Denne protokollen beskriver kombinasjonen av størrelses ekskludering kromatografi med multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS) for absolutt karakterisering av proteiner og komplekser i løsningen. SEC-MALS bestemmer Molekylvekten og størrelsen av rene proteiner, innfødte oligomers, heterocomplexes og modifiserte proteiner som glykoproteiner.
Analytisk størrelse-utelukkelse kromatografi (SEC), vanligvis brukes for fastsettelse av Molekylvekten av proteiner og protein-protein komplekser i løsningen, er en relativ teknikk som er avhengig av eluering volumet av analytt å anslå molekylær Vekt. Når proteinet ikke er globular eller gjennomgår ikke-ideelle kolonnen interaksjoner, kalibreringen kurve basert på protein standarder er ugyldig, og Molekylvekten bestemmes fra eluering volumet er feil. Multi-vinkel lysspredning (MALS) er en absolutt teknikk som bestemmer Molekylvekten av en analytt i løsning fra grunnleggende fysiske ligninger. Kombinasjonen av SEC for separasjon med MALS for analyse utgjør en allsidig, pålitelig måte for karakteriserer løsninger av en eller flere protein arter, inkludert monomerer, innfødte oligomers eller aggregater, og heterocomplexes. Siden målingen utføres ved hvert eluering volum, kan SEC-MALS avgjøre om en tent topp er homogen eller heterogen og skille mellom en fast molekylvekt fordeling kontra dynamisk likevekt. Analyse av modifiserte proteiner som glykoproteiner eller lipoproteiner, eller konjugater som vaskemiddel-solubilized membran proteiner, er også mulig. Herav, SEC-MALS er en betenkelig verktøyet for det protein kjemiker hvem må anerkjenne Biofysiske eiendom og løsning opptreden av molekyler produsert for Biological eller bioteknologisk forskning. Denne protokollen for SEC-MALS analyserer Molekylvekten og størrelsen av ren protein monomerer og aggregater. Dataene ervervet tjene som et grunnlag for videre SEC-MALS analyser inkludert de av komplekser, glykoproteiner og overflateaktivt middel-bundet membran proteiner.
Pålitelig analyse av Molekylvekten (MW) av proteiner i løsningen er viktig for Biomolecular forskning1,2,3,4. MW analyse informerer forskeren om riktig protein er produsert og om det er egnet for bruk i videre eksperimentering5,6. Som beskrevet på nettsidene til protein forskning nettverk P4EU7 og ARBRE-Mobieu8, protein kvalitetskontroll må karakterisere ikke bare renheten av det endelige produktet, men også dens oligomer tilstand, homogenitet, identitet, konformasjon, struktur, etter oversettelse modifikasjoner og andre egenskaper.
MW-måling i ikke-denaturering løsning identifiserer form av proteinet som finnes i et vandig miljø, enten monomere eller oligomer. Mens for mange proteiner målet er å produsere monomere form, for andre en bestemt innfødt oligomer er nøkkelen til biologisk aktivitet9,10,11,12. Andre oligomers og ikke-innfødte aggregater er uønsket og vil føre til feil i strukturell bestemmelse av crystallography, kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) eller liten vinkel X-ray spredning, samt gjenstander eller unøyaktigheter i funksjonelle analyser for å kvantifisere binding av isotermiske titrering reaksjonskalorimetri eller Surface Plasmon resonans2,13.
Når det gjelder biotherapeutics som monoklonale antistoffer (mAbs), tjener løsningsbasert MW-analyse et lignende formål for kvalitetskontroll og produkt karakterisering. Overdreven aggregater og fragmenter er et tegn på et ustabilt produkt som ikke er egnet for menneskelig bruk. Reguleringsorganer krever nøye karakterisering, ikke bare av det terapeutiske molekylet, men også potensielle degradants som kan være til stede i det endelige produktet14,15,16,17.
Noen av de mest utbredte metodene for å analysere protein MW er natrium natriumdodecylsulfat sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE), kapillær elektroforese (CE), Native PAGE, Mass massespektrometri (MS), størrelses ekskludering kromatografi (SEC) og analytisk ultracentrifugation (AUC). Av disse er SDS-PAGE, CE og MS ikke utføres i den opprinnelige tilstand og typisk føre til dissosiasjon av oligomers og aggregater, derfor er ikke egnet for å bestemme de innfødte oligomer eller kvantifisere aggregater. Selv om native PAGE gjør, teoretisk, beholde den innfødte staten, i vår erfaring er det vanskelig å optimalisere for mange proteiner, og resultatene er ikke veldig pålitelig. AUC, enten ved sedimentering hastighet eller sedimentering likevekt, er kvantitativ og kan fastslå MW fra første prinsipper, men det er ganske tungvint, krever mye manuell arbeidskraft og betydelig ekspertise innen data tolkning, lang eksperiment tid og en svært kostbart instrument.
Analytical SEC er en kvantitativ og relativt robust, enkel metode som skiller makromolekyler underflyt gjennom en pakket kolonne. Prinsippene og anvendelser av SEC er godt presentert i flere anmeldelser18,19,20 og i håndboken “size utelukkelse kromatografi: prinsipper og metoder”21. Forskjellene i oppbevaring skyldes ulike mengder tid brukt spre inn og ut av porene i den stasjonære fasen før tent fra slutten av kolonnen. Forskjellene oppstår (nominelt) fra den relative størrelser og diffusjon koeffisienter av molekylene22. En kalibrerings kurve er konstruert ved hjelp av en rekke referanse molekyler, som knytter MW av molekylet til eluering volum. For proteiner er referanse molekylene generelt godt oppførte, globular proteiner som ikke samhandler med kolonnen via ladning eller hydrofobe overflate rester. Eluering volum måles med en ultrafiolett (UV) absorbansen detektor. Hvis UV utryddelse koeffisienten er kjent-ofte beregnet fra sekvensen-proteinet peak totale massen kan også være quantitated.
Spesielt er analysen av MW av SEC avhengig av to viktige forutsetninger om proteiner som skal karakteriseres: 1) de deler med referanse standardene den samme konformasjon og spesifikke volum (med andre ord, det samme forholdet mellom diffusjon egenskaper og MW) og 2) som referanse standarder, har de ikke samhandler med kolonnen unntatt ved elektrosteriske egenskaper-de ikke overholder kolonnen pakking av kostnader eller hydrofobe interaksjoner. Avvik fra disse forutsetningene opphever kalibreringskurven og fører til feilaktige MW-bestemmelser. Dette er tilfellet for egen relaterte proteiner som har store Stokes-radier på grunn av sine omfattende ustrukturert områder23,24 eller ikke-sfæriske/lineære oligomer sammenstillinger10. Glykosylert proteiner vil generelt ha en større Stokes radius enn den ikke-glykosylert form, selv når den ekstra karbohydrat massen er tatt hensyn til19. Vaskemiddel-solubilized membran proteiner eluere annerledes enn kalibrering proteiner fordi deres eluering fra SEC avhenger av den totale størrelsen på polypeptid-vaskemiddel-lipider kompleks i stedet for oligomer tilstand og molar massen av proteinet25 ,26. Kolonne kjemi, pH og salt forhold alle påvirker eluering mengder proteiner med ladet eller hydrofobe overflate rester27,28.
SEC blir mye mer allsidig og pålitelig for MW bestemmelse kombinert med multi-vinkel lysspredning (MALS) og differensial brytningsindeks (dRI) detektorer3,4,11,29, 30,31,32. En dRI-detektor bestemmer konsentrasjonen basert på endringen i løsnings brytningsindeksen på grunn av tilstedeværelsen av analytt. En MALS-detektor måler andelen av lys som er spredt av en analytt i flere vinkler i forhold til hendelses laserstrålen. I fellesskap kjent som SEC-MALS, bestemmer denne instrumentering MW uavhengig av eluering tid siden MW kan beregnes direkte fra de første prinsippene ved hjelp av ligning 1,
1
hvor M er Molekylvekten av analytt, R (0) redusert Rayleigh ratio (dvs. mengden av lys spredt av analytt i forhold til laser INTENSITET) bestemmes av MALS detektoren og ekstrapolert til vinkel null, c vekt konsentrasjon bestemmes av UV-eller dRI-detektoren, DN/DC brytningsindeks økningen av analytt (i hovedsak forskjellen mellom brytningsindeksen til analytt og bufferen), og K en optisk konstant som avhenger av Systemegenskaper som bølgelengde og løsningsmiddel brytningsindeks29.
I SEC-MALS brukes SEC-kolonnen utelukkende til å skille de ulike artene i løsningen, slik at de går inn i MALS-og konsentrasjons detektor cellene enkeltvis. Den faktiske oppbevaring tid har ingen betydning for analysen unntatt så langt som hvor godt det løser protein arter. Instrumentene kalibreres uavhengig av kolonnen og er ikke avhengig av referanse standarder. Derfor er SEC-MALS betraktet som en “absolutt” metode for MW bestemmelse fra grunnleggende fysiske ligninger. Hvis prøven er heterogen og ikke helt atskilt av kolonnen, vil verdien som oppgis ved hvert eluering volum være et vekt gjennomsnitt av molekylene i hvert eluering volum som renner gjennom strømningscellen per tids sektor, ca. 75 μL.
Ved analyse av kantete variasjon av spredning intensitet, kan MALS også bestemme størrelsen (root-Mean-kvadrat radius, Rg) av makromolekyler og nanopartikler med geometrisk radius større enn ca 12,5 NM29. For mindre arter som monomere proteiner og oligomers, en dynamisk lysspredning (DLS) modul kan legges til MALS instrumentet for å måle hydrodynamisk radier fra 0,5 NM og opp33.
Mens enten UV eller dRI konsentrasjon analyse kan gi verdien av c i EQ. 1, bruk av dRI foretrekkes av to grunner: 1) dRI er en universell konsentrasjon detektor, egnet for å analysere molekyler som sukker eller polysakkarider som ikke inneholder en UV kromoforen34; og 2) konsentrasjons responsen DN/DC av nesten alle rene proteiner i vandig buffer er den samme til innenfor en eller to prosent (0,185 ml/g)35, så det er ikke nødvendig å vite UV utryddelse koeffisient.
Bruken av SEC-MALS i protein forskning er ganske omfattende. Den desidert vanligste bruksområdene er å fastsette om et renset protein er monomere eller oligomer og graden av oligomerisering, og vurdering av aggregat3,10,11,17, 31,36,37,38. Muligheten til å gjøre dette for vaskemiddel-solubilized membran proteiner som ikke kan karakteriseres av tradisjonelle midler er spesielt ettertraktet, og detaljerte protokoller for dette har blitt utgitt31,39,40 , 41 for alle , 42 for alle , 43. andre vanlige anvendelser inkluderer å etablere graden av post-translational modifikasjon og polydispersitet av glykoprotein, lipoproteiner og liknende konjugater4,31,44 , 45 for alle , 46 for alle , for 47; dannelsen (eller mangelen på dem) og absolutt støkiometri (i motsetning til støkiometriske ratio) av heterocomplexes inkludert protein-protein, protein-nukleinsyre syre og protein-polysakkarid komplekser24,46, 48,49,50,51,52; bestemme monomer-dimer likevekt dissosiasjon konstant49,53,54; og evaluere protein konformasjon55,56. Utover proteiner, SEC-MALS er uvurderlig for karakterisering av peptider57,58, bredt heterogene naturlige polymerer som heparins59 og chitosans60,61, små virus62 og de fleste typer syntetiske eller bearbeidede polymerer63,64,65,66. En omfattende bibliografi kan finnes i litteraturen67 og online (på http://www.Wyatt.com/bibliography).
Her presenterer vi en standard protokoll for å kjøre og analysere et SEC-MALS eksperiment. Storfe serum albumin (BSA) er presentert som et eksempel for separasjon og karakterisering av protein monomerer og oligomers. BSA-protokollen bestemmer visse system konstanter som fungerer som et fundament for videre SEC-MALS-analyser, inkludert de av komplekser, glykoproteiner-og overflateaktive membran proteiner.
Vi registrerer at SEC-MALS kan utføres ved hjelp av standard høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) eller rask protein flytende kromatografi (FPLC) utstyr fra mange leverandører. Denne protokollen beskriver bruken av et FPLC-system som vanligvis finnes i laboratorier som produserer proteiner for forskning og utvikling (se tabell over materialer). Før du kjører protokollen, bør FPLC system, MALS og dRI detektorer er installert, sammen med deres respektive programvarepakker for kontroll, datainnsamling og analyse per produsentens instruksjoner og eventuelle nødvendige kalibrering konstanter eller andre innstillinger som er angitt i programvaren. Et inline filter bør plasseres mellom pumpen og injeksjons anlegget med en hydrofile, 0,1 μm pore membran installert.
SEC-MALS eksperimentet har gitt god separasjon av monomer, dimer og trimer, og kvantitative resultater for molar massene og hydrodynamisk størrelser av hver topp. Dette i sin tur tydelig identifiserer og karakteriserer hver art til stede, samt kvantifisere renhet. Vanligvis resultatene oppnådd er nøyaktig innenfor 5%, og presis og repeterbar til innen 1-2%3,69. Dette nivået av presisjon og repeterbarhet gjør det mulig å trygt skille mellom arter som kan være nær i MW, så lenge de er adskilt av SEC (kan delvis overlappe innenfor samme høyde). Fordelene for protein kvalitetskontroll og grunnleggende Biofysiske karakterisering er åpenbare.
Verifisering av fravær av partikler er ganske viktig for følsomme, gjentatte SEC-MALS målinger. Partikkel topper vises vanligvis som store MALS-signaler som er ledsaget av sammenlignbare UV-eller RI-signaler. Den mobile fasen og prøven bør være forberedt nøye for å eliminere slike partikler. Bruk av reagenser med HPLC-kvalitet eller bedre, filtrering av mobil fase og fortynnings buffer til 0,1-0,2 μm (forhånds vask av filteret for å eliminere partikler som alltid finnes på tørre membraner), vedlikehold av ekstra rene, mobile fase flasker og andre Glassvarer for SEC-MALS og utvidet kolonne likevekts underflyt (for å fjerne partikler og aggregater som kan ha akkumulert når flyten ble stoppet eller en kolonne som ikke er i bruk) er alle anbefalt. Prøven bør filtreres til minste pore størrelse som ikke fjerner materialet av interesse, vanligvis ikke større enn 0,1 μm og, om mulig, 0,02 μm. Hvis filteret raskt tresko, kan prøven være sentrifugert, filtrert i stadier av synkende pore størrelse, og/eller re-renset. Når systemene er konsekvent opprettholdes med høy kvalitet, frisk og filtrert mobile fase, kolonne sjokk er forhindret, prøvene er rene og ikke holder seg til kolonnen, vil målingene ikke viser de nevnte partikkel støy og vil gi data med høy kvalitet.
MALS er likegyldig til typiske SEC buffere for proteiner; mange andre buffer systemer foruten PBS kan brukes til å optimalisere separasjon og stabilitet, inkludert en rekke hjelpestoffer71. MALS er også likegyldig til den spesifikke kolonnen, som bør velges for optimal separasjon og utvinning. De primære bekymringene for hjelpestoffer vedrørende analyse er vesentlige endringer i brytningsindeks, noe som fører til endring av den spesifikke brytningsindeks økningen DN/DC, og hjelpestoffer som absorberer 280 NM når UV-analyse er nødvendig. For eksempel, arginine er en felles aggregering-reduserende hjelpestoff som kan dramatisk påvirke DN/DC av et typisk protein, selv bringe det inn i det negative regimet (et protein med negativ DN/DC kan fortsatt bli ANALYSERT av SEC-MALS Hvis DN/ DC bestemmes empirisk, men hvis DN/DC = 0 intensiteten av lyset spredt av proteinet vil være null og MW analyse vil være umulig). Temaet DN/DC verdier for proteiner drøftes mye av Zhao et al.35 hvor det er vist at for standard vandige buffere, de aller fleste uendrede proteiner faller innenfor 2-3% av standardverdien (0,185 eller 0,186 ml/g ved = 660 NM) , selv om proteiner under ~ 10 kDa er mer variable, og det er noen få arter som kan gå så høyt som 0,21 mL/g.
MW-profilene på tvers av BSA-monomer og dimer topper i dataene som ble presentert var begge ganske homogene innen 2% eller mindre, noe som indikerer monodisperse arter. Ikke-ensartede MW-verdier over en topp kan oppstå som følge av heterogenitet eller uriktig analyse. Spesielt kan en BSA MW-profil som er konkav (‘ smile ‘) eller konveks (‘ grimase ‘) skyldes at den ikke er korrekt brukt til å utvide korreksjon av bånd. For andre proteiner, kan en konveks profil også oppstå fra dynamisk likevekt mellom monomerer og oligomers, hvor forholdet mellom monomer til oligomer-og dermed den tilsynelatende MW verdi-avhengig av toppkonsentrasjon (BSA viser ikke dette problemet og brukes ofte som en kontroll prøve for å verifisere riktige bånd utvide parametere). En MW-profil som varierer fra ledende til den etterfølgende kanten og ikke endres med prøve konsentrasjon er typisk for en fordeling av molekylvekt arter som er delvis løst av SEC. dynamisk likevekt skilles lett fra de andre kilder til tilsynelatende inhomogen distribusjoner ved å injisere forskjellige totale mengder protein-fordelingen vil variere med dynamisk likevekt, men ikke med en fast distribusjon eller feil band-utvide korreksjon.
Gitt begrensningene beskrevet ovenfor, SEC-MALS er ikke egnet for ulike oppgaver. Det er ikke egnet for analyse av råolje prøver; prøvene bør være godt renset ved standard affinitet og polering metoder. Det har ikke tilstrekkelig nøyaktighet eller løse makt til å identifisere mutanter og varianter av et protein eller mAb med samme eller svært nær masse, og kan ikke brukes med analytter som ikke eluere fra eller atskilt på en SEC kolonne, men nylig har det vært vist at ion-Exchang e eller Reverse-fase kromatografi kan kombineres med MALS for å skille og karakterisere arter som ikke er løst ved SEC72,73,74. Hvor protein mengdene er sterkt begrenset, kan SEC-MALS ikke være gjennomførbart siden det vanligvis krever 10-200 μg3 og enda mer kan kreves av et FPLC system med rør indre diameter større enn 0,25 mm; mindre mengder kan imidlertid analyseres av UHPLC-SEC-MALS. Svært ustabile proteiner som samlet ved introduksjon til den mobile fasen er ikke egnet for SEC-MALS analyse, selv om buffer optimalisering med off-line dynamisk lysspredning kan overvinne dette problemet75.
Til tross for den ekstra innsats som SEC-MALS innebærer, er det uvurderlig for protein forskning og brukes mye av akademiske og biofarmasøytisk samfunn. I tillegg til karakterisering av monomerer, oligomers og aggregater som beskrevet i protokollen ovenfor, kan SEC-MALS karakterisere modifiserte proteiner som glykoproteiner (bestemme MW av proteinet og glycan komponenter enkeltvis), overflateaktivt middel-eller lipid-solubilized membran proteiner (bestemme MW av protein og solubilizer komponenter enkeltvis), protein forsamlinger som virus-lignende partikler, protein-protein og protein-nukleinsyre acid komplekser, polysakkarider, protein-polysakkarid konjugater, peptider og mange andre biomacromolecules.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Tsafi Danieli (Wolfson Centre for Applied strukturelle biologi, hebraisk University) for råd og samarbeid. Vi takker også Daniel Biotech Ltd (Rehovot, Israel) for assistanse og etablering av den analytiske FPLC-MALS systemet benyttes i denne studien.
AKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | fast protein liquid chromatograph (FPLC) |
AKTA UNICORN | GE Healthcare | FPLC control software | |
ASTRA | Wyatt Technology | MALS data acquisition and analysis software | |
Bovine serum albumine (purity >97%) | Sigma | A1900 | analyte |
DAWN or miniDAWN | Wyatt Technology | WH2 or WTREOS | multi-angle light scattering (MALS) detector |
Increase 200 10/300 | GE Healthcare | size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length | |
Optilab | Wyatt Technology | WTREX | differential refractive index (RI) detector |
Sodium chloride NaCl | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL | Millipore | SCVPU11RE | mobile phase filter |
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm | GE Healthcare | 6809-1002 | sample filter |
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter | GE Healthcare | 6809-1012 | sample filter |
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm | GE Healthcare | 6809-2012 | mobile phase filter |
WyattQELS | Wyatt Technology | WIQ | dynamic light scattering detector |