En protokol til fremstilling af Graphene-understøttede strips med mikrobrønde Liquid-celler til in situ -elektronmikroskopi af guld nanokrystaller fra haucl4 forløber opløsning præsenteres. Desuden præsenteres en analyse rutine for at kvantificere observeret ætsning og vækstdynamik.
Fabrikation og fremstilling af Graphene-understøttede strips med mikrobrønde Liquid-celler (gsmlcs) til in situ -elektronmikroskopi præsenteres i en trinvis protokol. Alsidigheden af GSMLCs er demonstreret i forbindelse med en undersøgelse om ætsning og vækstdynamik af guld nanostrukturer fra en HAuCl4 forløber løsning. GSMLCs kombinerer fordelene ved konventionelle silicium-og Graphene-baserede flydende celler ved at tilbyde reproducerbare brønd dybder sammen med facile celle fremstilling og håndtering af den undersøgte prøve. GSMLCs er fremstillet på et enkelt silicium substrat, som drastisk reducerer kompleksiteten af fremstillingsprocessen i forhold til to-wafer-baserede flydende celle design. Her kræves der ingen bindings-eller justeringsproces trin. Desuden kan den vedlagte væskevolumen skræddersys til de respektive eksperimentelle krav ved blot at justere tykkelsen af et silicium nitrid lag. Dette muliggør en signifikant reduktion af vindues udbuling i elektronmikroskop vakuum. Endelig præsenteres en state-of-the-art kvantitativ evaluering af enkelt partikel sporing og dendrit dannelse i flydende celle eksperimenter ved hjælp af kun open source software.
Moderne materialer videnskab, kemi og cellebiologi kræver en dyb forståelse af underliggende dynamiske processer og effekter på sub-micron skala. På trods af kraften i avancerede optiske mikroskopi teknikker såsom stimuleret-emission-udtømning Fluorescens mikroskopi1, Direct Imaging teknikker til at få adgang til detaljerede morfologier kræver elektronmikroskopi. Især in situ (scanning) transmission Electron mikroskopi (S) tem har vist sig at belyse værdifuld indsigt i proces dynamik ved indkapsning af væsker i dedikerede, vakuumtætte celler2. Forskellige eksperimenter såsom kvantitative undersøgelser af nanostrukturdannelses kinetik og termodynamik3,4,5,6, billeddannelse af biologiske prøver7, 8 , 9 , 10 og undersøgelser af energi lagrings relaterede mekanismer11,12 sammen med omfattende undersøgelser af korrosions proces dynamik13 eller nanoboble fysik14,15, 16 har trævlet mange fænomener ved hjælp af (S) tem, der ikke var tilgængelige ved hjælp af standard mikroskopi teknikker.
I løbet af det seneste årti er der etableret to hoved tilgange til at realisere in situ -væske celle tem (LCTEM). I den første tilgang, er væsken indkapslet i et hulrum mellem to si3N4 membraner produceret via si Process Technology17, hvorimod der i den anden, små flydende lommer dannes mellem to Graphene eller Graphene oxid ark 10,18. Håndteringen af både silicium-baserede flydende celler (silcs) og Graphene-baserede flydende celler (glcs) er blevet påvist19,20,21. Selv om begge tilgange har undergået betydelige forbedringer22,23,24,25, de stadig mangler i kombinationen af de respektive fordele. Generelt findes der en afvejning mellem indkaptningen af prøven i ofte udefineret Graphene lommer med en lille væskemængde, der muliggør billeddannelse i høj opløsning18, og veldefinerede celle volumener, som resulterer i tykkere membraner og flydende lag, som giver et miljø, der er tættere på den naturlige situation i bulk flydende26 på bekostning af resolution2. Desuden er nogle eksperimenter afhængige af en væskestrøm26,27 , som kun er blevet realiseret i SILC arkitekturer og kræver en dedikeret tem holder28.
Her præsenterer vi fremstilling og håndtering af en flydende celle tilgang til højtydende in situ lctem via statiske Graphene-støttede strips med mikrobrønde Liquid-celler (gsmlcs) til tem-analyser. En skitse af GSMLC er præsenteret i figur 1. GSMLCs har vist sig at være i stand til at muliggøre in situ høj opløsning transmission elektronmikroskopi (HRTEM) resultater6 og er også muligt for in situ scanning elektronmikroskopi29. Deres si teknologi-baserede ramme giver mulighed for masseproduktion af reproducerbart formede celler med skræddersyet væske tykkelse og ekstra tynde membraner fra en enkelt wafer. Graphene membranen, der dækker disse celler, mindsker også elektronstråle induceret perturbationer8,30,31 , da elektronstrålen passerer gennem den øverste Graphene membran først. Cellernes flade topografi giver mulighed for supplerende analysemetoder såsom energi dispersive røntgen spektroskopi (EDXS)6 uden skyggeeffekter, der opstår som følge af selve den flydende celle, hvilket muliggør en række af høj kvalitet in situ eksperimenter med flydende celle elektronmikroskopi.
I modsætning til kommercielt tilgængelige flydende celler har specialfremstillede Gsml’er den fordel, at de kan udformes, så de passer til let tilgængelige TEM-holdere og ikke kræver en dyr, dedikeret væske celle TEM-holder.
GSMLC-arkitekturen demonstrerede her kombinerer aspekter af SiLCs og GLCs, der potentielt kunne føre til unikke fordele. På den ene side giver SiLCs mulighed for en præcis bestemmelse af celle position og form, men kræver relativt tykke si3N4 membraner til at reducere udbuling effekter og i sidste ende reducere den opnåelige opløsning. GLCs, på den anden side, udviser usædvanligt tynde membran vægge bestående af Graphene, men lider af tilfældige lomme størrelser og positioner. Ved at kombinere disse to membran tilgange via GSMLCs, kan opløsningen begrænsning forårsaget af cellegrænserne35 omgået. Da brønden struktur er fabrikeret direkte i si3n4 lag, kan den faktiske si3n4 membran konstrueres endnu mindre end i silcs, forenkle hrtem analyser, som allerede er blevet påvist i gsmlcs6 . Stadig, det skal bemærkes, at HRTEM i almindelighed er muligt med SiLCs samt48. Desuden kan store synsområder realiseres uden svær vindues udbuling på grund af de små membran områder i de enkelte prøve kamre. Derved kan bulging-relateret tykkelse stigning35 udelukkes i vid udstrækning, som det fremgår af Dukes et al.49. Dette er påvist i figur 7, hvor der vises en repræsentativ højvinkel ringformet mørk felt (haadf) Stam billede af al indlæst GSMLC. Dette billede blev erhvervet ved hjælp af en Dual-Beam system. Da billedets lysstyrke opnået i denne opsætning er direkte relateret til prøve tykkelsen, er det klart synligt, at de forseglede mikrobrønde udviser kun små negative udbuling. Kelly et al.24 har vist, at den negative udbuling og delvis godt tørring synlig i figur 7 afhænger af brønd diameteren. At reducere brønd diameteren er derfor en gennemførlig metode til at homogenisere den flydende tykkelse endnu mere.
På grund af den ligevægt lomme form af GLCs, den flydende tykkelse er også stærkt site-afhængige35. SiLCs følge konstruktionen af to membraner stammer fra forskellige si wafers. Ved at udskifte toppen si3N4 membran med Graphene, er flydende celle fabrikation forenklet. Det betyder, at en eventuel delaminering af to bundne si-wafere under de efterfølgende våde ætsning kan undgås, og at tilpasningen af to wafer-stykker under celle belastningen udelades. Den flade overflade på den ene side af denne celle arkitektur muliggør komplementære in situ -analysemetoder såsom edxs-analyse af model6, som er begrænset i konventionelle SILC-arkitekturer ved skyggeeffekter ved stejle si-kanter50 .
Forsegling præmønstrede mikrobrønde med Graphene på både bunden og top brønd site er blevet påvist før24,25. Anvendelse af to Graphene membraner kan forbedre den opnåelige opløsning. En dobbelt Graphene-overførsel ville imidlertid komplicere forberedelsesprocessen yderligere; især da dette har vist sig at være den mest følsomme forberedelse trin (se nedenfor). Endvidere, de ovenfor diskuterede membran udbuling forventes at være endnu mere kritisk i tilfælde af to Graphene membraner, fordi Graphene er meget mere fleksibel end en si3N4 lag. I disse arkitekturer, blev mikrobrønde konstrueret ved hjælp af sekventiel fokuseret ionstråle (FIB) fræsning. Mens denne tilgang har vist sig at give resultater af høj kvalitet, FIB fræsning er kompliceret og dyrecelle produktionsteknik. Udnytter massivt parallelle Single-Shot mønster teknikker, der allerede er standard i nutidens halvlederindustrien, såsom nanoimprint-eller photolithography, dog har den største fordel ved at være hurtig, billig og skalerbar til masseproduktion.
Det skal bemærkes, at den fremgangsmåde, der præsenteres her, ikke giver mulighed for væskestrøm drift, som kan opnås ved andre designs28. Da lastning og væskevolumen er sammenlignelige for GSMLCs og GLCs, en forurening af høj vakuum på grund af ruptur af membranen kan undgås19. Dette eliminerer behovet for en besværlig tætnings kontrol. Selvom fordelene ved SiLCs og GLCs er blevet kombineret, er ulemperne ved begge tilgange stadig til stede i GSMLCs. Fremstillingen af cellerne kræver et rent rum infrastruktur for silicium teknologi, som ikke nødvendigvis er til stede i TEM laboratorier. Desuden er den flydende lastning ikke trivielt. Det kræver en dedikeret uddannelse, svarende til Graphene celler. Dette gælder dog også for kommercielt tilgængelige systemer. Her, den mest følsomme forberedelse trin er TEM-Grid fjernelse efter Graphene overførsel, fordi udslæt bevægelser eller nervøs er tilbøjelige til at bryde si3N4 lag. De overflødige membran Vinduer øger dog chancerne for at bevare mindst ét membran område. Som følge heraf er afkastet (mængden af betjenes gsmlc chips) opnået af en uddannet eksperimentel er tre ud af fire6, og dermed overstiger den ene opnået med Graphene-baserede celler (en til to ud af fire)19.
Som med GLCs er den flydende indkapsling i GSMLCs baseret på Van-der-Waals-interaktioner18. Derfor kan grænsefladens kontaminering sænke succesraten i behandlingen af GSMLCs19. Afhængigt af Hamaker-konstanten af den til-være-indkapslede væskefase, kan befugtning egenskaber under indlæsnings proceduren (og dermed det opnåelige udbytte) afvige51 , og derfor kan præparatet være kompliceret. Vores erfaring viser, at dette er tilfældet, hvis for eksempel, amphifilic arter er til stede.
GSMLC-arkitekturen muliggør fleksibel konfiguration af brønd dybderne, hvilket giver mulighed for tilpasning til forskellige eksperimentelle forudsætninger. Desuden er arkitekturen velegnet til elektron tomografi undersøgelser over et bredt hældningsvinkel område på ± 75 °, hvilket også giver mulighed for in situ -elektron tomografi52. Derfor kunne der også etableres in situ -og post mortem -tomografi af præparatet i væske med gsmlcs.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Tilo Schmutzler for forberedelsen af HAuCl4 -løsningen. Desuden takker vi R. Christian Martens for korrekturlæsning. Økonomisk støtte fra den tyske forskningsfond (DFG) via Forskergruppen GRK 1896 “in situ -mikroskopi med elektroner, røntgenstråler og scannings sonder” og gennem klyngen af Excellence exc 315/2 EAM “engineering af avancerede materialer” er taknemmeligt anerkendt.
Acetone | VWR Chemicals | 50488858 | VLSI |
Deionized water | own production | ||
Dumont Anti-Capillary tweezers | Carl Roth GmbH + Co. KG | LH72.1 | 0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed |
Ethanol | VWR Chemicals | 85651.360 | VLSI |
FIJI Is Just ImageJ | FIJI.sc | Version 1.51 | |
Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids | Plano GmbH | S173-8 | R 2/2 Au 300 mesh |
HAuCl4 · 3 H2O crystal | Alfa Aesar | 36400.06 | 5 g |
Jupyter Notebook | Project Jupyter | Version 5.7.2 | |
Matplotlib-Package | John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team | Version 3.0.2 | |
NumPy-Package | NumPy developers | Version 1.15.4 | |
Pandas-Package | AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team | Version 0.23.4 | |
Python | Python Software Foundation | Version 3.7 | |
Scipy-Package | SciPy developers | Version 1.1.0 | |
Seaborn-Package | Michael Waskom | Version 0.9.0 | |
Si wafer | Siegert Wafer GmbH | Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 µm, 4", p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished | |
single tilt TEM holder | Philips | Ensure that cell fits | |
Transmission Electron Microscope | Philips | CM 30 (S)TEM | 300 kV |
Trivial Transfer Graphene | ACS Material | TTG60011 | PMMA-covered, 6 — 8 MLs |