Denne protokol beskriver kombinationen af størrelses udelukkelse kromatografi med multi-vinkel lys spredning (SEC-MALS) for absolut karakterisering af proteiner og komplekser i opløsning. SEC-MALS bestemmer molekylvægten og størrelsen af rene proteiner, indfødte oligomerer, heterokomplekser og modificerede proteiner såsom glycoproteiner.
Analytisk størrelse-udelukkelses kromatografi (SEC), der almindeligvis anvendes til bestemmelse af molekylvægten af proteiner og protein-protein komplekser i opløsning, er en relativ teknik, der er afhængig af analyteens elueringsvolumen for at estimere Molekylær Vægt. Når proteinet ikke er kugleformet eller undergår ikke-ideelle kolonne interaktioner, er kalibreringskurven baseret på protein standarder ugyldig, og molekylvægten bestemt fra elueringvolumen er ukorrekt. Multi-vinkel lys spredning (MALS) er en absolut teknik, der bestemmer molekylvægten af en analysand i opløsning fra grundlæggende fysiske ligninger. Kombinationen af SEC for separation med MALS til analyse udgør et alsidigt, pålideligt middel til karakterisering af opløsninger af en eller flere protein arter, herunder monomerer, indfødte oligomerer eller aggregater, og heterokomplekser. Da målingen foretages ved hvert elutions volumen, kan SEC-MALS bestemme, om en eluering peak er homogen eller heterogen og skelne mellem en fast molekylvægt fordeling kontra dynamisk ligevægt. Det er også muligt at analysere modificerede proteiner såsom glycoproteiner eller lipoproteiner eller konjugater såsom opløsningsmidler, der er opløselig for opvaskemiddel. Derfor er SEC-MALS et vigtigt værktøj for protein kemikeren, der skal bekræfte de biofysiske egenskaber og opløsningens opførsel af molekyler, der produceres til biologisk eller bioteknologisk forskning. Denne protokol for SEC-MALS analyserer molekylvægten og størrelsen af rene protein monomerer og aggregater. De indsamlede data tjener som grundlag for yderligere SEC-MALS analyser, herunder for komplekser, glycoproteiner og overfladeaktive membran proteiner.
Pålidelig analyse af molekylvægten (MW) af proteiner i opløsning er afgørende for Biomolekylær forskning1,2,3,4. MW analyse informerer videnskabsmanden, hvis det korrekte protein er blevet produceret, og hvis det er egnet til brug i yderligere forsøg5,6. Som beskrevet på webstederne for protein forskningsnet P4EU7 og Arbre-mobieu8skal protein kvalitetskontrollen ikke blot karakterisere det færdige produkts renhed, men også dets oligomerisk tilstand, homogenitet, identitet, kropsbygning, struktur, ændringer efter oversættelse og andre egenskaber.
MW-måling i ikke-Denaturerings opløsning identificerer den form af proteinet, der er til stede i et vandigt miljø, hvad enten det drejer sig om monomerisk eller oligomerisk. Mens det for mange proteiner er målet at producere den monomerisk form, for andre en specifik indfødte oligomer er nøglen til biologisk aktivitet9,10,11,12. Andre oligomerer og ikke-indfødte aggregater er uønskede og vil føre til mangler i strukturel bestemmelse ved krystallografi, nuklear magnetisk resonans (NMR) eller lille-vinkel X-ray spredning, samt artefakter eller unøjagtigheder i funktionelle analyser til kvantificere binding ved isotermisk titrering Calorimetri eller overflade Plasmon resonans2,13.
I tilfælde af bioterapeutiske midler, såsom monoklonale antistoffer (mAbs), tjener den løsnings baserede MW-analyse et lignende formål med kvalitetskontrollen og produkt karakteriseringen. Overdreven aggregater og fragmenter er tegn på et ustabilt produkt, der ikke er egnet til human brug. Regulerende organer kræver omhyggelig karakterisering, ikke kun af det terapeutiske molekyle, men også potentielle nedbrydningsstoffer, der kan være til stede i det endelige produkt14,15,16,17.
Nogle af de mest udbredte metoder til analyse af protein MW er natriumdodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side), kapillar elektroforese (CE), indfødt side, massespektrometri (MS), size-udelukkelses kromatografi (SEC) og analytisk ultracentrifugering (AUC). Af disse er SDS-Page, CE og MS ikke udført i den oprindelige tilstand og typisk føre til afkobling af oligomerer og aggregater, derfor er ikke egnet til bestemmelse af den indfødte oligomer eller kvantificerer aggregater. Selv om Native PAGE gør, teoretisk, bevare den indfødte tilstand, i vores erfaring er det vanskeligt at optimere for mange proteiner, og resultaterne er ikke meget pålidelige. AUC, enten ved bundfældning hastighed eller bundfældning ligevægt, er kvantitativ og kan bestemme MW fra de første principper, men det er ganske besværligt, kræver meget manuel arbejdskraft og betydelig ekspertise i data fortolkning, lang eksperimentets tid og en meget dyrt instrument.
Analytisk SEC er en kvantitativ og relativt robust, enkel metode, der adskiller makromolekyler under strømning gennem en pakket kolonne. De principper og anvendelser af SEC er godt præsenteret i flere anmeldelser18,19,20 og i håndbogen “Size udelukkelse kromatografi: principper og metoder”21. Forskellene i fastholdelse skyldes forskellige mængder af tid brugt sprede ind og ud af porerne i den stationære fase, før eluere fra slutningen af søjlen. Forskellene opstår (nominelt) fra de relative størrelser og diffusions koefficienter af molekylerne22. En kalibreringskurve er konstrueret ved hjælp af en række reference molekyler, der relaterer MW af molekylet til eluering volumen. For proteiner er reference molekyler generelt velopførte, kugleformede proteiner, der ikke interagerer med kolonnen via ladning eller hydrofobe overflade rester. Elutions volumenet måles med en ultraviolet (UV) absorbans detektor. Hvis UV-ekstinktionskoefficienten er kendt-ofte beregnet ud fra sekvensen-kan den samlede totale masse af proteiner også kvantiteres.
Især er analysen af MW i SEC baseret på to hoved antagelser vedrørende de proteiner, der skal karakteriseres: 1) de deler med referencestandarderne samme kropsbygning og specifikke volumen (med andre ord det samme forhold mellem diffusions egenskaber og MW) og 2) som referencestandarder, de ikke interagerer med kolonnen undtagen ved sterisk egenskaber-de ikke overholder kolonne pakning ved opladning eller hydrofobe interaktioner. Afvigelser fra disse antagelser gør kalibreringskurven ugyldig og fører til fejlagtige MW-bestemmelser. Dette er tilfældet for egenuordnede proteiner, der har store Stokes radier på grund af deres omfattende ustrukturerede regioner23,24 eller ikke-sfæriske/lineære oligomere samlinger10. Glykosylerede proteiner vil generelt have en større Stokes radius end den ikke-glykosylerede form, selv når den tilføjede kulhydrat masse tages i betragtning19. Vaskemiddel opløselig membran proteiner eluerer anderledes end kalibrerings proteiner, fordi deres eluering fra SEC afhænger af den samlede størrelse af polypeptid-vaskemiddel-lipider kompleks snarere end oligomerisk tilstand og Molar masse af proteinet25 ,26. Kolonne kemi, ph-og salt forhold alle påvirker eluering mængder af proteiner med ladede eller hydrofobe overflade rester27,28.
SEC bliver meget mere alsidig og pålidelig til MW-bestemmelse, når den kombineres med lysspredning (Mals) og differentiale brydningsindeks (dRI)-detektorer3,4,11,29, 30,31,32. En dRI-detektor bestemmer koncentrationen baseret på ændringen i opløsningens brydningsindeks på grund af tilstedeværelsen af analysand. En MALS-detektor måler andelen af lys, der spredes af en analysand, i flere vinkler i forhold til hændelses laserstrålen. Kollektivt kendt som SEC-Mals, denne instrumentering bestemmer MW uafhængigt af eluering tid, da MW kan beregnes direkte fra de første principper ved hjælp af ligning 1,
1
hvor M er analysmens molekylvægt, R (0) den reducerede Rayleigh ratio (dvs. mængden af lys spredt af analysand i forhold til laser INTENSITETEN) bestemt af Mals-detektoren og ekstrapoleret til vinkel nul, c vægt koncentration, der bestemmes af UV-eller dRI-detektoren, DN/DC den refraktive indeks tilvækst af analysanden (hovedsagelig forskellen mellem det refraktive indeks for analysand og bufferen) og K en optisk konstant, der afhænger af Systemegenskaber såsom bølgelængde og opløsningsmiddel brydningsindeks29.
I SEC-MALS bruges SEC-kolonnen udelukkende til at adskille de forskellige arter i opløsningen, så de kommer ind i MALS-og koncentrations detektor cellerne enkeltvis. Den faktiske retentionstid har ingen betydning for analysen, undtagen for så vidt angår, hvor godt den løser protein arterne. Instrumenterne er kalibreret uafhængigt af kolonnen og er ikke baseret på referencestandarder. SEC-MALS betragtes derfor som en “absolut” metode til bestemmelse af MW fra grundlæggende fysiske ligninger. Hvis prøven er heterogen og ikke helt adskilt af kolonnen, vil den værdi, der gives ved hvert elueringsvolumen, være en vægt gennemsnit af molekylerne i hvert elueringsvolumen, der strømmer gennem flowcellen pr. tids skive, ca. 75 μL.
Ved analyse af den vinkelvariation af spredning intensitet, kan MALS også bestemme størrelsen (root-middel-kvadrat radius, Rg) af makromolekyler og nanopartikler med geometrisk radius større end omkring 12,5 nm29. For mindre arter såsom monomere proteiner og oligomerer kan et dynamisk lyssprednings modul (DLS) tilsættes til MALS-instrumentet for at måle hydrodynamiske radier fra 0,5 nm og op33.
Mens enten UV eller dRI koncentrations analyse kan give værdien af c i EQ. 1, brug af dRI foretrækkes af to grunde: 1) DRI er en universel koncentrations detektor, velegnet til analyse af molekyler såsom sukker eller polysaccharider, der ikke indeholder en UV kromoforen34; og 2) koncentrationen respons DN/DC af næsten alle rene proteiner i vandig buffer er den samme til inden for en eller to procent (0,185 ml/g)35, så der er ingen grund til at kende UV-ekstinktionskoefficienten.
Brugen af SEC-MALS i proteinforskning er ganske omfattende. Langt de mest almindelige anvendelser er at fastslå, om et renset protein er monomere eller oligomere og graden af oligomerisering, og vurdere aggregater3,10,11,17, 31af36,37,38. Evnen til at gøre det for vaskemiddel-solubilized membran proteiner, der ikke kan karakteriseres ved traditionelle midler er især værdsat, og detaljerede protokoller for dette er blevet offentliggjort31,39,40 , 41 af , 42 af , 43. andre almindelige anvendelser omfatter fastsættelse af graden af post-translationel modifikation og polydispersitet af glycoprotein, lipoproteiner og lignende konjugater4,31,44 , 45 af , 46 af , 47; dannelsen (eller mangel på samme) og absolutte støkiometri (i modsætning til støkiometrisk ratio) af heterokomplekser, herunder protein-protein, Protein-nukleinsyre og protein-polysaccharid komplekser24,46, 48,49,50,51,52; bestemmelse af monomer-dimer ligevægts dissociations konstanten49,53,54; og evaluering af protein konformation55,56. Ud over proteiner er SEC-Mals uvurderlig for karakterisering af peptider57,58, stort set heterogene naturlige polymerer såsom hepariner59 og chitosans60,61, små vira62 og de fleste typer af syntetiske eller forarbejdedepolymerer 63,64,65,66. En omfattende bibliografi kan findes i litteraturen67 og online (på http://www.Wyatt.com/bibliography).
Her præsenterer vi en standardprotokol til at køre og analysere et SEC-MALS eksperiment. Bovint serumalbumin (BSA) er præsenteret som et eksempel for separation og karakterisering af protein monomerer og oligomerer. BSA-protokollen bestemmer visse system konstanter, der tjener som grundlag for yderligere SEC-MALS analyser, herunder af komplekser, glycoproteiner og overfladeaktive membran proteiner.
Vi bemærker, at SEC-MALS kan udføres ved hjælp af standard højtydende væskekromatografi (HPLC) eller hurtig protein væskekromatografi (FPLC) udstyr fra mange leverandører. Denne protokol beskriver brugen af et FPLC-system, der almindeligvis findes i laboratorier, der producerer proteiner til forskning og udvikling (Se tabel over materialer). Før protokollen køres, skal FPLC-systemet, MALS og dRI-detektorer være installeret sammen med deres respektive softwarepakker til kontrol, dataopsamling og-analyse pr. fabrikanters instruktioner og eventuelle påkrævede kalibrerings konstanter. eller andre indstillinger, der er indtastet i softwaren. Der skal anbringes et indbygget filter mellem pumpen og injektoren med en hydrofilt, 0,1 μm pore membran installeret.
Eksperimentet SEC-MALS har givet god adskillelse af monomer, dimer og trimer og kvantitative resultater for de molære masser og hydrodynamiske størrelser for hver top. Dette til gengæld klart identificerer og kendetegner hver art til stede, samt kvantificering renhed. Normalt er de opnåede resultater nøjagtige til inden for 5%, og præcis og gentagelig til inden for 1-2%3,69. Dette niveau af præcision og repeterbarhed gør det muligt trygt at skelne mellem arter, der kan være tæt på MW, så længe de er adskilt af SEC (kan delvis overlappe inden for samme højdepunkt). Fordelene for protein kvalitetskontrol og grundlæggende biofysiske karakterisering er synlige.
Verifikation af fravær af partikler er ganske vigtigt for følsomme, gentagelige SEC-MALS målinger. Partikel toppe vises generelt som store MALS-signaler, der ikke er ledsaget af sammenlignelige UV-eller RI-signaler. Den mobile fase og prøve skal forberedes omhyggeligt for at eliminere sådanne partikler. Anvendelse af reagenser af HPLC-kvalitet eller bedre, filtrering af mobil fase og fortyndings buffer til 0,1-0,2 μm (forvask af filteret for at eliminere partikler, der altid er til stede på tørre membraner), vedligeholdelse af ekstra rene mobile fase flasker og andet glas til SEC-MALS og udvidet kolonne ligevægt under flow (for at fjerne partikler og aggregater, der kan have akkumuleret, når strømmen blev stoppet eller en kolonne ikke er i brug) er alle anbefales. Prøven filtreres til den mindste porestørrelse, der ikke fjerner det pågældende materiale, sædvanligvis ikke større end 0,1 μm og om muligt 0,02 μm. Hvis filteret hurtigt træger, kan prøven centrifugeres, filtreres i etaper af faldende porestørrelse og/eller genrenses. Når systemerne konsekvent vedligeholdes med frisk og filtreret Mobil fase af høj kvalitet, forhindres kolonne chok, prøverne er rene og ikke overholder kolonnen, målingerne vil ikke udvise den førnævnte partikel støj og vil give data af høj kvalitet.
MALS er agnostisk til typiske SEC-buffere for proteiner. mange andre buffer systemer udover PBS kan bruges til at optimere separation og stabilitet, herunder en række hjælpestoffer71. MALS er også agnostisk til den specifikke kolonne, som skal vælges for optimal separation og nyttiggørelse. De primære betænkeligheder for hjælpestoffer med hensyn til analyse er væsentlige ændringer i brydningsindekset, hvilket fører til modifikation af det specifikke brydningsindeks tilvækst DN/DC, og hjælpestoffer, der absorberer 280 Nm, når UV-analyse er nødvendig. For eksempel, arginin er en fælles aggregering-reducerende hjælpestoffer, der kan dramatisk påvirke DN/DC af et typisk protein, selv bringe det ind i den negative regime (et protein med negativ DN/DC kan stadig ANALYSERES af SEC-Mals hvis DN/ DC bestemmes empirisk, men hvis DN/DC = 0 intensiteten af lys spredt af proteinet vil være null og MW analyse vil være umulig). Emnet DN/DC værdier for proteiner diskuteres i udstrakt grad af Zhao et al.35 , hvor det er påvist, at for almindelige vandige buffere falder langt størstedelen af uændrede proteiner inden for 2-3% af standardværdien (0,185 eller 0,186 ml/g ved = 660 nm) , selvom proteiner under ~ 10 kDa er mere variable, og der er et par arter, der kan gå så højt som 0,21 mL/g.
MW-profilerne på tværs af BSA monomer og dimer toppe i de fremlagte data var begge helt homogene til inden for 2% eller derunder, hvilket indikerer mono Disperse arter. Ikke-ensartede MW-værdier over et højdepunkt kan opstå som følge af heterogenitet eller ukorrekt analyse. Navnlig kan en BSA MW-profil, der er konkave (“smil”) eller konvekse (“grimasse”), skyldes, at den ikke har anvendt den udvidede korrektion korrekt. For andre proteiner kan en konvekse profil også opstå som følge af dynamisk ligevægt mellem monomerer og oligomerer, hvor forholdet mellem monomer og oligomer-og dermed den tilsyneladende MW-værdi-afhænger af peak-koncentrationen (BSA udviser ikke denne adfærd og bruges ofte kontrolprøve for at verificere korrekte bånd udvidelse parametre). En MW-profil, der varierer fra den førende til den bageste kant og ikke ændres med prøvekoncentration er typisk for en fordeling af molekylvægt arter, der er delvist løst ved SEC. dynamisk ligevægt adskiller sig let fra de andre kilder til tilsyneladende uhomogene fordelinger ved at injicere forskellige samlede mængder af protein-fordelingen vil variere med dynamisk ligevægt, men ikke med en fast fordeling eller ukorrekt bånd-udvidelse korrektion.
I betragtning af de begrænsninger, der er beskrevet ovenfor, er SEC-MALS ikke velegnet til forskellige opgaver. Den egner sig ikke til analyse af råprøver; prøverne skal være godt renset ved standard affinitet og polerings metoder. Det har ikke tilstrækkelig nøjagtighed eller opløsningskraft til at identificere mutanter og varianter af et protein eller mAb med samme eller meget tæt masse, og kan ikke anvendes med analysander, der ikke eluere fra eller adskilles på en SEC-kolonne, men for nylig har det vist sig, at ion-exchang e eller reverse-fase kromatografi kan kombineres med decimaler for at adskille og karakterisere arter, der ikke er løst ved SEC72,73,74. Hvis protein mængderne er stærkt begrænset, er SEC-MALS muligvis ikke gennemførlig, da det typisk kræver 10-200 μg3 , og der kan kræves endnu flere af et fplc-system med en indvendig diameter på mere end 0,25 mm. mindre mængder kan dog analyseres af UHPLC-SEC-MALS. Meget ustabile proteiner, der aggregeres ved Introduktion til den mobile fase er ikke egnet til SEC-MALS analyse, selvom buffer optimering ved hjælp off-line dynamisk lys spredning kan overvinde dette problem75.
På trods af den ekstra indsats, SEC-MALS indebærer, er det uvurderligt for proteinforskning og anvendes i udstrakt grad af de akademiske og biofarmaceutiske samfund. Ud over karakterisering af monomerer, oligomerer og aggregater som beskrevet i ovenstående protokol kan SEC-Mals karakterisere modificerede proteiner såsom glycoproteiner (bestemmelse af MW af proteinet og tykkere komponenterne enkeltvis), overfladeaktivt stof-eller lipid-solubiliserede membran proteiner (bestemmelse af MW af protein og opløseligheds komponenter), protein samlinger såsom viruslignende partikler, protein-protein og protein-nukleinsyre komplekser, polysaccharider, protein-polysaccharid konjugater, peptider og mange andre biomakromolekyler.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Tsafi Danieli (Wolfson centre for Applied structural Biology, hebraisk University) for rådgivning og samarbejde. Vi takker også Daniel Biotech Ltd. (Rehovot, Israel) for bistand og etablering af analytiske FPLC-MALS system udnyttet i denne undersøgelse.
AKTA pure | GE Healthcare | 29-0182-26 | fast protein liquid chromatograph (FPLC) |
AKTA UNICORN | GE Healthcare | FPLC control software | |
ASTRA | Wyatt Technology | MALS data acquisition and analysis software | |
Bovine serum albumine (purity >97%) | Sigma | A1900 | analyte |
DAWN or miniDAWN | Wyatt Technology | WH2 or WTREOS | multi-angle light scattering (MALS) detector |
Increase 200 10/300 | GE Healthcare | size exclusion column, 200 Å pores, 10 mm i.d., 300 mm length | |
Optilab | Wyatt Technology | WTREX | differential refractive index (RI) detector |
Sodium chloride NaCl | Sigma | 71382 | HPLC grade NaCl |
Stericup bottle top filter polyether sulfone 0.1 µm 1000 mL | Millipore | SCVPU11RE | mobile phase filter |
Whatman Anotop 10 syringe filter 0.02 µm | GE Healthcare | 6809-1002 | sample filter |
Whatman Anotop 10 syringe-tip filter, 0.1 µm pore, 10 mm diameter | GE Healthcare | 6809-1012 | sample filter |
Whatman Anotop 25 syringe filter 0.1 µm | GE Healthcare | 6809-2012 | mobile phase filter |
WyattQELS | Wyatt Technology | WIQ | dynamic light scattering detector |