Detta protokoll beskriver kombinationen av storlek uteslutningskromatografi med flera vinklar ljus spridning (SEC-MALS) för absolut karakterisering av proteiner och komplex i lösning. SEC-MALS bestämmer molekyl vikt och storlek på rena proteiner, infödda oligomerer, heterokomplex och modifierade proteiner som glykoproteiner.
Analytisk storlek-uteslutningskromatografi (SEC), som vanligen används för bestämning av molekyl vikten hos proteiner och protein komplex i lösning, är en relativ teknik som förlitar sig på analyternas elutionsvolym för att uppskatta molekyl ära Vikt. När proteinet inte är globulärt eller genomgår icke-ideala kolonninteraktioner är kalibrerings kurvan baserad på protein standarderna ogiltig, och den molekyl vikt som bestäms av elutionsvolymen är felaktig. Flervinkelljus spridning (MALS) är en absolut teknik som bestämmer molekyl vikten för en analyt i lösning från grundläggande fysikaliska ekvationer. Kombinationen av SEC för separation med MALS för analys utgör en mångsidig, pålitlig metod för att karakterisera lösningar av en eller flera protein arter inklusive monomerer, infödda oligomerer eller aggregat, och heterokomplex. Eftersom mätningen utförs vid varje elutionsvolym kan SEC-MALS avgöra om en elueringstopp är homogen eller heterogen och skiljer mellan en fast molekyl viktfördelning kontra dynamisk jämvikt. Det är också möjligt att analysera modifierade proteiner som glykoproteiner eller lipoproteiner, eller konjugat som lösnings medels lösliga membran proteiner. Därför är SEC-MALS ett kritiskt verktyg för proteinkemisten som måste bekräfta de biofysiska egenskaperna och lösnings beteendet hos molekyler som produceras för biologisk eller bioteknologisk forskning. Detta protokoll för SEC-MALS analyserar molekyl vikt och storlek av rena proteinmonomerer och aggregat. De data som förvärvas fungerar som en grund för ytterligare SEC-MALS analyser inklusive de av komplex, glykoproteiner och tensider-bundna membran proteiner.
Tillförlitlig analys av molekyl vikten (MW) av proteiner i lösning är avgörande för biomolekylär forskning1,2,3,4. MW analys informerar forskaren om rätt protein har producerats och om det är lämpligt för användning i ytterligare experiment5,6. Som beskrivs på webbplatserna för protein forsknings nätverk P4EU7 och Arbre-mobieu8, måste kontroll av protein kvaliteten inte bara karakterisera produktens renhet utan även dess oligomeriska tillstånd, homogenitet, identitet, kon formation, struktur, ändringar efter översättningen och andra egenskaper.
MW-mätning i icke-denaturering lösning identifierar formen av proteinet som finns i en vatten miljö, vare sig monomer eller oligomeric. Medan det för många proteiner målet är att producera monomer form, för andra en specifik infödd Oligomer är nyckeln till biologisk aktivitet9,10,11,12. Andra Oligomerer och icke-infödda aggregat är oönskade och kommer att leda till brister i strukturell bestämning av kristallografi, nukleär magnetisk resonans (NMR) eller liten vinkel röntgen spridning, samt artefakter eller felaktigheter i funktionella analyser för att kvantifiera bindning genom Isotermisk titrering calorimetri eller ytplasmon resonans2,13.
När det gäller bio terapier som monoklonala anti kroppar (mAbs), har lösningsbaserad MW-analys ett liknande syfte med kvalitets kontroll och produktkaraktärisering. Överdriven ballast och fragment är ett tecken på en instabil produkt som inte är lämplig för humant bruk. Tillsynsmyndigheter kräver noggrann karakterisering, inte bara av den terapeutiska molekylen utan även potentiella nedbrytnings medel som kan förekomma i produkten14,15,16,17.
Några av de mest utbredda metoderna för att analysera protein MW är natriumdodecylsulfat polyakrylamidelektrofores (SDS-PAGE), kapillärelektrofores (CE), Ursprunglig sida, masspektrometri (MS), storlek-uteslutningskromatografi (SEC) och analytisk och ultracentrifugering (AUC). Av dessa, SDS-PAGE, CE och MS utförs inte i det ursprungliga tillståndet och typiskt leder till dissociation av Oligomerer och aggregat, därför är inte lämpliga för att bestämma den infödda Oligomer eller kvantifiera aggregat. Även om infödda PAGE gör, teoretiskt, behålla den infödda staten, i vår erfarenhet är det svårt att optimera för många proteiner, och resultaten är inte särskilt tillförlitliga. AUC, antingen genom sedimenteringshastighet eller sedimenteringsjämvikt, är kvantitativ och kan bestämma MW från första principer, men det är ganska besvärligt, kräver mycket manuellt arbete och betydande expertis inom data tolkning, lång experiment tid och en mycket dyrt instrument.
Analytical SEC är en kvantitativ och relativt robust, enkel metod som separerar makro molekyler under flödet genom en packad kolonn. De principer och tillämpningar av SEC är väl presenterade i flera recensioner18,19,20 och i hand boken “storlek uteslutning kromatografi: principer och metoder”21. Skillnaderna i retention beror på olika mängder av tid sprids in och ut ur porerna i den Station ära fasen innan avgivande från slutet av kolonnen. Skillnaderna uppstår (nominally) från släktingen storleksanpassar och diffusions koefficienterna av molekylerna22. En kalibrerings kurva konstrueras med hjälp av en serie referens molekyler, som hänför sig till molekyl-MW av molekylen till elutionsvolymen. För proteiner är referens molekylerna i allmänhet väluppförda, klotformiga proteiner som inte interagerar med kolonnen via laddning eller hydrofoba ytrester. Elutionsvolymen mäts med en ultraviolett (UV) absorbansdetektor. Om UV-utdöpningskoefficienten är känd-ofta beräknad från sekvensen-kan den totala protein massan också kvantifieras.
I synnerhet förlitar sig analysen av MW av SEC på två viktiga antaganden om de proteiner som skall karakteriseras: 1) de delar med referens standarderna samma kon formation och specifik volym (med andra ord samma förhållande mellan diffusions egenskaper och MW) och 2) som referens standarder, interagerar de inte med kolonnen utom av Sterisk egenskaper-de inte följer Kolonnpackning av laddning eller hydrofoba interaktioner. Avvikelser från dessa antaganden upphäver kalibrerings kurvan och leder till felaktiga MW-bestämningar. Detta är fallet för naturligt oordnade proteiner som har stora Stokes radier på grund av deras omfattande ostrukturerade regioner23,24 eller icke-sfäriska/linjära oligomeriska sammansättningar10. Glykosylerade proteiner kommer i allmänhet att ha en större Stokes radie än den icke-glykosylerade formen, även när den tillagda kolhydrat massan tas i beaktande19. Tvätt medel-solubilized membran proteiner eluera annorlunda än kalibrerings proteiner eftersom deras eluering från SEC beror på den totala storleken av polypeptid-rengörings medel-lipider komplex snarare än oligomeriska staten och molar massan av proteinet25 ,26. Kolonnens kemi, pH-och saltförhållanden påverkar alla elutionsvolymer av proteiner med laddade eller hydrofoba ytrester27,28.
SEC blir mycket mer mångsidig och pålitlig för MW bestämning i kombination med flera vinklar ljus spridning (mals) och differential brytnings index (dRI) detektorer3,4,11,29, 30,31,32. En dRI-detektor bestämmer koncentrationen baserat på förändringen i lösningens brytnings index på grund av närvaron av analyten. En MALS detektor mäter andelen ljus som sprids av en analyt i flera vinklar i förhållande till den infallande laser strålen. Tillsammans kallas SEC-MALS, denna instrumentering bestämmer MW oberoende av eluering tid eftersom MW kan beräknas direkt från första principer med hjälp av ekvation 1,
1
där M är analyternas molekyl vikt, R (0) det reducerade Rayleigh-förhållandet (dvs. mängden ljus som sprids av analyten i förhållande till laserintensiteten) som bestäms av en mals-detektor och extrapoleras till vinkel noll, c vikt koncentration som bestäms av UV-eller dRI-detektorn, DN/DC den brytnings index ökning av analyten (i huvudsak skillnaden mellan brytnings index för analyten och bufferten), och K en optisk konstant som beror på system egenskaper som våglängd och lösnings medels brytnings index29.
I SEC-MALS används SEC-kolumnen endast för att separera de olika arterna i lösningen så att de går in i MALS och koncentrations detektorns celler individuellt. Den faktiska retentions tiden har ingen betydelse för analysen utom så långt som hur väl den löser protein arterna. Instrumenten kalibreras oberoende av kolonnen och förlitar sig inte på referens standarder. Därför anses SEC-MALS som en “absolut” metod för MW-bestämning från grundläggande fysikaliska ekvationer. Om provet är heterogent och inte helt separeras av kolonnen, kommer det värde som anges vid varje elutionsvolym att vara ett viktmedelvärde av molekylerna i varje elutionvolym som flödar genom flödes cellen per tids segment, cirka 75 μL.
Genom analys av den kantiga variationen av spridningen intensitet, MALS kan också bestämma storleken (rot-Mean-kvadrat radie, Rg) av makro molekyler och nanopartiklar med geometrisk radie större än ca 12,5 NM29. För mindre arter som monomer proteiner och oligomerer, kan en dynamisk ljus spridnings (DLS) modul läggas till i MALS instrumentet för att mäta hydrodynamiska radier från 0,5 nm och upp33.
Medan antingen UV eller dRI koncentrations analys kan ge värdet av c i EQ. 1, användning av dRI föredras av två skäl: 1) dri är en universell koncentrations detektor, lämplig för att analysera molekyler som socker eller polysackarider som inte innehåller en UV- kromophore34; och 2) koncentrationen svar DN/DC av nästan alla rena proteiner i vatten buffert är densamma att inom en eller två procent (0,185 ml/g)35, så det finns ingen anledning att känna till UV-utdömningskoefficienten.
Användningen av SEC-MALS i protein forskning är ganska omfattande. I särklass de vanligaste tillämpningarna är att fastställa om ett renat protein är monomer eller Oligomer och graden av oligomerisering, och bedöma aggregat3,10,11,17, 31,36,37,38. Förmågan att göra det för rengörings medel-solubilized membran proteiner som inte kan karakteriseras av traditionella medel är särskilt uppskattad, och detaljerade protokoll för detta har publicerats31,39,40 , 41 , 42 , 43. andra vanliga användnings områden är att fastställa graden av post-translationell modifiering och polydispersitet av glykoprotein, lipoproteiner och liknande konjugat4,31,44 , 45 , 46 , 47, och bildandet (eller brist därav) och absolut stökiometri (i motsats till stökiometriskt förhållande) av heterokomplex inklusive protein-protein, protein-nukleinsyra och protein-polysackokomplexen24,46, 48,49,50,51,52; bestämning av monomer-dimer equilibrium dissociationskonstant49,53,54; och utvärdering av protein kon formation55,56. Bortom proteiner, SEC-mals är ovärderlig för karakterisering av peptider57,58, brett heterogena naturliga polymerer såsom hepariner59 och kitosaner60,61, små virus62 och de flesta typer av syntetiska eller bearbetadepolymerer 63,64,65,66. En omfattande bibliografi kan hittas i litteraturen67 och online (på http://www.Wyatt.com/bibliography).
Här presenterar vi ett standard protokoll för att köra och analysera ett SEC-MALS experiment. Bovint serumalbumin (BSA) presenteras som ett exempel för separation och karakterisering av proteinmonomerer och oligomerer. BSA-protokollet bestämmer vissa systemkonstanter som fungerar som en grund för ytterligare SEC-MALS analyser, inklusive de av komplex, glykoproteiner och tensider-bundna membran proteiner.
Vi noterar att SEC-MALS kan utföras med hjälp av standard högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) eller snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) utrustning från många leverantörer. Detta protokoll beskriver användningen av ett FPLC-system som vanligt vis finns i laboratorier som producerar proteiner för forskning och utveckling (se tabell över material). Innan protokollet kördes bör FPLC-systemet, MALS-och dRI-detektorer ha installerats, tillsammans med sina respektive mjukvaru paket för kontroll, data insamling och analys per tillverkares instruktioner och eventuella erforderliga kalibreringskonstanter eller andra inställningar som anges i program varan. Ett inline-filter ska placeras mellan pumpen och injektorn med en hydrofil, 0,1 μm pormembran installerat.
Den SEC-MALS experiment har gett god separation av monomer, dimer och trimer, och kvantitativa resultat för molar massorna och Hydro dynamiska storlekar av varje topp. Detta i sin tur tydligt identifierar och karakteriserar varje art närvarande, samt kvantifiera renhet. Vanligt vis de erhållna resultaten är korrekta till inom 5%, och exakt och repeterbara till inom 1-2%3,69. Denna nivå av precision och repeterbarhet gör det möjligt att tryggt skilja mellan arter som kan vara nära i MW, så länge de skiljs åt av SEC (kan delvis överlappa inom samma topp). Fördelarna för protein kvalitets kontroll och grundläggande biofysisk karaktärisering är uppenbara.
Verifiering av frånvaron av partiklar är ganska viktigt för känsliga, repeterbara SEC-MALS mätningar. Partikel toppar visas i allmänhet som stora MALS signaler utan sällskap av jämförbara UV-eller RI-signaler. Den mobila fasen och provet bör förberedas noggrant för att eliminera sådana partiklar. Användning av HPLC-grade reagenser eller bättre, filtrering av Rörlig fas och utspädnings buffert till 0,1-0,2 μm (för tvättning av filtret för att eliminera partiklar som alltid finns på torra membran), underhåll av extra rena mobila fas flaskor och andra glas varor för SEC-MALS och utökad kolumn jämvikt under flöde (för att ta bort partiklar och aggregat som kan ha samlats när flödet stoppades eller en kolumn som inte används) rekommenderas. Provet ska filtreras till den minsta porstorlek som inte tar bort det material som är av intresse, vanligt vis inte större än 0,1 μm och, om möjligt, 0,02 μm. Om filtret snabbt träskor, kan provet centrifugeras, filtreras i etapper av fallande porstorlek, och/eller re-renas. När system konsekvent upprätthålls med hög kvalitet, fräsch och filtrerad mobil fas, är spalt chocker förhindras, proverna är rena och inte hålla sig till kolonnen, kommer mätningarna inte uppvisar de ovan nämnda partikel buller och kommer att ge högkvalitativa data.
MALS är agnostiker till typiska SEC buffertar för proteiner; många andra buffertsystem förutom PBS kan användas för att optimera separation och stabilitet, inklusive en mängd hjälp ämnen71. MALS är också agnostiker till den specifika kolumnen, som bör väljas för optimal separation och återhämtning. Den primära oro för hjälp ämnen om analys är betydande förändringar i brytnings index, vilket leder till modifiering av den specifika brytnings index ökning DN/DC, och hjälp ämnen som absorberar 280 nm när UV-analys behövs. Till exempel, arginin är en vanlig agg regering-reducerande hjälp ämne som dramatiskt kan påverka DN/DC av ett typiskt protein, även föra in den i den negativa regimen (ett protein med negativ DN/DC kan fortfarande analyseras av SEC-mals om DN/ DC bestäms empiriskt, men om DN/DC = 0 intensiteten av ljuset sprids av proteinet kommer att vara null och MW analys kommer att vara omöjligt). Ämnet för DN/DC -värden för proteiner diskuteras utförligt av Zhao et al.35 där det visas att för vanliga vattenbuffertar, den stora majoriteten av oförändrade proteiner faller inom 2-3% av normalvärdet (0,185 eller 0,186 ml/g vid = 660 nm) , även om proteiner under ~ 10 kDa är mer varierande, och det finns några arter som kan gå så högt som 0,21 mL/g.
MW-profilerna över BSA monomer och dimer toppar i de presenterade uppgifterna var både ganska homogena till inom 2% eller mindre, vilket tyder på monodisperse arter. Icke-enhetliga MW-värden över en topp kan uppstå av heterogenitet eller felaktig analys. I synnerhet kan en BSA MW-profil som är konkav (“leende”) eller konvex (“grimace”) resultera från att inte korrekt tillämpa korrigering av band breddning. För andra proteiner kan en konvex profil också uppstå från dynamisk jämvikt mellan monomerer och oligomerer, där förhållandet mellan monomer till Oligomer-och därav det uppenbara MW-värdet-beror på maximal koncentration (BSA uppvisar inte detta beteende och används ofta som ett kontroll prov för att kontrol lera korrekta band breddning parametrar). En MW-profil som skiljer sig från den som leder till den bakre kanten och inte ändras med prov koncentrationen är typisk för en fördelning av molekyl vikt arter som delvis löses av SEC. dynamisk jämvikt skiljer sig lätt från den andra källor till synes ohomogena distributioner genom att injicera olika totala mängder protein-distributionen kommer att variera med dynamisk jämvikt men inte med en fast fördelning eller felaktig band breddning korrigering.
Med tanke på de begränsningar som beskrivs ovan är SEC-MALS inte lämplig för olika uppgifter. Det lämpar sig inte för analys av råprover; proverna bör vara väl renade med standard affinitet och poler metoder. Den har inte tillräcklig noggrannhet eller upplösnings förmåga för att identifiera mutanter och varianter av ett protein eller mAb med samma eller mycket nära vikt, och kan inte användas med analyter som inte eluera från eller separat på en SEC-kolumn, men nyligen har det visats att Jon-exchang e eller omvänd fas kromatografi kan kombineras med mals för att separera och karakterisera arter som inte löses av SEC72,73,74. Om proteinkvantiteterna är kraftigt begränsade kan det hända att SEC-MALS inte är genomförbart, eftersom det vanligt vis krävs 10-200 μg3 och ännu mer kan krävas av ett FPLC-system med en innerdiameter på slangen som är större än 0,25 mm. mindre kvantiteter kan dock analyseras med UHPLC-SEC-MALS. Mycket instabila proteiner som aggregeras vid introduktion till den mobila fasen är inte lämpliga för SEC-MALS analys, men buffert optimering med off-line dynamisk ljus spridning kan övervinna detta problem75.
Trots den extra ansträngning som SEC-MALS innebär, är det ovärderligt för protein forskning och används flitigt av den akademiska och bio farmaceutiska grupper. Förutom karakterisering av monomerer, Oligomerer och aggregat som beskrivs i protokollet ovan, kan SEC-mals karakterisera modifierade proteiner såsom glykoproteiner (bestämning av MW av proteinet och glykananalys komponenter individuellt), tensiden-eller membran proteiner (bestämning av MW av proteiner och solubilizer komponenter individuellt), protein sammansättningar såsom virusliknande partiklar, protein-protein-och protein-nukleinsyrakomplex, polysackarider, protein-Polysaccharide konjugat, peptider och många andra biomakromolecules.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Tsafi Danieli (Wolfson centrum för tillämpad struktur bio logi, hebreiska universitetet) för rådgivning och samarbeten. Vi tackar också Daniel Biotech Ltd (Rehovot, Israel) för att hjälpa och etablera det analytiska FPLC-MALS system som används i denna studie.
AKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | fast protein liquid chromatograph (FPLC) |
AKTA UNICORN | GE Healthcare | FPLC control software | |
ASTRA | Wyatt Technology | MALS data acquisition and analysis software | |
Bovine serum albumine (purity >97%) | Sigma | A1900 | analyte |
DAWN or miniDAWN | Wyatt Technology | WH2 or WTREOS | multi-angle light scattering (MALS) detector |
Increase 200 10/300 | GE Healthcare | size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length | |
Optilab | Wyatt Technology | WTREX | differential refractive index (RI) detector |
Sodium chloride NaCl | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL | Millipore | SCVPU11RE | mobile phase filter |
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm | GE Healthcare | 6809-1002 | sample filter |
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter | GE Healthcare | 6809-1012 | sample filter |
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm | GE Healthcare | 6809-2012 | mobile phase filter |
WyattQELS | Wyatt Technology | WIQ | dynamic light scattering detector |