 (2), 51-63 (1999).
  4. Kendrick, B. S., Kerwin, B. A., Chang, B. S., Philo, J. S. Online size-exclusion high-performance liquid chromatography light scattering and differential refractometry methods to determine degree of polymer conjugation to proteins and protein-protein or protein-ligand association states. Analytical Biochemistry. 299 (2), 136-146 (2001).
  5. Hughes, C. S., Longo, E., Phillips-Jones, M. K., Hussain, R. Quality control and biophysical characterisation data of. Data Brief. 14, 41-47 (2017).
  6. Muthurajan, U., et al. In Vitro Chromatin Assembly: Strategies and Quality Control. Methods in Enzymology. 573, 3-41 (2016).
  7. P4EU. . Protein Quality Standard PQS. , (2019).
  8. Arbre Mobieu. . Guidelines on Protein Quality Control. , (2019).
  9. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  10. Bowman, G. R., et al. Oligomerization and higher-order assembly contribute to sub-cellular localization of a bacterial scaffold. Molecular Microbiology. 90 (4), 776-795 (2013).
  11. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods in Molecular Biology. 328, 97-112 (2006).
  12. Vieux, E. F., Wohlever, M. L., Chen, J. Z., Sauer, R. T., Baker, T. A. Distinct quaternary structures of the AAA+ Lon protease control substrate degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), E2002-E2008 (2013).
  13. Group, N.S.. . use of SEC-MALS in crystallization QC. , (2018).
  14. Ahrer, K., Buchacher, A., Iberer, G., Josic, D., Jungbauer, A. Analysis of aggregates of human immunoglobulin G using size-exclusion chromatography, static and dynamic light scattering. Journal of Chromatography A. 1009 (1-2), 89-96 (2003).
  15. Narhi, L. O., Schmit, J., Bechtold-Peters, K., Sharma, D. Classification of protein aggregates. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (2), 493-498 (2012).
  16. Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
  17. Philo, J. S. A critical review of methods for size characterization of non-particulate protein aggregates. Current Pharmaceutical Biotechnology. 10 (4), 359-372 (2009).
  18. Stellwagen, E. Gel filtration. Methods in Enzymology. 463, 373-385 (2009).
  19. Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).
  20. Striegel, A. M., Yau, W. W., Kirkland, J. J., Bly, D. D. . Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. , (2009).
  21. GE Healthcare. . Size Exclusion Chromatography: Principles and Methods. , (2014).
  22. Uliyanchenko, E. Size-exclusion chromatography-from high-performance to ultra-performance. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6087-6094 (2014).
  23. Dunker, A. K., Silman, I., Uversky, V. N., Sussman, J. L. Function and structure of inherently disordered proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 756-764 (2008).
  24. Hsiao, H. H., Nath, A., Lin, C. Y., Folta-Stogniew, E. J., Rhoades, E., Braddock, D. T. Quantitative characterization of the interactions among c-myc transcriptional regulators FUSE, FBP, and FIR. Biochemistry. 49 (22), 4620-4634 (2010).
  25. Hayashi, Y., Takagi, T., Maezawa, S., Matsui, H. Molecular weights of alpha beta-protomeric and oligomeric units of soluble (Na+, K+)-ATPase determined by low-angle laser light scattering after high-performance gel chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 748 (2), 153-167 (1983).
  26. Folta-Stogniew, E. J. Macromolecular Interactions: Light Scattering. Encyclopedia of Life Sciences. , (2009).
  27. Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography and Related Technology. 35 (20), 2923-2950 (2012).
  28. Chakrabarti, A. Separation of Monoclonal Antibodies by Analytical Size Exclusion Chromatography. Antibody Engineering. , (2018).
  29. Wyatt, P. J. Light scattering and the absolute characterization of macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272, (1993).
  30. Takagi, T. Application of low-angle laser light scattering detection in the field of biochemistry: review of recent progress. Journal of Chromatography A. 506, 51-63 (1990).
  31. Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
  32. Mogridge, J. Using light scattering to determine the stoichiometry of protein complexes. Methods in Molecular Biology. 1278, 233-238 (2015).
  33. Larkin, M., Wyatt, P. J. Light-Scattering Techniques and their Application to Formulation and Aggregation Concerns. Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing Biopharmaceuticals. , (2010).
  34. Wolfender, J. L. HPLC in Natural Product Analysis: The Detection Issue. Planta Medica. 75 (07), 719-734 (2009).
  35. Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. On the distribution of protein refractive index increments. Biophysical Journal. 100, (2011).
  36. Serebryany, E., Folta-Stogniew, E., Liu, J., Yan, E. C. Homodimerization enhances both sensitivity and dynamic range of the ligand-binding domain of type 1 metabotropic glutamate receptor. FEBS Letters. 590 (23), 4308-4317 (2016).
  37. Arakawa, T., Wen, J. Size-exclusion chromatography with on-line light scattering. Current Protocols in Protein Science. Chapter 20, Unit 20.6 (2001).
  38. Müller, R., et al. High-resolution structures of the IgM Fc domains reveal principles of its hexamer formation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (25), 10183-10188 (2013).
  39. Slotboom, D. J., Duurkens, R. H., Olieman, K., Erkens, G. B. Static light scattering to characterize membrane proteins in detergent solution. Methods. 46 (2), 73-82 (2008).
  40. Miercke, L. J., Robbins, R. A., Stroud, R. M. Tetra detector analysis of membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 77, 1-30 (2014).
  41. Gimpl, K., Klement, J., Keller, S. Characterising protein/detergent complexes by triple-detection size-exclusion chromatography. Biological Procedures Online. 18 (1), 4 (2016).
  42. Korepanova, A., Matayoshi, E. D. HPLC-SEC characterization of membrane protein-detergent complexes. Current Protocols in Protein Science. Chapter 29, 1-12 (2012).
  43. Roy, A., Breyton, C., Ebel, C. Analytical Ultracentrifugation and Size-Exclusion Chromatography Coupled with Light Scattering for Characterization of Membrane Proteins in Solution. Membrane Proteins Production for Structural Analysis. , (2014).
  44. Hastie, K. M., et al. Crystal structure of the prefusion surface glycoprotein of the prototypic arenavirus LCMV. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (6), 513-521 (2016).
  45. Pallesen, J., et al. Structures of Ebola virus GP and sGP in complex with therapeutic antibodies. Nature Microbiology. 1 (9), 16128 (2016).
  46. Micoli, F., Adamo, R., Costantino, P. Protein Carriers for Glycoconjugate Vaccines: History, Selection Criteria, Characterization and New Trends. Molecules. 23 (6), (2018).
  47. Li, J., et al. Characterizing the Size and Composition of Saposin A Lipoprotein Picodiscs. Analytical Chemistry. 88 (19), 9524-9531 (2016).
  48. Crichlow, G. V., et al. Dimerization of FIR upon FUSE DNA binding suggests a mechanism of c-myc inhibition. EMBO Journal. 27 (1), 277-289 (2008).
  49. Kapoor, N., Gupta, R., Menon, S. T., Folta-Stogniew, E., Raleigh, D. P., Sakmar, T. P. Nucleobindin 1 is a calcium-regulated guanine nucleotide dissociation inhibitor of G{alpha}i1. Journal of Biological Chemistry. 285 (41), 31647-31660 (2010).
  50. Pirruccello, M., Swan, L. E., Folta-Stogniew, E., De Camilli, P. Recognition of the F&H motif by the Lowe syndrome protein OCRL. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (7), 789-795 (2011).
  51. Lockyer, K., Gao, F., Derrick, J. P., Bolgiano, B. Structural correlates of carrier protein recognition in tetanus toxoid-conjugated bacterial polysaccharide vaccines. Vaccine. 33 (11), 1345-1352 (2015).
  52. Steinbach, T., Wurm, F. R. Degradable Polyphosphoester-Protein Conjugates: "PPEylation" of Proteins. Biomacromolecules. 17 (10), 3338-3346 (2016).
  53. Das, S., Stivison, E., Folta-Stogniew, E., Oliver, D. Reexamination of the role of the amino terminus of SecA in promoting its dimerization and functional state. Journal of Bacteriology. 190 (21), 7302-7307 (2008).
  54. Reshetnyak, A. V., et al. The strength and cooperativity of KIT ectodomain contacts determine normal ligand-dependent stimulation or oncogenic activation in cancer. Molecular Cell. 57 (1), 191-201 (2015).
  55. Zambelli, B., et al. a Chaperone in the Urease Assembly Process, Is an Intrinsically Unstructured GTPase That Specifically Binds Zn2+. Journal of Biological Chemistry. 280 (6), 4684-4695 (2005).
  56. Ren, X., et al. Hybrid Structural Model of the Complete Human ESCRT-0 Complex. Structure. 17 (3), 406-416 (2009).
  57. Moriarty, D. F., Fiorillo, C., Miller, C., Colón, W. A truncated peptide model of the mutant P61A FIS forms a stable dimer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1774 (1), 78-85 (2007).
  58. la Garza, C. E., Miranda-Hernández, M. P., Acosta-Flores, L., Pérez, N. O., Flores-Ortiz, L. F., Medina-Rivero, E. Analysis of therapeutic proteins and peptides using multiangle light scattering coupled to ultra high performance liquid chromatography. Journal of Separation Science. 38 (9), 1537-1543 (2015).
  59. Beirne, J., Truchan, H., Rao, L. Development and qualification of a size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering method for molecular weight determination of unfractionated heparin. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (2), 717-725 (2011).
  60. Wang, W., et al. A new green technology for direct production of low molecular weight chitosan. Carbohydrate Polymers. 74 (1), 127-132 (2018).
  61. Kaderli, S., et al. A novel biocompatible hyaluronic acid-chitosan hybrid hydrogel for osteoarthrosis therapy. International Journal of Pharmaceutics. 483 (1-2), 158-168 (2015).
  62. Porterfield, J. Z., Zlotnick, A. A Simple and General Method for Determining the Protein and Nucleic Acid Content of Viruses by UV Absorbance. Virology. 407 (2), 281-288 (2010).
  63. Podzimek, S. The use of GPC coupled with a multiangle laser light scattering photometer for the characterization of polymers. On the determination of molecular weight, size and branching. Journal of Applied Polymer Science. 54 (1), 91-103 (1994).
  64. Podzimek, S., Vlcek, T., Johann, C. Characterization of branched polymers by size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering detector. I. Size exclusion chromatography elution behavior of branched polymers. Journal of Applied Polymer Science. 81 (7), 1588-1594 (2001).
  65. Podzimek, S. Importance of Multi-Angle Light Scattering in Polyolefin Characterization. Macromolecular Symposia. 330 (1), 81-91 (2013).
  66. Tarazona, M. P., Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1), 95-116 (2003).
  67. Minton, A. P. Recent applications of light scattering measurement in the biological and biopharmaceutical sciences. Analytical Biochemistry. 501, 4-22 (2016).
  68. Hirayama, K., Akashi, S., Furuya, M., Fukuhara, K. Rapid confirmation and revision of the primary structure of bovine serum albumin by ESIMS and frit-FAB LC/MS. Biochemical and Biophysical Research Communications. 173 (2), 639-646 (1990).
  69. Zhu, H., Ownby, D. W., Riggs, C. K., Nolasco, N. J., Stoops, J. K., Riggs, A. F. Assembly of the gigantic hemoglobin of the earthworm Lumbricus terrestris. Roles of subunit equilibria, non-globin linker chains, and valence of the heme iron. The Journal of biological chemistry. 271 (47), 30007-30021 (1996).
  70. Peters, T., Feldhoff, R. C. Fragments of bovine serum albumin produced by limited proteolysis. Isolation and characterization of tryptic fragments. Biochemistry. 14 (15), 3384-3391 (1975).
  71. Lebendiker, M., Danieli, T. Production of prone-to-aggregate proteins. FEBS Letters. 588 (2), 236-246 (2014).
  72. Amartely, H., Avraham, O., Friedler, A., Livnah, O., Lebendiker, M. Coupling Multi Angle Light Scattering to Ion Exchange chromatography (IEX-MALS) for protein characterization. Scientific Reports. 8 (1), 6907 (2018).
  73. Astafieva, I. V., Eberlein, G. A., John Wang, Y. Absolute on-line molecular mass analysis of basic fibroblast growth factor and its multimers by reversed-phase liquid chromatography with multi-angle laser light scattering detection. Journal of Chromatography A. 740 (2), 215-229 (1996).
  74. Onsberg, M., Øgendal, L. H., Jensen, M. L., Howells, L. B., Andersen, B., Bjerrum, M. J. Light scattering coupled with reversed phase chromatography to study protein self-association under separating conditions. Journal of Chromatography B. 938, 60-64 (2013).
  75. Kim, Y., et al. High-throughput protein purification and quality assessment for crystallization. Methods. 55 (1), 12-28 (2011).

Play Video

Cite This Article
Some, D., Amartely, H., Tsadok, A., Lebendiker, M. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). J. Vis. Exp. (148), e59615, doi:10.3791/59615 (2019).

View Video